CN105779611B - 一种高通量的多重富集定量PCR(ME-qPCR)检测转基因作物元件及品系的方法 - Google Patents

一种高通量的多重富集定量PCR(ME-qPCR)检测转基因作物元件及品系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学，具体公开了一种检测转基因作物的方法，针对转基因作物的内源基因、外源基因和转基因品系旁临序列设计内、外引物，先将所有内、外引物混合，进行第一轮循环数较少(15cycles)的高通量多重富集PCR，再运用内引物进行第二轮荧光定量PCR，结果根据扩增曲线和熔融曲线分析，显著增加了所述方法的成功率和稳定性，可实现高通量检测转基因作物的目的。本发明所述方法的灵敏度高于普通荧光定量PCR约1个数量级；拥有和普通荧光定量PCR相同的定量能力；特异性强，为转基因作物的检测提供了更有效的方法。

Description

一种高通量的多重富集定量PCR(ME-qPCR)检测转基因作物元 件及品系的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种高通量检测转基因作物的方法。
背景技术
在转基因检测中，以核酸为基础的检测方法因其稳定性强、特异性高得到广泛的应用，其中以PCR为基础的检测方法尤为重要。PCR为基础的检测方法主要包括普通PCR和荧光定量PCR，荧光定量PCR因其无需凝胶电泳、特异性强等特点，在实际检测中应用广泛。但检测通量一直是以PCR为基础的检测方法的一个瓶颈，例如，多重PCR因引物之间容易形成引物二聚体，且引物之间易存在竞争，这导致多重PCR的检测通量不高；而多重荧光定量PCR由于仪器检测荧光通路的限制及引物探针之间的竞争，也难以实现高通量。如何将高通量检测与荧光定量PCR结合起来，建立一种新型的高通量荧光定量PCR检测方法显得很有必要。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高通量检测转基因作物的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种检测转基因作物的方法，包括如下步骤：
(1)针对待测样品的内源基因、外源基因及转基因品系旁临序列，各设计内引物对和外引物对；
(2)筛选特异性高、灵敏度高的内引物对和外引物对；保证外引物产物大小约为100-200bp，内引物产物大小约为50-100bp；调整所有内外引物Tm值基本一致以保证在同一退火温度下均能顺利扩增；
(3)提取待测样品DNA，以待测样品DNA作为模板，利用步骤(2)筛选得到的内外引物对一同进行PCR扩增，得到扩增产物；
(4)以步骤(3)获得的扩增产物为模板，利用步骤(2)筛选得到的内引物对进行荧光定量PCR，检测荧光信号，根据SYBR GreenI通道下的循环阈值(Ct值)判断待测样品的外源靶基因是否存在。
其中，外源基因是指转基因作物转入或欲转入的外源目的基因，所述方法能够验证转基因作物是否已经含有外源目的基因。
所述内源基因可根据本领域常规选择进行，例如，玉米可选择内源基因IVR，油菜可选择内源基因PEP，棉花可选择内源基因Sad1，大豆可选择内源基因Lectin，水稻可选择内源基因SPS。
所述的转基因品系旁临序列是指外源基因插入基因组的位点的两端的序列，引物在插入位点两端设计，可以用于检测转基因品系类型。
引物设计出了上述要求外，调整所有内外引物Tm值基本一致以保证在同一退火温度下均能顺利扩增，并要将外引物产物大小控制在100-200bp左右，内引物产物大小控制在50-100bp左右。
为了实现高通量检测，所述待测样品的外源基因数量可为多个，待测样品数量可为多个。同时增加了引物设计的要求和难度。
进一步地，所述步骤(4)中，需将针对不同基因的内引物对置于不同的PCR反应孔中，相互独立地进行荧光定量PCR反应。
综上，本发明建立了一种多重富集定量PCR(Multiplex enrichmentquantitative PCR,ME-qPCR)，针对每一个靶基因序列均设计内、外2对引物，外引物产物大小控制在100-200bp左右，内引物产物大小控制在50-100bp左右，并调整内外引物Tm值基本一致以保证在同一退火温度下均能顺利扩增。首先，将所有内、外引物混合，进行第一轮循环数较少(15cycles)的高通量多重富集PCR，然后第一轮PCR产物用ddH2O稀释作为模板，运用内引物进行第二轮荧光定量PCR，结果根据扩增曲线和熔融曲线分析。在第一轮高通量多重富集PCR中，每个靶基因均有4种可能的产物类型，这4种产物类型均能作为第二轮荧光定量PCR的模板，这意味着4条引物对应的4种组合只要有1种能够成功扩增，整个反应就能进行，相当于提高了将靶基因从模板中富集(enrichment)出来的概率，显著增加了所述方法的成功率和稳定性。同时，由于第一轮循环数较少，引物之间的竞争较小，各个靶基因均能得到均匀的扩增(原理如图1所示)。
本发明所述方法的灵敏度高于普通荧光定量PCR约1个数量级；拥有和普通荧光定量PCR相同的定量能力；特异性强，为转基因作物的检测提供了更有效的方法。
第二方面，由于设计、筛选得到的引物在使用效果上存在一定程度的差异，本发明经严格设计和大量筛选后提供一种检测转基因作物的引物组合，具体包括如下引物序列：
玉米内源基因IVR内、外引物：
IVR的外引物的上游引物：5′-CACTCCATCGTGGAGAGCTT-3′；
IVR的外引物的下游引物：5′-GGCGTTGTTGAAGAGGAAGA-3′；
IVR的内引物的上游引物：5′-CTTTGCTCAAGGCGGGAGGA-3′；
IVR的内引物的下游引物：5′-GGAGTCGTAGATGGCTCGTGTG-3′；
油菜内源基因PEP内、外引物：
PEP的外引物的上游引物：5′-CAGTTCTTGGAGCCGCTTGAG-3′；
PEP的外引物的下游引物：5′-TGACGGATGTCGAGCTTCACA-3′；
PEP的内引物的上游引物：5′-AGACAGACCTACAGCCGATGGAA-3′；
PEP的内引物的下游引物：5′-AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA-3′；
大豆内源基因Lectin内、外引物：
Lectin的外引物的上游引物：5′-AGTCGTCGCTGTTGAGTTTGA-3′；
Lectin的外引物的下游引物：5′-ACCCACTCGGGAAGAGAAGTC-3′；
Lectin的内引物的上游引物：5′-TGCCTCCACCAGCCTCTT-3′；
Lectin的内引物的下游引物：5′-AGTCTTCAAATCGACCACATCG-3′；
棉花内源基因Sad1内、外引物：
Sad1的外引物的上游引物：5′-CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA-3′；
Sad1的外引物的下游引物：5′-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3′；
Sad1的内引物的上游引物：5′-TGCCTGTTCAGATCACCCACT-3′；
Sad1的内引物的下游引物：5′-GCCCAGCCCTCCAAAGATTTA-3′；
水稻内源基因SPS内、外引物：
SPS的外引物的上游引物：5′-TCCAGAGAGCCCCGAACTC-3′；
SPS的外引物的下游引物：5′-AGGAGAAGCACTGGACGAGG-3′；
SPS的内引物的上游引物：5′-AGCCCCGAACTCCTCCAAA-3′；
SPS的内引物的下游引物：5′-GGACGAGGAGAGAGAGGATGAG-3′；
转基因玉米NK603品系特异性内、外引物：
NK603的外引物的上游引物：5′-CGGCCAGCAAGCCTTGTAG-3′；
NK603的外引物的下游引物：5′-TTTGGACTATCCCGACTCTCTTC-3′；
NK603的内引物的上游引物：5′-CGGCCAGCAAGCCTTGTAG-3′；
NK603的内引物的下游引物：5′-TCAAGCATATGAATGACCTCGA-3′；
转基因玉米BT11品系特异性内、外引物：
BT11的外引物的上游引物：5′-CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT-3′；
BT11的外引物的下游引物：5′-GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT-3′；
BT11的内引物的上游引物：5′-CCTTCTTGGCGGCTTATCT-3′；
BT11的内引物的下游引物：5′-CATGTCGAGATCCGAGGGA-3′；
转基因玉米MON810品系特异性内、外引物：
MON810的外引物的上游引物：5′-AACGTGCCCGGTACTGGTTC-3′；
MON810的外引物的下游引物：5′-GACTGCTCGCAAGCAAATTC-3′；
MON810的内引物的上游引物：5′-CCACAGCCACCACTTCTCC-3′；
MON810的内引物的下游引物：5′-GCAAGCAAATTCGGAAATGAA-3′；
转基因玉米MON88017品系特异性内、外引物：
MON88017的外引物的上游引物：5′-AGCAGCAGAATCGTGTGACAAC-3′；
MON88017的外引物的下游引物：5′-TTTCCCGGACATGAAGCCAT-3′；
MON88017的内引物的上游引物：5′-CACATCATCGACAAGCACCTT-3′；
MON88017的内引物的下游引物：5′-CGGACATGAAGCCATTTACAAT-3′；
转基因玉米T25品系特异性内、外引物：
T25的外引物的上游引物：5′-ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC-3′；
T25的外引物的下游引物：5′-GACATGATACTCCTTCCACCG-3′；
T25的内引物的上游引物：5′-ATTGCCCTTTGGTCTTCTGA-3′；
T25的内引物的下游引物：5′-CAATGGCGGAACGACTCAA-3′；
转基因玉米TC1507品系特异性内、外引物：
TC1507的外引物的上游引物：5′-TTGACAGGTTTGAGTTGATTCCAG-3′；
TC1507的外引物的下游引物：5′-CCAAGAACTCATGTTAGTCGCAA-3′；
TC1507的内引物的上游引物：5′-AGTTGATTCCAGTTACTGCCACA-3′；
TC1507的内引物的下游引物：5′-CATGTTAGTCGCAACGAAACC-3′；
转基因大豆305423品系特异性内、外引物：
305423的外引物的上游引物：5′-CGTCAGGAATAAAGGAAGTACAGTA-3′；
305423的外引物的下游引物：5′-CAACCAAATGCCCTAAAGGATGCGT-3′；
305423的内引物的上游引物：5′-GTTGATTCCAGTTACTGCCACA-3′；
305423的内引物的下游引物：5′-CATGTTAGTCGCAACGAAACC-3′；
转基因大豆FG72品系特异性内、外引物：
FG72的外引物的上游引物：5′-AGATTTGATCGGGCTGCAGG-3′；
FG72的外引物的下游引物：5′-GCACGTATTGATGACCGCATTA-3′；
FG72的内引物的上游引物：5′-AGATTTGATCGGGCTGCAGG-3′；
FG72的内引物的下游引物：5′-GCACGTATTGATGACCGCATTA-3′；
转基因大豆A2704-12品系特异性内、外引物：
A2704-12的外引物的上游引物：5′-GGGCGTTCGTAGTGACTGAG-3′；
A2704-12的外引物的下游引物：5′-GCGTTACCCAACTTAATCGC-3′；
A2704-12的内引物的上游引物：5′-GGGGTCAAAGACCAAGAAGTG-3′；
A2704-12的内引物的下游引物：5′-GCTGGCGTAATAGCGAAGAG-3′；
转基因油菜RT73品系特异性内、外引物：
RT73的外引物的上游引物：5′-CCATATTGACCATCATACTCATTGCT-3′；
RT73的外引物的下游引物：5′-GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA-3′；
RT73的内引物的上游引物：5′-TAGATTTCCCGGACATGAAGA-3′；
RT73的内引物的下游引物：5′-AGGAAGGAAAGGCAAGGAAA-3′；
转基因棉花GHB119品系特异性内、外引物：
GHB119的外引物的上游引物：5′-CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA-3′；
GHB119的外引物的下游引物：5′-GAAATTGCGTGACTCAAATTCC-3′；
GHB119的内引物的上游引物：5′-CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA-3′；
GHB119的内引物的下游引物：5′-GAAATTGCGTGACTCAAATTCC-3′；
转基因水稻BT63品系特异性内、外引物：
BT63的外引物的上游引物：5′-CGGCCATTGATTTGTAGAGA-3′；
BT63的外引物的下游引物：5′-ATATGTTCGTAGCCCCACCACTA-3′；
BT63的内引物的上游引物：5′-CGGCCATTGATTTGTAGAGA-3′；
BT63的内引物的下游引物：5′-AGCCCCACCACTACTGCTTAT-3′；
Cry1Ab基因内、外引物：
Cry1Ab的外引物的上游引物：5′-GGACAACAACCCMAACATCAAC-3′；
Cry1Ab的外引物的下游引物：5′-GCACGAACTCGCTCAGCAG-3′；
Cry1Ab的内引物的上游引物：5′-CAACGAGTGCATCCCCTACAAC-3′；
Cry1Ab的内引物的下游引物：5′-GCTGATGTCGATGGGGGTGT-3′；
PAT基因内、外引物：
pat的外引物的上游引物：5′-AAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT-3′；
pat的外引物的下游引物：5′-GATGCCTATGTGACACGTAAACAGTAC-3′；
pat的内引物的上游引物：5′-GTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT-3′；
pat的内引物的下游引物：5′-TGTCCAATCGTAAGCGTTCCTA-3′；
GOX基因内、外引物：
Gox的外引物的上游引物：5′-GTCTTCGTGTTGCTGGAACCGTT-3′；
Gox的外引物的下游引物：5′-GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT-3′；
Gox的内引物的上游引物：5′-ACCGTTGAGTTCGCTGGTC-3′；
Gox的内引物的下游引物：5′-AGAACGTGAGCACCCTTCC-3′；
EPSPS基因内、外引物：
EPSPS的外引物的上游引物：5′-GTTGCGGCCCTGCTTGT-3′；
EPSPS的外引物的下游引物：5′-CAGCGTGGAGGAGCGAAC-3′；
EPSPS的内引物的上游引物：5′-CCGACATCGAAGTCATCAACC-3′；
EPSPS的内引物的下游引物：5′-CAGCGTGGAGGAGCGAAC-3′；
CaMV35S基因内、外引物：
CaMV35S的外引物的上游引物：5′-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3′；
CaMV35S的外引物的下游引物：5′-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3′；
CaMV35S的内引物的上游引物：5′-TCTCCACTGACGTAAGGGATGA-3′；
CaMV35S的内引物的下游引物：5′-GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG-3′；
NOS基因内、外引物：
NOS的外引物的上游引物：5′-TGCCGGTCTTGCGATGA-3′；
NOS的外引物的下游引物：5′-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3′；
NOS的内引物的上游引物：5′-TGCCGGTCTTGCGATGA-3′；
NOS的内引物的下游引物：5′-CCCATCTCATAAATAACGTCATGC-3′；
FMV35S基因内、外引物：
FMV35S的外引物的上游引物：5′-CTAGTACAAGTGGGGAACAAAATAACG-3′；
FMV35S的外引物的下游引物：5′-ATCTGATGATCCTTCAAATGGGAATGA-3′；
FMV35S的内引物的上游引物：5′-TCCTGACAGCCCACTCACTAA-3′；
FMV35S的内引物的下游引物：5′-AGGGAATTCTTTTGTGGTCGT-3′；
NPTII基因内、外引物：
NPTII的外引物的上游引物：5′-GGAAGGGACTGGCTGCTATTG-3′；
NPTII的外引物的下游引物：5′-GATGTTTCGCTTGGTGGTCG-3′；
NPTII的内引物的上游引物：5′-CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3′；
NPTII的内引物的下游引物：5′-GGTAGCCGGATCAAGCGTATG-3′；
bar基因内、外引物：
Bar的外引物的上游引物：5′-GCAACGCCTACGACTGGAC-3′；
Bar的外引物的下游引物：5′-TGACAGCGACCACGCTCTT-3′；
Bar的内引物的上游引物：5′-TCGACCGTGTACGTCTCCC-3′；
Bar的内引物的下游引物：5′-CTGTGCCTCCAGGGACTTCA-3′。
上述引物组合可用于检测转基因玉米、水稻、大豆、棉花和油菜。引物的扩增对象涵盖了现阶段常见的外源目的基因(即前文所述的外源靶基因)与上述作物独特的内源基因，并且能检测一些常见品系。
进一步地，本发明还提供了含有所述引物组合的试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供了前述引物组合在检测转基因作物中的应用。
具体包括如下步骤：
(1)提取待检样品的DNA；
(2)第一轮多重富集PCR：以待测样品DNA作为模板，利用所述引物组合中的全部引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)第二轮荧光定量PCR：将所述引物组合中针对不同基因的内引物置于不同的PCR反应孔中，均以步骤(2)获得的扩增产物用ddH2O稀释100倍后作为模板进行荧光定量PCR，检测荧光信号，根据SYBR Green I通道下的循环阈值(Ct值)判断待测样品的外源靶基因。
判断方法为：
5种内源基因的Ct值必须小于35，表明样品基因组DNA提取有效，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常，否则检测无效。在确定内源基因Ct值＜35时，当外源基因无扩增曲线产生或Ct值≥40时，待测样品的判定结果为阴性；当外源基因Ct值＜35时，待测样品的判定结果为阳性；当35≤外源基因Ct值≤40时，对待测样品重新进行检测，重新进行检测所得的外源基因Ct值≥40时，待测样品的判定结果为阴性，重新进行检测所得的外源基因Ct值＜40时，待测样品的判定结果为阳性。
进一步地，本发明针对所述引物组合优化了PCR反应体系和反应条件，提高引物的扩增效率和特异性。具体如下：
步骤(2)中的PCR反应体系为50μL：Mix2溶液25μL、Mix1溶液0.25μL、各引物终浓度为0.1μmol/L，待检样品DNA 50～100ng，用ddH2O补足；PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，15个循环；72℃5min。
步骤(3)中的PCR反应体系为25μL：
Figure BDA0000966486010000091
Premix DimerEraser(2×conc.)反应液12.5μL，引物终浓度各为0.4μmol/L，模板1μL，用ddH2O补足；PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环。在每个循环的72℃阶段结束后用Roche 480仪器(瑞士罗氏公司)检测荧光信号，根据SYBR Green I通道下的循环阈值(Ct值)进行判断。
Figure BDA0000966486010000092
Premix DimerEraser(2×conc.)是宝生物工程(大连)有限公司的产品(货号为RR091A)，
Figure BDA0000966486010000093
Premix DimerEraser(2×conc.)含有DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBR Green I和反应缓冲液。
Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液；Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2和Mix 1均为宝生物工程(大连)有限公司，货号为RR060A。
本发明的有益效果在于：
本发明建立了一种多重富集定量PCR(Multiplex enrichment quantitativePCR,ME-qPCR)，针对每一个靶基因序列均设计内、外2对引物，并先将所有内、外引物混合，进行第一轮循环数较少(15cycles)的高通量多重富集PCR，再运用内引物进行第二轮荧光定量PCR，结果根据扩增曲线和熔融曲线分析，显著增加了所述方法的成功率和稳定性。
同时，本发明提供一种检测转基因作物的方法，针对作物的内源基因和外源目的基因设计内、外引物，采用上述方法，实现高通量检测转基因作物的目的。
本发明所述方法的灵敏度高于普通荧光定量PCR约1个数量级；通量高达26重；拥有和普通荧光定量PCR相同的定量能力；特异性强，为转基因作物的检测提供了更有效的方法。
附图说明
图1为本发明所述ME-qPCR方法的原理图。
图2为本发明实施例2检测的26个基因的扩增曲线。
图3为本发明实施例2检测的26个基因的熔融曲线。
图4为本发明实施例3中多重富集定量PCR的特异性验证。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中使用的转基因玉米T25、转基因玉米MON88017、转基因玉米BT11、转基因玉米TC1507、转基因玉米NK603、转基因玉米MON810、转基因玉米MIR604、转基因玉米MIR162、转基因玉米MON863、转基因大豆FG72、转基因大豆305423、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS40-3-2、转基因油菜RT73、转基因油菜MS1、转基因棉花GHB119、转基因水稻BT63由中国检验检疫科学研究院提供。
实施例1用于多重富集定量PCR检测转基因作物的引物组合的获得
本发明设计用于多重富集定量PCR(Multiplex enrichment quantitative PCR,ME-qPCR)检测引物组，包括转基因玉米T25品系特异性内、外引物；转基因玉米MON88017品系特异性内、外引物；转基因玉米BT11品系特异性内、外引物；转基因玉米TC1507品系特异性内、外引物；转基因玉米NK603品系特异性内、外引物；转基因玉米MON810品系特异性内、外引物；转基因大豆FG72品系特异性内、外引物；转基因大豆305423品系特异性内、外引物；转基因大豆A2704-12品系特异性内、外引物；转基因油菜RT73品系特异性内、外引物；转基因棉花GHB119品系特异性内、外引物；转基因水稻BT63品系特异性内、外引物；玉米内源基因IVR内、外引物；油菜内源基因PEP内、外引物；棉花内源基因Sad1内、外引物；大豆内源基因Lectin内、外引物；水稻内源基因SPS内、外引物；Cry1Ab基因内、外引物；PAT基因内、外引物；GOX基因内、外引物；EPSPS基因内、外引物；CaMV35S基因内、外引物；NOS基因内、外引物；NPTII基因内、外引物；bar基因内、外引物；FMV35S基因内、外引物。
经筛选得到了前文所述的引物组合。
实施例2多重富集定量PCR检测26个靶基因
1、DNA的提取
参照DNA提取试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米T25、转基因玉米MON88017、转基因玉米BT11、转基因玉米TC1507、转基因玉米NK603、转基因玉米MON810、转基因大豆FG72、转基因大豆305423、转基因大豆A2704-12、转基因油菜RT73、转基因棉花GHB119、转基因水稻BT63的基因组DNA。混合上述12种转基因品系的基因组DNA，制备成含有26个靶基因的混合DNA。
2、多重富集定量PCR扩增
(1)第一轮多重富集PCR：反应体系中含有Mix2溶液25μL、Mix1溶液0.25μL、所有内外引物(浓度均为0.1μmol/L)，步骤1中获得的混合DNA 50ng，用ddH2O补足至50μL；第一轮多重PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，15个循环；72℃5min。第一轮多重富集PCR反应结束后，用ddH2O稀释PCR产物100倍；
(2)第二轮荧光定量PCR：反应体系中含有
Figure BDA0000966486010000121
Premix DimerEraser(2×conc.)反应液12.5μL，26个基因的内引物分派到不同的PCR反应孔中，引物浓度均为0.4μmol/L，每个基因重复3孔，第一轮PCR产物的100倍稀释的稀释物1μL作为模板，用ddH2O将体积调整为25μL；第二轮荧光定量PCR反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环；在每个循环的72℃阶段结束后用Roche 480仪器(瑞士罗氏公司)检测荧光信号，根据SYBR Green I通道下的循环阈值(Ct值)进行判断。
2、结果
结果如图2、图3所示，26个基因均能顺利扩增，每个基因3个重复的重现性较好，熔融曲线分析表明没有非特异性扩增，均为目标产物。
实施例3多重富集定量PCR特异性评价
1、DNA的提取
参照DNA提取试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米T25、转基因玉米MON88017、转基因玉米BT11、转基因玉米TC1507、转基因玉米NK603、转基因玉米MON810、转基因玉米MIR604、转基因玉米MIR162、转基因玉米MON863、转基因大豆FG72、转基因大豆305423、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS40-3-2、转基因油菜RT73、转基因油菜MS1、转基因棉花GHB119、转基因水稻BT63的基因组DNA。
2、多重富集定量PCR扩增
采用实施例2的方法，分别以步骤1中提取的9种转基因玉米、4种转基因大豆、2种转基因油菜、1种转基因棉花、1种转基因水稻共17个已知转基因样品的基因组DNA为模板进行多重富集定量PCR扩增。
3、结果
结果如图4所示，“+”为检出，“—”为未检出。5种物种的内源基因均显示为阳性，12个品系均顺利从17个样品中检出。转基因元件的检出情况符合预期，表明本发明特异性高。(相关品系所含有的元件信息可从转基因检测数据库(GMDD，http://gmdd.shgmo.org/)和欧洲转基因生物指南(http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db)中获得。)
实施例4多重富集定量PCR与普通荧光定量PCR定量能力及灵敏度的对比
1、DNA的提取
参照DNA提取试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)提取转基因玉米BT11的基因组DNA，按照10倍稀释制作成一系列浓度梯度，分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL。
2、多重富集定量PCR扩增
采用实施例2的方法，分别以步骤1中梯度稀释的转基因玉米BT11的基因组DNA为模板进行多重富集定量PCR扩增。
3、普通荧光定量PCR扩增
以步骤1梯度稀释的转基因玉米BT11基因组DNA为模板，分别运用26个靶基因的内引物，按照表1所示的普通荧光定量PCR反应体系进行扩增。荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，40个循环，在每个循环的72℃阶段结束后用Roche 480仪器(瑞士罗氏公司)检测荧光信号，根据SYBR Green I通道下的循环阈值(Ct值)进行判断。
Figure BDA0000966486010000141
Premix DimerEraser(2×conc.)是宝生物工程(大连)有限公司的产品(货号为RR091A)，
Figure BDA0000966486010000142
Premix DimerEraser(2×conc.)含有DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBR Green I和反应缓冲液。
表1荧光定量PCR扩增的反应体系
Figure BDA0000966486010000143
4、结果
ME-qPCR和普通荧光定量PCR法均有6个基因有扩增，分别为NOS、CaMV35S、Cry1Ab、Pat、IVR、BT11，从表2中可以得出，ME-qPCR灵敏度高于普通荧光定量PCR约1个数量级，高达0.001ng/μL，并且拥有和普通荧光定量PCR类似的定量能力，R2及扩增效率符合荧光定量PCR的要求。
表2ME-qPCR和普通荧光定量PCR检测BT11结果
Figure BDA0000966486010000151
其中，A代表ME-qPCR，B代表普通荧光定量PCR，“——”代表未检出。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.用于检测转基因作物的引物组合在检测转基因作物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待检样品的DNA；
（2）第一轮多重富集PCR：以待测样品DNA作为模板，利用用于检测转基因作物的引物组合进行多重富集PCR扩增，得到扩增产物；
（3）第二轮荧光定量PCR：将所述引物组合中针对不同基因的内引物置于不同的PCR反应孔中，均以步骤（2）获得的扩增产物稀释物为模板进行荧光定量PCR，检测荧光信号，根据SYBR Green I通道下的循环阈值Ct值判断待测样品的外源靶基因；
其中，所述用于检测转基因作物的引物组合，包括如下引物序列：
玉米内源基因IVR内、外引物：
IVR的外引物的上游引物：5′- CACTCCATCGTGGAGAGCTT -3′；
IVR的外引物的下游引物：5′- GGCGTTGTTGAAGAGGAAGA -3′；
IVR的内引物的上游引物：5′- CTTTGCTCAAGGCGGGAGGA -3′；
IVR的内引物的下游引物：5′- GGAGTCGTAGATGGCTCGTGTG -3′；
油菜内源基因PEP内、外引物：
PEP的外引物的上游引物：5′- CAGTTCTTGGAGCCGCTTGAG -3′；
PEP的外引物的下游引物：5′- TGACGGATGTCGAGCTTCACA -3′；
PEP的内引物的上游引物：5′- AGACAGACCTACAGCCGATGGAA -3′；
PEP的内引物的下游引物：5′- AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA -3′；
大豆内源基因Lectin内、外引物：
Lectin的外引物的上游引物：5′- AGTCGTCGCTGTTGAGTTTGA -3′；
Lectin的外引物的下游引物：5′- ACCCACTCGGGAAGAGAAGTC -3′；
Lectin的内引物的上游引物：5′- TGCCTCCACCAGCCTCTT -3′；
Lectin的内引物的下游引物：5′- AGTCTTCAAATCGACCACATCG -3′；
棉花内源基因Sad1内、外引物：
Sad1的外引物的上游引物：5′- CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA -3′；
Sad1的外引物的下游引物：5′- TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC -3′；
Sad1的内引物的上游引物：5′- TGCCTGTTCAGATCACCCACT -3′；
Sad1的内引物的下游引物：5′- GCCCAGCCCTCCAAAGATTTA -3′；
水稻内源基因SPS内、外引物：
SPS的外引物的上游引物：5′- TCCAGAGAGCCCCGAACTC -3′；
SPS的外引物的下游引物：5′- AGGAGAAGCACTGGACGAGG -3′；
SPS的内引物的上游引物：5′- AGCCCCGAACTCCTCCAAA -3′；
SPS的内引物的下游引物：5′- GGACGAGGAGAGAGAGGATGAG -3′；
转基因玉米NK603品系特异性内、外引物：
NK603的外引物的上游引物：5′- CGGCCAGCAAGCCTTGTAG-3′；
NK603的外引物的下游引物：5′- TTTGGACTATCCCGACTCTCTTC -3′；
NK603的内引物的上游引物：5′- CGGCCAGCAAGCCTTGTAG -3′；
NK603的内引物的下游引物：5′- TCAAGCATATGAATGACCTCGA -3′；
转基因玉米BT11品系特异性内、外引物：
BT11的外引物的上游引物：5′- CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT -3′；
BT11的外引物的下游引物：5′- GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT -3′；
BT11的内引物的上游引物：5′- CCTTCTTGGCGGCTTATCT -3′；
BT11的内引物的下游引物：5′- CATGTCGAGATCCGAGGGA -3′；
转基因玉米MON810品系特异性内、外引物：
MON810的外引物的上游引物：5′- AACGTGCCCGGTACTGGTTC -3′；
MON810的外引物的下游引物：5′- GACTGCTCGCAAGCAAATTC -3′；
MON810的内引物的上游引物：5′- CCACAGCCACCACTTCTCC -3′；
MON810的内引物的下游引物：5′- GCAAGCAAATTCGGAAATGAA -3′；
转基因玉米MON88017品系特异性内、外引物：
MON88017的外引物的上游引物：5′-AGCAGCAGAATCGTGTGACAAC -3′；
MON88017的外引物的下游引物：5′- TTTCCCGGACATGAAGCCAT -3′；
MON88017的内引物的上游引物：5′- CACATCATCGACAAGCACCTT -3′；
MON88017的内引物的下游引物：5′- CGGACATGAAGCCATTTACAAT -3′；
转基因玉米T25品系特异性内、外引物：
T25的外引物的上游引物：5′- ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC -3′；
T25的外引物的下游引物：5′- GACATGATACTCCTTCCACCG -3′；
T25的内引物的上游引物：5′- ATTGCCCTTTGGTCTTCTGA -3′；
T25的内引物的下游引物：5′- CAATGGCGGAACGACTCAA -3′；
转基因玉米TC1507品系特异性内、外引物：
TC1507的外引物的上游引物：5′- TTGACAGGTTTGAGTTGATTCCAG -3′；
TC1507的外引物的下游引物：5′- CCAAGAACTCATGTTAGTCGCAA -3′；
TC1507的内引物的上游引物：5′- AGTTGATTCCAGTTACTGCCACA -3′；
TC1507的内引物的下游引物：5′- CATGTTAGTCGCAACGAAACC -3′；
转基因大豆305423品系特异性内、外引物：
305423的外引物的上游引物：5′-CGTCAGGAATAAAGGAAGTACAGTA -3′；
305423的外引物的下游引物：5′- CAACCAAATGCCCTAAAGGATGCGT -3′；
305423的内引物的上游引物：5′- GTTGATTCCAGTTACTGCCACA -3′；
305423的内引物的下游引物：5′- CATGTTAGTCGCAACGAAACC -3′；
转基因大豆FG72品系特异性内、外引物：
FG72的外引物的上游引物：5′- AGATTTGATCGGGCTGCAGG -3′；
FG72的外引物的下游引物：5′- GCACGTATTGATGACCGCATTA -3′；
FG72的内引物的上游引物：5′- AGATTTGATCGGGCTGCAGG -3′；
FG72的内引物的下游引物：5′- GCACGTATTGATGACCGCATTA -3′；
转基因大豆A2704-12品系特异性内、外引物：
A2704-12的外引物的上游引物：5′- GGGCGTTCGTAGTGACTGAG -3′；
A2704-12的外引物的下游引物：5′- GCGTTACCCAACTTAATCGC -3′；
A2704-12的内引物的上游引物：5′- GGGGTCAAAGACCAAGAAGTG -3′；
A2704-12的内引物的下游引物：5′- GCTGGCGTAATAGCGAAGAG -3′；
转基因油菜RT73品系特异性内、外引物：
RT73的外引物的上游引物：5′- CCATATTGACCATCATACTCATTGCT -3′；
RT73的外引物的下游引物：5′- GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA -3′；
RT73的内引物的上游引物：5′- TAGATTTCCCGGACATGAAGA -3′；
RT73的内引物的下游引物：5′- AGGAAGGAAAGGCAAGGAAA -3′；
转基因棉花GHB119品系特异性内、外引物：
GHB119的外引物的上游引物：5′-CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA -3′；
GHB119的外引物的下游引物：5′- GAAATTGCGTGACTCAAATTCC -3′；
GHB119的内引物的上游引物：5′-CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA -3′；
GHB119的内引物的下游引物：5′- GAAATTGCGTGACTCAAATTCC -3′；
转基因水稻BT63品系特异性内、外引物：
BT63的外引物的上游引物：5′- CGGCCATTGATTTGTAGAGA -3′；
BT63的外引物的下游引物：5′- ATATGTTCGTAGCCCCACCACTA -3′；
BT63的内引物的上游引物：5′- CGGCCATTGATTTGTAGAGA -3′；
BT63的内引物的下游引物：5′- AGCCCCACCACTACTGCTTAT -3′；
Cry1Ab基因内、外引物：
Cry1Ab的外引物的上游引物：5′- GGACAACAACCCMAACATCAAC -3′；
Cry1Ab的外引物的下游引物：5′- GCACGAACTCGCTCAGCAG -3′；
Cry1Ab的内引物的上游引物：5′- CAACGAGTGCATCCCCTACAAC -3′；
Cry1Ab的内引物的下游引物：5′- GCTGATGTCGATGGGGGTGT -3′；
PAT基因内、外引物：
pat的外引物的上游引物：5′- AAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT -3′；
pat的外引物的下游引物：5′- GATGCCTATGTGACACGTAAACAGTAC -3′；
pat的内引物的上游引物：5′- GTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT -3′；
pat的内引物的下游引物：5′- TGTCCAATCGTAAGCGTTCCTA -3′；
GOX基因内、外引物：
Gox的外引物的上游引物：5′- GTCTTCGTGTTGCTGGAACCGTT -3′；
Gox的外引物的下游引物：5′- GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT -3′；
Gox的内引物的上游引物：5′- ACCGTTGAGTTCGCTGGTC -3′；
Gox的内引物的下游引物：5′- AGAACGTGAGCACCCTTCC -3′；
EPSPS基因内、外引物：
EPSPS的外引物的上游引物：5′- GTTGCGGCCCTGCTTGT -3′；
EPSPS的外引物的下游引物：5′- CAGCGTGGAGGAGCGAAC -3′；
EPSPS的内引物的上游引物：5′- CCGACATCGAAGTCATCAACC -3′；
EPSPS的内引物的下游引物：5′- CAGCGTGGAGGAGCGAAC -3′；
CaMV35S基因内、外引物：
CaMV35S的外引物的上游引物：5′-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3′；
CaMV35S的外引物的下游引物：5′-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3′；
CaMV35S的内引物的上游引物：5′- TCTCCACTGACGTAAGGGATGA -3′；
CaMV35S的内引物的下游引物：5′- GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG -3′；
NOS基因内、外引物：
NOS的外引物的上游引物：5′- TGCCGGTCTTGCGATGA -3′；
NOS的外引物的下游引物：5′- AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC -3′；
NOS的内引物的上游引物：5′- TGCCGGTCTTGCGATGA -3′；
NOS的内引物的下游引物：5′- CCCATCTCATAAATAACGTCATGC -3′；
FMV35S基因内、外引物：
FMV35S的外引物的上游引物：5′-CTAGTACAAGTGGGGAACAAAATAACG-3′；
FMV35S的外引物的下游引物：5′-ATCTGATGATCCTTCAAATGGGAATGA-3′；
FMV35S的内引物的上游引物：5′- TCCTGACAGCCCACTCACTAA -3′；
FMV35S的内引物的下游引物：5′- AGGGAATTCTTTTGTGGTCGT -3′；
NPTII基因内、外引物：
NPTII的外引物的上游引物：5′- GGAAGGGACTGGCTGCTATTG -3′；
NPTII的外引物的下游引物：5′- GATGTTTCGCTTGGTGGTCG -3′；
NPTII的内引物的上游引物：5′- CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA -3′；
NPTII的内引物的下游引物：5′- GGTAGCCGGATCAAGCGTATG -3′；
bar基因内、外引物：
Bar的外引物的上游引物：5′- GCAACGCCTACGACTGGAC -3′；
Bar的外引物的下游引物：5′- TGACAGCGACCACGCTCTT -3′；
Bar的内引物的上游引物：5′- TCGACCGTGTACGTCTCCC -3′；
Bar的内引物的下游引物：5′- CTGTGCCTCCAGGGACTTCA -3′；
步骤（3）中的PCR反应体系为25μL：SYBR® Premix DimerEraser反应液12.5μL，引物终浓度各为0.4μmol/L，模板1μL，用ddH2O补足； PCR反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃30 s，72℃ 30 s，40个循环。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）获得的扩增产物用ddH2O稀释100倍后作为模板。
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