CN103555844B - 一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶液；（5）探针溶液；（6）无菌水。本试剂盒对甘蔗赤条病菌的检测有高度的特异性，与其他植物病菌无交叉反应；检测的灵敏度达100拷贝，可直接用于甘蔗植株、脱毒种苗等样本的定量检测甘蔗赤条病菌；利用本发明试剂盒检测快速简单，准确性好，灵敏度高，检测结果可靠稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测植物病菌的PCR试剂盒，具体涉及一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，属微生物检测领域。
背景技术
甘蔗赤条病（Sugarcane red stripe disease）是一种普遍发生的细菌性病害，几乎在主要甘蔗种植国家均有发生，我国甘蔗赤条病在几个种植甘蔗的省（区）都有零星发生。甘蔗赤条病菌被认为是红条纹假单胞菌Pseudomonas rubrilineans （Lee et al.） Stapp引起，其形态特征为无芽孢，呈杆状，大小为0.7 × 1.6 μm，有单根极生鞭毛，有薄荚膜，革兰氏染色反应为阴性。1992年Willems等将红条纹假单胞菌重新命名为燕麦噬酸菌燕麦亚种（Acidovorax avenae subsp. Avenae）。Zia-ul-Hussnain等（2011）从巴基斯坦甘蔗赤条病株上分离得到了燕麦噬酸菌燕麦亚种病菌，并对该病菌的菌体形态、培养性状、生理生化反应作了研究。燕麦噬酸菌燕麦亚种病菌其寄主范围除甘蔗外，还有水稻、玉米、铺地黍等禾本科的一些植物。病害有叶条斑和顶腐两种类型。两者可以单独发生，亦可并发。在潮湿温暖的条件下容易发病，而且病叶的伤痕表面常有细菌溢泌物，借助雨水和气流传播。患病的枯老蔗叶、病茎中的病原菌经4个月后仍然有致病力。因此建立甘蔗赤条病菌的快速、准确、灵敏的检测技术，对该病的防治起到十分关键的作用。
常用的检测病菌的方法有生物学鉴定法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。生物学鉴定法耗时、且步骤繁琐；电镜技术需要植物组织切片，步骤繁琐，且只能通过形态学观察判断；酶联免疫技术需要特异性的抗血清，且灵敏度不及分子检测技术；基于PCR原理的分子生物学技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，在其它甘蔗病原物的检测已得到广泛应用。目前，检测甘蔗赤条病菌燕麦噬酸菌燕麦亚种的荧光定量PCR试剂盒及其方法未见报道。
本发明在分离获得甘蔗赤条病菌，克隆测序病菌基因组核糖体rDNA序列基础上，选择甘蔗赤条病菌16S-23S rDNA间隔区序列（ITS），设计用于荧光定量PCR检测的引物及探针，通过对反应体系的优化，研制用于检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒及方法，为我国甘蔗科研、检疫、质检等部门提供快速、灵敏、准确的病害检测试剂盒产品和技术服务。
发明内容
本发明目的是提供一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒能快速准确的对待测样品的甘蔗赤条病菌进行定量检测。该试剂盒不仅可使用于目前市场上的所有类型荧光定量PCR仪，而且能够灵敏、特异的对甘蔗赤条病菌进行定量检测。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明采用Taqman探针建立荧光定量PCR检测甘蔗赤条病菌试剂盒，通过制备病菌DNA标准样品与待测样品同时检测，得到待测样品的初始病菌拷贝数，对病菌进行定量检测。
本发明提供了一种利用荧光定量PCR方法检测甘蔗赤条病菌的引物对QPCR-F5、QPCR-R5和Taqman探针QPCR-P5，所述的引物对序列如下：
QPCR-F5：5’-TCATCCTCCACCAACCAATA-3’，
QPCR-R5：5’-TACCGGACCAACAACAAAGA-3’；
Taqman探针QPCR-P5的序列如下：
5’-FAM-CACCAAAGCGGCTTCGCAAG-TAMRA-3’。
本发明还提供一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：
（1）阳性标准品：采用常规PCR扩增含有16S-23S rDNA间隔区的DNA作为标准样品，1×1010拷贝/μL，50 μL/瓶，-20℃冷冻保存；
（2）阴性对照：采用无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总DNA为阴性对照，100 ng/μL，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用；
（3）PCR反应液：每个反应包括5×PCR缓冲液5.0 μL、10 mmol dNTPs 0.5 μL、25 mmol MgCl2 2.0 μL以及浓度为10 μmol/L的引物对 QPCR-F5和QPCR-R5各2.0 μL，共11.5 μL，50个反应体系共计575 μL，-20 ℃保存备用；
（4）Ex Taq酶：每个反应体系包括5 U/μL Ex Taq酶0.5μL，50个反应体系共计25 μL，-20℃保存备用；
（5）探针溶液：Taqman探针QPCR-P5采用5’-FAM和3’-TAMRA修饰，合成后采用无菌水稀释，浓度为10 μmol/L，每个反应体系0.4 μL，50个反应体系共计20 μL，-20℃保存备用；
（6）无菌水：2×10 mL/瓶。
本发明的优点和有益效果主要体现在：本试剂盒对甘蔗赤条病菌的检测有高度的特异性，与其他甘蔗病菌无交叉反应；检测的灵敏度达100拷贝，可以在甘蔗田间样品和脱毒种苗等样本中检测甘蔗赤条病菌；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，从样品病菌核酸提取至完成检测，耗时2~3小时。
附图说明
图1是甘蔗赤条病菌DNA标准品荧光定量PCR的动力学曲线。图中横坐标代表荧光定量PCR扩增循环数，纵坐标代表荧光信号强度，扩增曲线分别是DNA标准品1×108拷贝/μL、1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×102和1×101拷贝/μL。
图2是甘蔗赤条病菌DNA标准品荧光定量PCR的标准曲线。横坐标x代表标准品拷贝数的对数值，纵坐标y代表PCR扩增循环数；y= -3.2167x+39.785；R代表相关系数，决定系数R2=0.9998。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1 一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，包括Taqman探针QPCR-P5和引物对QPCR-F5、QPCR-R5，其中Taqman探针QPCR-P5序列为5’- CACCAAAGCGGCTTCGCAAG -3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰；引物对QPCR-F5和QPCR-R5序列为5’- TCATCCTCCACCAACCAATA -3’和5’- TACCGGACCAACAACAAAGA -3’；该试剂盒包括下列试剂：
（1）阳性标准品：以16S-F3（5’-ACTGCGTGAAGTCGGAATC-3’）和23S-R1（5’-TCGGAATCTCGGTTGATG-3’）为引物，利用常规PCR方法扩增获得甘蔗赤条病菌16S-23S rDNA间隔区序列（ITS）片段，PCR产物纯化后作为甘蔗赤条病菌DNA标准样品。用核酸蛋白分析仪测定PCR产物DNA浓度后，稀释为100 ng/μL，PCR产物片段大小为1070 bp，根据公式计算DNA标准样品的拷贝数为8.52×1010拷贝/μL，并稀释成标准样品1×1010拷贝/μL，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存。
（2）阴性对照：采用无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总DNA为阴性对照，用核酸蛋白分析仪测定提取的总DNA浓度，并稀释成浓度为100 ng/μL作为阴性样品，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用。
（3）无菌水：2×10 mL/瓶。
（4）PCR反应液：每个反应包括5×PCR缓冲液5.0 μL、10 mmol dNTPs 0.5 μL、25 mmol MgCl2 2.0 μL以及浓度为10 μmol/L的引物对 QPCR-F5和QPCR-R5各2.0 μL，共11.5 μL，50个反应体系共计575 μL，-20 ℃保存备用；
（5）Ex Taq酶：每个反应体系包括5 U/μL Ex Taq酶0.5μL，50个反应体系共计25 μL，-20℃保存备用；
（6）探针溶液：Taqman探针QPCR-P5采用5’-FAM和3’-TAMRA修饰，合成后采用无菌水稀释，浓度为10 μmol/L，每个反应体系0.4 μL，50个反应体系共计20 μL，-20℃保存备用。
实施例2 甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒检测应用
1）标准品DNA稀释：将甘蔗赤条病菌DNA标准品用无菌水按10倍稀释成1×108~1×101拷贝/μL的一系列DNA标准品。
2）标准曲线方程建立
以此稀释后DNA标准品为模板，每个标准样品处理重复3次。并以无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片总DNA为阴性对照，以无菌水为空白对照。按上述试剂盒内组分，荧光定量PCR反应总体系为25 μL，包括PCR反应液11.5 μL，反应酶混合液0.5 μL，探针溶液0.4 μL，标准样品DNA 1.0 μL，无菌水补至25 μL；然后放于ABI公司7500定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增。扩增程序为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，在60 ℃进行单点荧光检测。获得如图1所示的扩增曲线，然后绘制如图2所示的标准曲线，构建标准曲线方程。本实施例构建的标准曲线方程为Y=-3.2167x+39.785，决定系数R2为0.9998，扩增效率为104.58 %，满足荧光定量PCR正常的标准曲线要求。检测灵敏度可10拷贝/μL。将荧光定量PCR方法获得产物用常规电泳检测，只能检测到104 拷贝/μL，比常规的PCR检测灵敏度至少高100倍。
3）待测样品DNA提取：采用CTAB法提取几份待测甘蔗叶片DNA，在核酸蛋白分析仪上测定DNA的光吸收值，计算提取的DNA浓度，然后统一稀释成100 ng/μL。
4）荧光定量PCR扩增：以待测样品的RNA为模板，荧光定量PCR反应总体系和扩增程序同上述标准曲线方程建立。在ABI公司7500定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增，获得待测样品的甘蔗赤条病菌标准品荧光定量PCR的动力学曲线。将待测样品的Ct值代入标准曲线方程转化成初始病菌分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个甘蔗赤条病菌，从而定量分析甘蔗样品中感染甘蔗赤条病菌的数量，结果如表1所示。检测结果表明，具有典型甘蔗赤条病症状的福农38号、福农1110这2个田间样品证实感染了甘蔗赤条病菌，病菌含量达105拷贝/μL；没有甘蔗赤条病症状的新台糖25、德宏06-24这2个田间样品没有检测出甘蔗赤条病菌。为了进一步证实福农38号、福农1110感染的病菌是否为甘蔗赤条病菌，我们将荧光定量PCR产物进行克隆和测序，核苷酸序列提交http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/比对，结果证实是甘蔗赤条病菌，属于燕麦噬酸菌燕麦亚种（Acidovorax avenae subsp. Avenae）。本发明建立的检测甘蔗赤条病菌荧光定量PCR方法具有很好的重复性，同一样品的Ct值变异系数小于1 %。
利用本发明的Taqman探针荧光定量PCR试剂盒进行检测时，可以准确快速的得到样品的甘蔗赤条病菌初始拷贝数，可以应用于甘蔗田间样品检测、脱毒种苗质量监控和甘蔗抗性鉴定。
表1 待测样品Ct值及稳定性
SEQUENCE LISTING
序 列 表
<110> 福建农林大学
<120> 一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcatcctcca ccaaccaata 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taccggacca acaacaaaga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列3
<400> 3
caccaaagcg gcttcgcaag 20
Claims (2)
1.一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，包括Taqman探针QPCR-P5和引物对QPCR-F5、QPCR-R5，其中Taqman探针QPCR-P5序列为5’- CACCAAAGCGGCTTCGCAAG -3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰；引物对QPCR-F5和QPCR-R5序列为5’- TCATCCTCCACCAACCAATA -3’和5’- TACCGGACCAACAACAAAGA -3’。
2.一种如权利要求1所述的检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：
（1）阳性标准品：采用常规PCR扩增含有16S-23S rDNA间隔区的DNA作为标准样品，1×1010拷贝/μL，50 μL/瓶，-20℃冷冻保存；
（2）阴性对照：采用无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总DNA为阴性对照，100 ng/μL，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用；
（3）PCR反应液：每个反应包括5×PCR缓冲液5.0μL、10 mmol dNTPs 0.5 μL、25 mmol MgCl2 2.0 μL，以及浓度为10 μmol/L的QPCR-F5和QPCR-R5各2.0 μL，共11.5 μL，50个反应体系共计575 μL，-20 ℃保存备用；
（4）Ex Taq酶：每个反应体系包括5 U/μL Ex Taq酶0.5 μL，50个反应体系共计25 μL，-20℃保存备用；
（5）探针溶液： Taqman探针QPCR-P5，采用5’-FAM和3’-TAMRA修饰，合成后采用无菌水稀释，浓度为10 μmol/L，每个反应体系0.4 μL，50个反应体系共计20 μL，-20℃保存备用；
（6）无菌水：2×10 mL/瓶。
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| US6146834A (en) * | 1999-09-10 | 2000-11-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | PCR primers for detection of plant pathogenic species and subspecies of acidovorax |
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| Use of peR for Rapid Identification of Acidovorax avenae and A. avenae subsp. citrulli;W.Y. SONG et al;《Pseudomonas syringae and Related Pathogens》;20031231;第531－544页 * |
| W.Y. SONG et al.Use of peR for Rapid Identification of Acidovorax avenae and A. avenae subsp. citrulli.《Pseudomonas syringae and Related Pathogens》.2003,第531－544页. * |
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