CN110564822B - 基于LAMP技术的转基因玉米Bt176相关基因检测方法及试剂盒 - Google Patents

基于LAMP技术的转基因玉米Bt176相关基因检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于转基因玉米相关成分真伪鉴定方法，具体地说是利用环介导等温扩增(LAMP)技术检测玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的外源抗虫cry1Ab基因的方法。该方法根据玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的外源抗虫cry1Ab基因设计了特异性的LAMP引物，并提供了配套的试剂盒、检测方法和用途。本发明结合可视化报告方式，以中性红pH指示剂进行比色检测可实现一步可视化的比色检测。本发明在等温条件下进行，无需精密的变温设备，便捷、准确、分辨率高，检测过程无需开盖操作，适合于现场快速检测。

Description

基于LAMP技术的转基因玉米Bt176相关基因检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明属于转基因玉米相关成分检测鉴定方法，具体地说是利用LAMP技术分别检测玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的cry1Ab基因的方法。
背景技术
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术(genetically modifiedorganisms，GMOs)发展十分迅速，并已应用于农业、医药、工业等多个领域。1996年转基因作物开始商业化种植，全球转基因作物的种植面积逐年增加。然而，转基因作物对于人体健康、生态环境等的风险一直存在争议，为了规范管理转基因作物、保障消费者的知情权，世界各国都在努力制定相应的法律和法规,以加强对转基因作物及其产品的管理。因此，亟需建立一套快速、简便、准确的快速检测方法，建立转基因生物安全检测技术体系，以满足相关检验机构的日常现场快速检测的需求。
随着分子生物学技术的发展，许多以DNA分子为目标的检测方法已被广泛应用。目前检测转基因作物的方法主要有定性PCR法、实时荧光定量PCR法(RT-PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等。定性PCR技术操作繁琐，实时荧光定量PCR法检测成本高，且两者都难以实现现场检测。环介导等温扩增技术(LAMP)技术是一种在等温条件下进行的核酸体外扩增技术，在较短的反应时间内表现出较高的灵敏度和扩增效率，目前LAMP方法已经成为最常用的等温扩增手段之一。但目前常用的LAMP反应产物分析手段为实时荧光报告的方式、终点荧光/浊度报告法，需配备专用检测设备，同样难以适用于现场快速筛查。近年来，可视化分析方法在快速现场检测中展现优势。可视化染料比色分析既提高了肉眼的识别率，操作又更为简单，在保证其准确率的情况下，可直接用于快速的现场检测，有报导利用pH指示剂中性红(neutral red,N-red)作为一步可视化的报告方法，可使LAMP技术在现场快速检测领域具有更大的优势。
Bt176玉米是由瑞士先正达公司研制生产，是利用基因工程技术分别将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)亚种kurstaki的cry1A(b)基因、土壤细菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因等外源基因导入玉米中而获得的抗玉米螟和耐草铵膦转基因品种。自1995年在美国首次准许无限制种植以来，Bt-176玉米已经在许多国家和地区大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。本发明即是针对转基因玉米品系Bt176提供检测相应基因成分的特异性LAMP引物、检测试剂盒、检测方法及其用途。
发明内容
本发明的目的是提供基于LAMP技术检测玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的cry1Ab基因的LAMP引物、试剂盒、检测方法和用途。
本发明玉米内源ivr基因检测的特异性LAMP引物是根据玉米内源ivr基因DNA序列的保守区域设计的。从GeneBank中查找到玉米内源ivr基因设计了LAMP引物。其核苷酸序列如下所示：
外引物ivrB3：ACCAGACGCCGTTGGC
外引物ivrF3：ACGCAGGTCCGCTGTA
内引物ivrBIP：TCTCGCGCGACCTCCTCCATACGGGTGATCGGGCAC
内引物ivrFIP：TGCCCCATACCGCGGAGTCACAAGGGCTGGTACCACC
环引物ivrLB：GCACCTACCGCTGGCCAT
环引物ivrLF：CGGGTTCCACTGGTAGAAGA。
本发明转基因玉米Bt176品系中的cry1Ab基因设计的特异性LAMP引物是根据转基因玉米Bt176中外源cry1Ab基因的序列设计的。从GeneBank中查找到转基因玉米Bt176中外源cry1Ab基因设计了LAMP引物。其核苷酸序列如下所示：
外引物cryB3：GCCCCAGATGATGTCCACC
外引物cryF3：ATGGACAACAACCCCAACAT
内引物cryBIP：CACCCCCATCGACATCAGCCTAGGCCCAGCACGAAGC
内引物cryFIP：TAGCCGGTCTCGATGCGCTCCAACGAGTGCATCCCCTAC
环引物cryLB：GAGCCTGACCCAGTTCCT
环引物cryLF：GGGGTTGCTCAGGCAGTT。
本发明基于LAMP技术检测玉米相关基因成分的基础检测试剂盒包括上述相应基因的LAMP外引物、内引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10x LAMP反应缓冲液、去离子水。
本发明基于LAMP技术检测玉米相关基因成分的加速检测试剂盒还包括上述相应基因的LAMP外引物、内引物、环引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10x LAMP反应缓冲液、去离子水。
本发明基于LAMP技术检测玉米相关成分的基础检测试剂盒或加速检测试剂盒还可以包括信号报告分子用于指示检测结果：以荧光信号指示结果时，信号报告分子可以是荧光分子如SYBR Green I；以肉眼可见的比色信号指示结果时，信号报告分子可以是羟基萘酚蓝或中性红等。
优选的，上述10xLAMP反应缓冲液包括200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，600mmol/LKCl，80mmol/L MgSO4，100mmol/L(NH4)2SO4，1％Triton X-100。
特别的，以中性红为信号报告分子时，优选的上述反应缓冲液包括50mmol/LTris-HCl(pH8.8)，600mmol/L KCl，80mmol/L MgSO4，100mmol/L(NH4)2SO4，1％Triton X-100。
本发明基于LAMP技术的玉米相关基因成分的检测方法，检测步骤包括：
(1)待测样本DNA的提取；
(2)以步骤(1)提取到的DNA为模板，选用上述玉米相关基因成分的LAMP引物或
试剂盒进行LAMP反应；
(3)LAMP扩增产物分析：有扩增信号，则待测样本中含有与所用引物或试剂盒对应的
玉米相关基因成分；无扩增信号，则待测样本中不含相对应玉米相关基因成分。
本发明所述的基于LAMP技术的玉米相关基因成分检测方法的LAMP反应可以采用基础扩增反应体系(包括LAMP外引物、内引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10x LAMP反应缓冲液、去离子水)或加速扩增反应体系(包括LAMP外引物、内引物、环引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10x LAMP反应缓冲液、去离子水)。
上述基础扩增反应体系，优选为：
Figure BDA0002209722000000031
当加入利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μmol/L；
最后用ddH2O补足至25μL。
上述加速扩增反应体系，优选为：
Figure BDA0002209722000000032
Figure BDA0002209722000000041
当加入利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μmol/L；
最后用ddH2O补足至25μL。
本发明基于LAMP技术检测玉米相关成分的检测试剂盒、检测方法以肉眼可见的比色信号指示结果时，信号报告分子是中性红时，黄色为阴性结果，粉红色为阳性结果。
如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。
“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。
“LAMP”：环介导的等温扩增。是一种体外等温扩增DNA特异片段的技术，扩增过程分为初始产物形成阶段以及循环扩增阶段，最终产生具有大量反向重复序列的DNA大分子片段，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：
1.特异性。本发明基于LAMP技术检测玉米相关基因成分(玉米内源ivr基因、转基因玉米品系Bt176中的cry1Ab基因)的引物均根据GenBank中公布的DNA序列进行设计，实验结果表明各引物组合的特异性较好，能准确检测目标成分。
2.快速性。采用本发明方法检测十分快速，至多1h即可得知检测结果。
3.实用性。本发明转基因玉米相关成分检测方法仅需要简单的恒温仪，因此，更加适合于现场快速检测。
4.经济性。本发明结合中性红pH指示剂进行比色检测时，便无需对引物及探针序列进行修饰，合成方便，且可实现一步可视化的比色检测，从而大大降低检测成本。
附图说明
图1是具体实施例1中玉米内源ivr基因检测方法特异性试验结果(管1：非转基因玉米DNA模板；管2：转基因玉米Bt176DNA模板；管3：非转基因大米DNA模板)。
图2是具体实施例2对为转基因玉米Bt176中抗除虫外源cry1Ab基因检测方法特异性试验结果(管1：非转基因玉米DNA模板；管2：转基因玉米Bt176DNA模板；管3：转基因玉米Bt11DNA模板；管4：转基因玉米MON810DNA模板)。
具体实施方式
下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、玉米内源ivr基因检测方法特异性试验
(1)按照DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA。
以1份非转基因玉米样品、1份转基因玉米Bt176样品和一份非转基因大米样品提取的DNA为模板进行LAMP反应。
(2)玉米内源ivr基因检测方法LAMP引物，引物序列如下：
外引物ivrB3：ACCAGACGCCGTTGGC
外引物ivrF3：ACGCAGGTCCGCTGTA
内引物ivrBIP：TCTCGCGCGACCTCCTCCATACGGGTGATCGGGCAC
内引物ivrFIP：TGCCCCATACCGCGGAGTCACAAGGGCTGGTACCACC
环引物ivrLB：GCACCTACCGCTGGCCAT
环引物ivrLF：CGGGTTCCACTGGTAGAAGA。
(3)LAMP反应体系及反应条件
Figure BDA0002209722000000051
当利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μmol/L；
最终将反应体系用超纯水补足至25μL。
LAMP反应条件是：61℃反应1h。
阴性对照(NC)为：加相当于模板体积的超纯水于反应管中。
(4)检测方法
利用中性红进行比色分析时，将整个反应放置在恒温仪或水浴锅中反应1h后直接取出肉眼观察。
(5)检测结果
如附图1所示，用该方法同时扩增非转基因玉米样品、转基因玉米Bt176样品和非转基因大米样品的DNA模板。在中性红可视化体系下，反应进行1个小时后，非转基因玉米DNA模板和转基因玉米Bt176标准品反应管均出现粉红色阳性扩增结果，而非转基因大米仍为黄色阴性结果。表明本研究中建立的玉米内源ivr基因检测方法具有良好的特异性，未出现假阳性结果，是一种特异的，准确的玉米内源ivr基因检测方法。
实施例2、转基因玉米品系Bt176中cry1Ab基因检测方法特异性试验
(1)按照DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA。
以1份非转基因玉米样品、1份转基因玉米Bt176样品、1份转基因玉米Bt11样品和1份转基因玉米MON810样品提取的DNA为模板进行LAMP反应。
(2)转基因玉米Bt176中cry1Ab基因检测方法LAMP引物，引物序列如下：
外引物cryB3：GCCCCAGATGATGTCCACC
外引物cryF3：ATGGACAACAACCCCAACAT
内引物cryBIP：CACCCCCATCGACATCAGCCTAGGCCCAGCACGAAGC
内引物cryFIP：TAGCCGGTCTCGATGCGCTCCAACGAGTGCATCCCCTAC
环引物cryLB：GAGCCTGACCCAGTTCCT
环引物cryLF：GGGGTTGCTCAGGCAGTT。
(3)LAMP反应体系及反应条件
Figure BDA0002209722000000061
当加入利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μmol/L；
最终将反应体系用超纯水补足至25μL。
LAMP反应条件是：61℃反应1h。
阴性对照(NC)为：加相当于模板体积的超纯水于反应管中。
(4)检测方法
利用中性红进行比色分析时，将整个反应放置在恒温仪或水浴锅中反应1h后直接取出肉眼观察。
(5)检测结果
如附图2所示，用该方法同时扩增非转基因玉米样品、转基因玉米Bt176样品、转基因玉米Bt11样品和转基因玉米MON810样品DNA。在中性红可视化体系下，反应进行1个小时后，转基因玉米Bt176标准品反应管出现粉红色阳性扩增结果，而非转基因玉米、转基因玉米Bt11标准品和转基因玉米MON810标准品仍为黄色阴性结果。本方法对转基因玉米Bt176品系中的cry1Ab基因设计特异性LAMP引物，实现了对Bt176标准品的检测，而不能对转基因玉米MON810和Bt11进行有效检测。表明本方法对Bt176中的cry1Ab基因建立的检测方法能特异性的检测转基因玉米Bt176标准品。

Claims (13)

1.基于LAMP技术的转基因玉米品系Bt176转基因成分cry1Ab基因的特异性LAMP引物，其特征是：根据转基因玉米品系Bt176的cry1Ab基因特异性设计，包括外引物、内引物、环引物：
外引物cryB3：GCCCCAGATGATGTCCACC
外引物cryF3：ATGGACAACAACCCCAACAT
内引物cryBIP：CACCCCCATCGACATCAGCCTAGGCCCAGCACGAAGC
内引物cryFIP：TAGCCGGTCTCGATGCGCTCCAACGAGTGCATCCCCTAC
环引物cryLB：GAGCCTGACCCAGTTCCT
环引物cryLF：GGGGTTGCTCAGGCAGTT。
2.基于LAMP技术检测转基因玉米品系Bt176中转基因成分cry1Ab基因的基础检测试剂盒，其特征是：包括权利要求1所述LAMP外引物、内引物。
3.基于LAMP技术检测转基因玉米品系Bt176中转基因成分cry1Ab基因的加速检测试剂盒，其特征是：包括权利要求1所述LAMP外引物、内引物、环引物。
4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征是：还包括DNA聚合酶、dNTPs、10×LAMP反应缓冲液、去离子水。
5.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征是：还包括信号报告分子用于指示检测结果，信号报告分子是SYBR Green I、羟基萘酚蓝或中性红。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征是：所述10×LAMP反应缓冲液包括200 mMpH8.8的Tris-HCl，600 mM KCl，80 mM MgSO4，100 mM (NH4)2SO4，1% Triton X-100。
7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征是：以中性红为信号报告分子时，10×LAMP反应缓冲液包括50 mM pH8.8的Tris-HCl，600 mM KCl，80 mM MgSO4，100 mM (NH4)2SO4，1% Triton X-100。
8.基于LAMP技术的玉米转基因成分cry1Ab基因的检测方法，其特征是：
（1）待测样本DNA的提取；
（2）以步骤（1）提取到的DNA为模板，选用权利要求1所述的玉米转基因成分cry1Ab基因的LAMP引物或权利要求2或3所述的检测试剂盒进行LAMP反应；
（3）LAMP扩增产物分析：有扩增信号，则待测样本中含有玉米转基因成分cry1Ab基因；无扩增信号，则待测样本中不含玉米转基因成分cry1Ab基因。
9.根据权利要求8所述的基于LAMP技术的玉米转基因成分cry1Ab基因的检测方法，其特征是：所述LAMP反应采用基础扩增反应体系或加速扩增反应体系；基础扩增反应体系包括LAMP外引物、内引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10×LAMP反应缓冲液、去离子水；加速扩增反应体系包括LAMP外引物、内引物、环引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10×LAMP反应缓冲液、去离子水。
10.根据权利要求9所述的基础扩增反应体系，其特征是：体系为，
外引物 各0.4 μmol/L
内引物 各1.6 μmol/L
dNTP 0.8 mmol/L
betaine 1 mol/L
Bsm DNA聚合酶 4 U
模板DNA 6 pg
10×LAMP缓冲液 2.5 μL；
当利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100 μmol/L；最后用ddH2O 补足至25 μL。
11.根据权利要求9所述的加速扩增反应体系，其特征是：体系为，
外引物 各0.4 μmol/L
内引物 各1.6 μmol/L
环引物 各0.8 μmol/L
dNTP 0.8 mmol/L
betaine 1 mol/L
Bsm DNA聚合酶 4 U
模板DNA 6 pg
10×LAMP缓冲液 2.5 μL；
当利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100 μmol/L；最后用ddH2O 补足至25 μL。
12.根据权利要求8所述的基于LAMP技术的玉米转基因成分cry1Ab基因的检测方法，其特征是：反应温度为55-65℃，反应时间至多1 h。
13.根据权利要求8所述的基于LAMP技术的玉米转基因成分cry1Ab基因的检测方法，其特征是：以肉眼可见的比色信号指示结果时，信号报告分子是中性红时，黄色为阴性结果，粉红色为阳性结果。
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