CN104830857A - 转基因玉米mon88017品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 - Google Patents

转基因玉米mon88017品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量分析方法，具体是指转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物序列Event MON88017-Forward、下游引物序列Event MON88017-Reverse、荧光探针序列Event MON88017-Probe、MON88017品系的DNA稀释液以及Taqman Master mix（2×）和水配制成PCR反应体系，进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含转基因MON88017品系生物成分检测。

Description

转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测的引物和探针及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量的分析方法。
背景技术
国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，同时弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系，更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，建立一种新型转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法已成为必要。
目前关于转基因玉米MON88017的检测技术，主要集中在普通定性PCR分析方法，尚无关于扩增检测转基因玉米MON88017及产品的品系特异性某特定位点(基因序列)的高灵敏度定量PCR精准检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高和灵敏度高的检测转基因玉米MON88017及产品的品系特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。
本发明通过下述技术方案实现：
转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测的引物和探针，
其中，
上游引物序列：Event MON88017-Forward：5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
下游引物序列：Event MON88017-Reverse：5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3'；
荧光探针序列：
Event MON88017-Probe：5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3'。
转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法，包括以下步骤：
(1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列：Event MON88017-Forward：5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
下游引物序列：Event MON88017-Reverse：5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3'；
荧光探针序列：
Event MON88017-Probe：5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3'；
(2)制备MON88017品系的DNA稀释液；
(3)配制PCR反应体系；
(4)定量PCR检测。
进一步地，步骤(1)所述合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
再进一步地，步骤(3)所述的配制PCR反应体系，即将3μl的DNA稀释液加入到反应体系中，所得的反应体系包括以下组分：
另外，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；
(2)本发明弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系；
(3)本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权；
(4)本发明扩增效率高、准确度高。
附图说明
图1为本发明的特异性检测图谱。
图2为本发明的灵敏度扩增图。
图3为本发明在97.5％置信水平下灵敏度实验扩增图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法，主要包括以下步骤：
(1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列：Event MON88017-Forward：5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
下游引物序列：Event MON88017-Reverse：5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3'；
荧光探针序列：
Event MON88017-Probe：5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3'。
本实施例引物及荧光探针的合成浓度均为10μmol/l。
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米MON88017及产品的品系特异性某特定位点，即目的基因与受体玉米基因组旁侧位点设计；通过该设计就可以精准检测转基因玉米中MON88017的转化事件。
(2)制备MON88017品系的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米MON88017中提取出浓度为50ng/μl的DNA稀释液。
(3)配制PCR反应体系；即将3μl制备好的DNA稀释液加入反应体系中即可。
以上反应体系包括以下组分：
(4)定量PCR检测。
根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。
对本实施例的方法数据连续重复做29个平行样品，对该29个样品进行了检测，其检测数据如表1。
表1
采用本发明能够精准检测转基因玉米中MON88017转化事件及其含量，获得标准曲线斜率，在-3.6～-3.1之间，相关系数大于0.99，扩增效率为104.197％，在90％～110％的范围内。待检样品的定量检测结果(1.541％)非常接近真实值(1.5％)，检测结果的相对偏差(2.7％)小于国际认可的25％，检测结果的不确定度小于5％。
另外，本发明的特异性检测图谱如图1所示，采用本发明设计的引物和探针检测转基因玉米非MON88017品系、转基因水稻、转基因大豆、转基因油菜以及非转基因玉米、水稻、油菜、大豆(图中水平曲线)和转基因玉米MON88017品系试验材料，只有转基因玉米MON88017品系材料被检出(图中斜向上的曲线)。
结果表明，只有转基因玉米MON88017样品中能收集到检测的荧光信号，而空白对照和其他样品中均未能收集到荧光信号，显示本发明的引物探针序列特异性非常高。
对本发明的灵敏度检测数据如表2。
表2
上述检测结果也可见图2所示。
97.5％置信水平下MON88017玉米品系灵敏度(检测下限5copies)实验数据如表3。
表3
试验次数 Ct值
1 38.30135
2 38.22563
3 39.14856
4 36.62408
5 39.20158
6 38.10036
7 39.35188
8 37.86245
9 37.77774
10 36.87487
11 39.18285
12 39.14905
13 35.56659
14 36.16182
15 37.10299
16 37.29623
17 37.9017
18 38.01934
19 36.72259
20 37.18439
21 38.80519
22 36.95868
23 39.82681
24 37.97231
25 40.14629
26 37.59507
27 39.12237
28 37.7853
29 36.65046
30 37.22565
31 39.26849
32 38.33007
33 38.21866
34 37.19111
35 37.18439
36 38.80519
37 -----
38 39.82681
39 37.97231
40 40.14629
如图3所示，97.5％置信水平下灵敏度实验扩增图：利用本发明40次重复检测反应体系中含有的5copies的MON88017品系DNA片段，共39次试验检测出MON88017品系DNA片段，其中仅1次未能检测到5copies的MON88017品系DNA片段(第37次，见表3)。
值得说明的是附图中△Rn代表荧光原始信号减去背景信号的值。
由以上检测结果可得知，本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方法的范围，本发明的扩增效率高、准确度高。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  四川省农业科学院分析测试中心
 
<120>  转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测的引物和探针及方法
 
<130> 
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  上游引物（Event MON88017-Forward）
 
<400>  1
cgctagcagc tctcctccaa                                       20
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  下游引物（Event MON88017-Reverse）
 
<400>  2
ccggacatga agccatttac a                                     21
 
 
<210>  3
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  荧光探针（Event MON88017-Probe）
 
<400>  3
cttttttgcc ggagtatgac ggtgacg                               27
 

Claims (5)

1. 转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测的引物和探针，其特征在于,
上游引物序列：Event MON88017-Forward：5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
下游引物序列：Event MON88017-Reverse：5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3'；
荧光探针序列：
Event MON88017-Probe：5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3'。
2. 转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于,包括以下步骤：
（1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列：Event MON88017-Forward：5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
下游引物序列：Event MON88017-Reverse：5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3'；
荧光探针序列：
Event MON88017-Probe：5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3'；
（2）制备MON88017品系的DNA稀释液；
（3）配制PCR反应体系；
（4）定量PCR检测。
3. 根据权利要求2所述的转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（1）所述合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤（2）所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
4. 根据权利要求3所述的转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（3）所述的配制PCR反应体系，即将3μl的DNA稀释液加入到反应体系中，所得的反应体系包括以下组分：
2×Taqman Master mix                     12.5μl
上游引物                                 1μl
下游引物                                 1μl
荧光探针                                 0.8μl
DNA稀释液                                3.0μl
水                                       6.7μl。
5. 根据权利要求2或4所述的转基因玉米MON88017品系特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
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