CN105483122A - 耐除草剂大豆dp-356043及其衍生品种的lamp检测引物组、lamp检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法。LAMP检测引物组包括四条特异性引物；LAMP检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；LAMP试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检样品的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检样品是否含有耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、可以现场检测等优点，适于推广应用。

Description

耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，属于转基因农作物的检测方法，具体是耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法。

背景技术

目前世界上大豆种植已遍及五十多个国家和地区，主产地主要是美国、巴西、阿根廷和中国，中国是栽培大豆的起源地。随着中国经济的发展，城市化进程加快，居民对大豆以及其副产品的消费日益增加，而且大豆广泛用于食品、医药和化学工业，但是国产大豆产量增长达不到市场需求，进口大豆的数量逐渐增加。

杜邦先锋国际良种公司研制转基因抗两种除草剂的大豆DP-356043，对草甘膦与磺酰脲类（SU）除草剂表现为双重抗性。转入GAT基因，编码对除草剂草甘膦的抗性，乙酰乳酸合成酶（ALS）基因GM-HRA，编码对磺酰脲类（SU）除草剂的抗性。DP-356043通过基因枪转化得到，插入序列为单拷贝。

我国已经批准抗除草剂大豆DP-356043作为可进口用作加工原料，为了对抗除草剂大豆DP-356043的流通进行规范管理，建立有效的抗除草剂大豆DP-356043的检测方法与体系，对转基因作物及其产品标识制度的实施和安全性评价具有十分重要的意义。

目前，转基因作物的检测方法主要有以下2类：

1）基于蛋白质的检测，现在应用最广的是酶联免疫吸附法（ELISA）以及Westernblot的检测方法，这类方法要求高质量、高特异性的抗体，否则会影响检测的准确性，检测的灵敏度较低；

2）基于DNA的检测，主要是针对转基因作物中的外源插入基因进行检测，主要有分子杂交技术、PCR检测技术和芯片检测技术，其中PCR检测方法是最主要、最准确的检测转基因作物的方法，但这类方法的反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；需要特定的PCR仪，扩增时间2～3小时，扩增结果需要进行终产物检测如电泳；电泳常用染料如EB等有较强毒性，且难以实行现场检测。定量PCR检测灵敏度高，所使用的荧光种类主要Taqman探针、SYBRGreenΙ和分子信标，随着反应进行，体系中产生的荧光信号值随之增大。其他两种方法较SYBRGreenⅠ染料法灵敏度相对较高，但是荧光定量PCR仪器成本较大。

综上所述，在生产实践中均需要一种快速、灵敏度高、操作简便、特异性强、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。

环介导等温基因扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，以下简称LAMP法）是Notomi和Okayama2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将恒温扩增目视检测技术、恒温实时荧光技术应用于快速检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒及检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：CATAACCTCATCTCGCCTT（SEQIDNo：1）；

外引物2：CAATGGAATCCGAGGAGG（SEQIDNo：2）；

内引物1：AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC（SEQIDNo：3）；

内引物2：TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC（SEQIDNo：4）。

耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

（1）引物液：含有上述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48～52μM外引物1、48～52μM外引物2，48～52μM内引物1、48～52μM内引物2；

（2）反应液：含有12mMdNTPs、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液，所述dNTPs、反应缓冲液和MgSO₄水溶液的体积比是7～9：4～6：2；

（3）DNA聚合酶：DNA聚合酶的浓度为7～9U/μl；

（4）对照：阳性对照为耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

作为本发明进一步的方案：所述引物液中含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2。

作为本发明进一步的方案：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，BstDNA聚合酶的浓度为8U/μl。

作为本发明进一步的方案：所述反应液中，12mMdNTP：10×IsothermalAmplification反应缓冲液：150mMMgSO₄水溶液的体积比为8：5：2。

作为本发明进一步的方案：还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料Calcein。

作为本发明进一步的方案：还含有荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYTO-9。

利用所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品DNA；

2）恒温检测反应：在PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；

3）结果判断：通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。

利用所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；

3）结果判断：在上述PCR管中加入1～2μl显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。

利用所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，荧光指示剂SYTO-91μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪在60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；

3）结果判断：根据是否出现S型扩增曲线判断扩增结果。

其中，CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA的方法为：

（1）取转基因大豆MON89788约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反复研磨3次；

（2）加入1.5ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液（100mMTris-HCI(pH8.0),1.4MNaCI,20mMEDTApH8.0），加入巯基乙醇20μl，上下震荡，充分混合，65℃保温30min，每隔10min颠倒混匀一次；

（3）约12000rpm离心10min，转移上清至新的离心管，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提，充分混合，4℃12000rpm离心5min，取上清至新的离心管中；

（4）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），充分混合，4℃12000rpm离心5min，取上清至新的离心管中；

（5）加入2倍体积的无水乙醇，再加入1/10体积NaAC（pH5.2）轻轻颠倒，充分混匀，-20℃冰箱静置10min；

（6）12000rpm离心5min，弃上清，加入500μl70%乙醇溶液，轻轻颠倒离心管数次，12000rpm离心2min，弃上清；

（7）重复（6）一次，

（8）充分干燥DNA沉淀，加100μlDNase/RNase-FreeDistilledWater溶解DNA。-20℃保存。

dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸的缩写,N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C等，是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP等在内的统称，在生物DNA合成中，以及各种PCR中起原料作用。

10×IsothermalAmplification反应缓冲液为10倍等温扩增的反应缓冲液。

荧光染料Calcein为荧光染料钙黄绿素。

荧光染料SYTO9是饱和荧光染料，最大激发光为483nm，最大发射光为503nm。

DNase/RNase-FreeDistilledWater为DNA酶/酶的蒸馏水。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明基于环介导等温扩增技术LAMP法，根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎－环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化，一般为90min或更少，在45～90min的短时间内扩增效率可以达到10⁹～10¹⁰个拷贝。加入模板DNA，在60～65℃反应45～90min后，在80℃保温2min，终止反应。在反应中，有核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。

本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点。具体描述如下：

（1）快速高效：整个扩增只用45～90min即可完成，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝；

（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部实时荧光检测仪就能反应和检测，条件比较温和；

（3）高特异性：本发明根据耐除草剂大豆DP-356043的特异内源基因处设计了四条特异性引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；

（4）高灵敏度：最低检测极限可达到100个拷贝；

（5）鉴定简便：可通过观察加入Calcein颜色变化、是否存在焦磷酸镁沉淀或是否出现“S”型扩增曲线来判断扩增与否，无需电泳等其它任何分析步骤，适合现场检测。

附图说明

图1是实施例1的显色检测结果图（1：阳性对照；2-5：待检样品；6：阴性对照）；

图2是实施例1的扩增检测结果图（1：阳性对照；2-5：待检样品；6：阴性对照）；

图3是实施例2的扩增检测结果图（1：阳性对照；2-5：待检样品；6：阴性对照）；

图4是实施例3的扩增检测结果图（1：阳性对照；2-7依次为：3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%、0.003%的样品DNA；8：阴性对照）；

图5是实施例4的扩增检测结果图（1-19依次为：耐除草剂大豆DP-356043、RoundupReadyGTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、DP305423、DP56423、MON89788、CV127，转基因玉米MON810，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花MON531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花，去离子水。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1含显色剂的试剂盒及检测方法

一种的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂：

（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：

外引物1：CATAACCTCATCTCGCCTT（SEQIDNo：1）；

外引物2：CAATGGAATCCGAGGAGG（SEQIDNo：2）；

内引物1：AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC（SEQIDNo：3）；

内引物2：TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC（SEQIDNo：4）。

（2）反应液：含有12mMdNTP、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液，三者的体积比是8：5：2；

（3）DNA聚合酶：BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；

（4）对照：含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；

（5）显色剂：荧光染料Calcein。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃持续2min；

3）结果判断：在上述反应管中加入2μl显色剂，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

本实施例中，阴性对照显现橙色，阳性对照显现绿色，待测样品1、2的PCR管显绿色（图1中管阳），表明待测样品1、2中含有耐除草剂大豆DP-356043，待测样品3、4的PCR管显橙色（图1中管阴），表明待测样品3、4中不含耐除草剂大豆DP-356043。

一种耐除草剂大豆DP-356043的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和荧光指示剂：

（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：

外引物1：CATAACCTCATCTCGCCTT（SEQIDNo：1）；

外引物2：CAATGGAATCCGAGGAGG（SEQIDNo：2）；

内引物1：AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC（SEQIDNo：3）；

内引物2：TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC（SEQIDNo：4）。

（2）反应液：含有12mMdNTP、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液，三者的体积比是8：5：2；

（3）DNA聚合酶：BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；

（4）对照：含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；

（5）荧光指示剂：SYTO-9。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，SYTO-91μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene9640qPCR仪上60～65℃反应45～90min，并在80℃持续2min；

3）结果判断：根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。

本实施例中，阴性对照显现“直线”扩增曲线，阳性对照显现“S”型扩增曲线，待测样品1、2的显现“S”型扩增曲线（图2中样品2，3），表明待测样品1、2中含有耐除草剂大豆DP-356043，待测样品3、4显现“直线”扩增曲线（图2中样品4，5），表明待测样品3、4中不含耐除草剂大豆DP-356043。

参照EUReferenceLaboratoryforGMFoodandFeed中的引物356043F:GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA（SEQIDNo：5），356043R:TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT（SEQIDNo：6）和探针356043Probe:FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC-TAMRA（SEQIDNo：7）进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。

实施例2不含显色剂的试剂盒及其检测方法

试剂盒中除缺少实施例1中的显色剂和荧光指示剂外，其余同实施例1。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；

2）恒温检测反应：在200ulPCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃持续2min；

3）结果判断：将反应管放置在浊度仪中按2）中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化或荧光定量PCR检验是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果：如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性；荧光定量PCR检验若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。

本实施例中，阴性对照无沉淀，阳性对照产生沉淀，待测样品1、2的PCR管出现沉淀、显现“S”型扩增曲线（图3线2、3），表明待检样品1、2中含有耐除草剂大豆DP-356043。待测样品3、4的PCR管没有出现沉淀、没有显现“S”型扩增曲线（图3线4、5），表明待检样品3、4中不含耐除草剂大豆DP-356043。

照EUReferenceLaboratoryforGMFoodandFeed中的引物356043F:GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA（SEQIDNo：5），356043R:TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT（SEQIDNo：6）和探针356043Probe:FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC-TAMRA（SEQIDNo：7）进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。

实施例3PCR反应与本发明检测方法灵敏度的比较

按下列配方制备耐除草剂大豆DP-356043的LAMP检测试剂盒：

（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：

外引物1：CATAACCTCATCTCGCCTT（SEQIDNo：1）；

外引物2：CAATGGAATCCGAGGAGG（SEQIDNo：2）；

内引物1：AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC（SEQIDNo：3）；

内引物2：TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC（SEQIDNo：4）。

（2）反应液：含有12mMdNTP、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液，三者的体积比是8：5：2；

（3）DNA聚合酶：BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；

（4）对照：阳性对照为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；

（5）显色剂：荧光染料Calcein。

用上述试剂盒按以下方法对确定为待测样品进行检测：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA，分别稀释成3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%、0.003%的样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；；将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene9640qPCR仪上63℃反应90min（1min设定为1个循环），并在80℃持续2min；

3）结果判断：将反应管放置在浊度仪中按2）中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则有扩增，无沉淀则无扩增。也可以在2）中得到产物中加入1μl显色剂，混匀，肉眼观察。无扩增反应的管子呈现橙色，有扩增反应的管子变成绿色。

按下列配方制备耐除草剂大豆DP-356043的LAMP检测试剂盒：

（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：

外引物1：CATAACCTCATCTCGCCTT（SEQIDNo：1）；

外引物2：CAATGGAATCCGAGGAGG（SEQIDNo：2）；

内引物1：AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC（SEQIDNo：3）；

内引物2：TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC（SEQIDNo：4）。

（2）反应液：含有12mMdNTP、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液，三者的体积比是8：5：2；

（3）DNA聚合酶：BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；

（4）对照：阳性对照为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；

（5）荧光指示剂：SYTO-9。

用上述试剂盒按以下方法对确定为耐除草剂大豆DP-356043的待测样品进行检测：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA，分别稀释成3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%、0.003%的样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，SYTO-91μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为3%的含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene9640qPCR仪上60～65℃反应90min（1min设定为1个循环），并在80℃持续2min；

3）结果判断：根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。

请参阅图4，本实施例中，阳性对照、3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%、0.003%均出现沉淀、“S”型扩增曲线显示为有扩增，阴性对照无沉淀、无“S”型扩增曲线，即无扩增；加入显色剂后，阳性对照、3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%、0.003%的PCR管显绿色，阴性对照管呈现橙色。

PCR反应引物采用本方法反应中的外引物1和外引物2。PCR反应为25μl体系，10×PCRBuffer（PCR反应缓冲液，Lifetechnologies）2.5μl，10mMdNTPs（Lifetechnologies）0.5μl，上、下游引物分别对应外引物1和外引物2，各0.2μl，Taq酶（5U/μl，Lifetechnologies）0.5μl，DNA模板1μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补至25μl。反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸5min。PCR产物取3μl与2%琼脂糖凝胶电泳，120V电压下30min，通过凝胶成像分析仪观察结果，M，DL600DNAMarker（DNA分子量标准，最大DNA片段为600碱基对）；1，阳性对照；2-7，3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%、0.003%；8，阴性对照。其中PCR方法的灵敏度为0.03%，而6，7显示为阴性结果。

由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到0.003%，PCR方法的灵敏度为0.03%，而0.08%或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品，显示更好的灵敏度。

实施例4特异性实验

用实施例1的鉴定方法分别对分离纯化的耐除草剂大豆DP-356043、RoundupReadyGTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、DP56423、MON89788、MON87701、CV127，转基因玉米MON810，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花MON531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花进行鉴定，照EUReferenceLaboratoryforGMFoodandFeed中的引物356043F:GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA（SEQIDNo：5），356043R:TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT（SEQIDNo：6）和探针356043Probe:FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC-TAMRA（SEQIDNo：7）进行荧光定量PCR检验。

请参阅图5，鉴定结果显示：转基因大豆RoundupReadyGTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、DP305423、MON89788、MON87701、CV127，转基因玉米MON810，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花MON531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花）反应管均为橙色、无“S”型扩增曲线（详见图5中的曲线2-曲线19），即无扩增；转基因大豆MON87701的反应管为绿色、显现“S”型扩增曲线（详见图5中的曲线1），即有扩增。本结果与EUReferenceLaboratoryforGMFoodandFeed中的荧光定量PCR反应结果相一致，显示出良好的特异性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

SEQUENCELISTING

<110>申请人

<120>耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组、LAMP检测试剂盒

及检测方法

<130>2015

<160>7

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cataacctcatctcgcctt19

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caatggaatccgaggagg18

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aacctagcctattcgacctaacggagccatcgtaggagaac41

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tagagatccgtcaacatggtggttggtcttctgagactgtatc43

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtcgaataggctaggtttacgaaaaa26

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tttgatattcttggagtagacgagagtgt29

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctctagagatccgtcaacatggtggagcac30

Claims (10)

1.耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，其特征在于：包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：CATAACCTCATCTCGCCTT（SEQIDNo：1）；

外引物2：CAATGGAATCCGAGGAGG（SEQIDNo：2）；

内引物1：AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAAC（SEQIDNo：3）；

内引物2：TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGTATC（SEQIDNo：4）。

2.耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

（1）引物液：含有权利要求1所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测引物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48～52μM外引物1、48～52μM外引物2，48～52μM内引物1、48～52μM内引物2；

（2）反应液：含有12mMdNTPs、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液，所述dNTPs、反应缓冲液和MgSO₄水溶液的体积比是7～9：4～6：2；

（3）DNA聚合酶：DNA聚合酶的浓度为7～9U/μl；

（4）对照：阳性对照为耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

3.根据权利要求2所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述引物液中含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2。

4.根据权利要求2所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，BstDNA聚合酶的浓度为8U/μl。

5.根据权利要求2所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述反应液中，12mMdNTP：10×IsothermalAmplification反应缓冲液：150mMMgSO₄水溶液的体积比为8：5：2。

6.根据权利要求2～5中任一项权利要求所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料Calcein。

7.根据权利要求2～5中任一项权利要求所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还含有荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYTO-9。

8.利用如权利要求2～5中任一项权利要求所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品DNA；

2）恒温检测反应：在PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；

3）结果判断：通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。

9.利用如权利要求6所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；

3）结果判断：在上述PCR管中加入1～2μl显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。

10.利用如权利要求7所述的耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的LAMP检测试剂盒检测耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种纯化样品DNA；

2）恒温检测反应：在200μlPCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，荧光指示剂SYTO-91μl，待检DNA1～6μl，用DNase/RNase-FreeDistilledWater补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043及其衍生品种的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪在60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；

3）结果判断：根据是否出现S型扩增曲线判断扩增结果。