CN102312016A

CN102312016A - 一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量pcr方法

Info

Publication number: CN102312016A
Application number: CN201110316557A
Authority: CN
Inventors: 王恒波; 郭晋隆; 许莉萍; 高三基; 陈如凯; 陈平华
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: CN102312016B

Abstract

本发明首先提供了一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗宿根矮化病菌的引物及探针，所述的引物为以下序列的引物对：正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探针序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA。以上面提供的引物对与探针在实时荧光定量PCR仪中检测甘蔗中感染的宿根矮化病菌Pat1基因。通过PCR扩增过程生成的Ct值，利用已经建好的标准曲线将Ct值转换成起始反应的核酸分子拷贝数，从而达到定量检测甘蔗中感染宿根矮化病菌的数量。该方法可应用于甘蔗健康种苗检测、甘蔗抗性鉴定方面。

Description

一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法

技术领域

本发明涉及甘蔗健康种苗与甘蔗抗性鉴定分子生物学技术领域，特别是甘蔗宿根矮化病菌的检测引物和定量PCR检测方法。

背景技术

甘蔗宿根矮化病（ratoon stuning disease, RSD）是世界各甘蔗种植区普遍发生的一种细菌性病害。该病是由一种棒杆细菌Leifsonia xyli subsp.xyli寄生于蔗株的维管束中引起，主要通过带病蔗种和收获时砍种刀具相互传播，在一定时期内，部分通过土壤传播。Davis等研究表明，该菌不易分离培养，为革兰氏阳性杆状细菌，由于该病没有明显的外部和内部症状，仅仅从外观上难以鉴定，特别严重时才会表现蔗株矮化、纤细、分蘖减少、生长慢等症状，且蔗株矮化会随甘蔗宿根年限的延长而加重。甘蔗宿根矮化病一般造成减产10%-30%，干旱缺水时可达60%以上，而且还能导致品种种性退化。近年来，随着国内外甘蔗育种单位之间的相互引种、国内各蔗区间的频繁调种以及农业机械化的推进，RSD迅速蔓延。

目前，由于甘蔗宿根矮化病菌尚没有有效化学防治方法，同时缺乏抗性材料，甘蔗抗RSD育种进程缓慢。当前最有效的控制手段就是普及种植甘蔗健康种苗，甘蔗健康种苗的主要目的就是去除甘蔗易受感染的病毒病与细菌性病害，其中包括甘蔗宿根矮化病。如何快速准确的鉴定甘蔗健康种苗是否含有RSD菌是目前甘蔗健康种苗生产必备的关键技术。目前，宿根矮化病的常规检测均是对甘蔗蔗汁直接进行检测，方法主要有显微镜技术、电视差显微镜技术、血清学技术和常规PCR等。但是前两种方法都存在需要样品量多、操作复杂、检测耗时长、灵敏度不高等缺点，在实际中很难应用；血清学技术虽然可以克服前两者所存在的缺点，实现高通量检测，但相对于定量PCR而言，检测灵敏度不高；而常规PCR技术只能终点定量，无法对病原菌初始浓度进行准确定量。因此，为了保证国家的甘蔗健康种苗生产计划的顺利进行，提高我国甘蔗生产技术水平，迫切需要建立一种简便、快速、准确、灵敏的检测宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测宿根矮化病病菌方法中不能定量病原菌数量、准确性差、且费时、费力的问题，而提供了一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗宿根矮化病菌的引物及探针，所述的引物为以下序列的引物对：正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探针序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA。

本发明还提供了一种检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

（1）宿根矮化病病菌的Pat1基因片段的克隆及标准曲线绘制：以宿根矮化病致病菌DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，切胶纯化，连接到PMD18-T载体上，选择阳性克隆，提取质粒DNA，得到宿根矮化病菌的Pat1基因，测定质粒DNA的吸光值，并将吸光值转化成质粒DNA的浓度，再将质粒DNA的浓度转化成为拷贝数，进行梯度稀释，并以稀释后的质粒DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，构建标准曲线方程；

（2）以待测样品蔗汁DNA为模板，用所述引物与探针进行实时荧光定量PCR扩增，通过将产生的的Ct值代入标准曲线方程转化成起始反应的DNA分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个白条病菌，从而定量检测甘蔗样品中感染宿根矮化病菌的数量。

所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为25 μL：2×TaqMan Universal Master Mix 12.5 μL；10 μmol/L正向引物与反向引物各0.75 μL；10 μmol/L探针0.4 μL；DNA模板1.0 μL；补水至25 μL。

所述实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：50 ℃，2 min，预变性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，退火延伸，1 min，40个循环，在60℃进行单点荧光检测。

为了保证定量检测的准确性，因此在设计引物与探针时选择该病原菌所特异致病基因Pat1，然后将该序列在NCBI进行序列比对，该基因为宿根矮化病菌所特异性基因，与其他生物基因没有显著的同源性。

本发明提供的用于检测宿根矮化病菌的方法为：以上面提供的引物对与探针在实时荧光定量PCR仪中检测甘蔗中感染的宿根矮化病菌Pat1基因。通过仪器检测PCR扩增过程中产生的荧光信号，即生成Ct值，然后利用已经建好的标准曲线将Ct值转换成起始反应的核酸分子拷贝数，从而达到定量检测甘蔗中感染宿根矮化病菌的数量。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明首次根据宿根矮化病病菌的致病基因Pat1设计特异性引物与探针；

2、本发明首次在宿根矮化病菌的检测上利用定量PCR法构建标准曲线方程，计算甘蔗样品中感染的宿根矮化病菌数量；

3、本发明首次将宿根矮化病菌实时荧光定量PCR方法应用于甘蔗健康种苗检测、甘蔗抗性鉴定方面。

附图说明

图1 为宿根矮化病菌Pat1基因实时荧光定量PCR反应的标准曲线；横坐标代表循环数Ct值；纵坐标代表荧光信号强度；

图2为宿根矮化病致病菌的标准曲线方程；横坐标代表起始拷贝数；纵坐标代表循环数Ct值。

具体实施方式

以下使用的各种生化试剂均来自生工生物工程（上海）有限公司，PCR相关试剂来自ABI 公司，PMD18-T载体、引物与探针合成都来自TAKARA宝生物工程（大连）有限公司，测序完成于南京金斯瑞生物有限公司。

实施例1

采用CTAB法提取宿根矮化病致病菌Leifsonia xyli subsp.xyli（现保存于福建农林大学甘蔗综合研究所，甘蔗宿根矮化病致病菌的分离方法为Y.-B. Pan提供）的DNA，以该DNA模板，利用上述引物进行定性PCR扩增，采用Eppendorf Mastercycler EP PCR热循环仪5333型基因扩增仪。25 μL PCR反应体系组成: 10×PCR Buffer(Mg²⁺) 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，ExTaq酶（5U/μL）0.125 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，加灭菌双蒸水使总体积为17.375。PCR扩增条件: 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 S，56 ℃ 30 S，72 ℃ 30 S，35个循环；最后72 ℃延伸7 min后4 ℃保存备用。反应结束后将所得PCR产物用于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并进行胶回收纯化，连接到PMD18-T载体上，选择阳性克隆，提取质粒DNA，送测序公司进行测序，测序完成后将所得到测序结果Blast比对，结果正常后，继续将质粒DNA采用紫外分光光度计在260 nm测定吸光度值。然后根据公式（DNA样品浓度（ug/ml）＝OD₂₆₀×50×稀释倍数）将吸光度值转换成质粒DNA浓度。再根据以下公式将质粒DNA浓度转化为拷贝数。

MW = 碱基数x 660 dalton/bp

(6.02 x 10 ²³ x (浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

对于双链DNA，223 ng/μL 质粒DNA的3624 bp长度相当于 5.6 x10 10 copies/μL

纯化后的质粒DNA定量后，将该质粒DNA作为标准品，采用倍比梯度稀释法进行稀释，即1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii；1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii，以此类推，就得到标准品的拷贝数分别为为10⁸～10，分成8个标准样品处理，以此稀释后质粒DNA为模板，每个标准样品处理重复3次。分别检测大肠杆菌、Leifsonia ginsengi 和 Leifsonia poae菌DNA、以健康种苗的蔗汁DNA为阴性对照，以宿根矮化病致病菌DNA为阳性对照，以双蒸水为空白对照。

利用ABI 公司7500定量PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增，制作标准曲线，进而构建标准曲线方程。

将未知样品的Ct值带入标准曲线方程，对未知样品进行定量分析。采用ABI公司实时荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，反应体系包括：TaqMan Universal Master Mix (2×) 12.5 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL；TaqMan探针(10 μmol/L) 0.4 μL；DNA模板（1 μg/μL）1.0 μL；补水至25 μL，反应条件：50 ℃，2 min，预变性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，退火延伸，1 min，40个循环，在60℃进行单点荧光检测。

定量PCR扩增标准曲线如图1所示，反应结束后，利用软件将反应中的数据分析生成标准曲线方程（如图2），R²表示标准曲线相关系数，Slope 表示标准曲线斜率，Eficiency表示反应的扩增效率，Y-intercept表示Y轴的截距。正常的标准曲线应满足以下条件：R²﹥0.99，-3.5﹤slope﹤-3.0， 0.9﹤efficiency﹤1.2。本实施例构建的标准曲线方程为：R²为0.999， Slope为-3.335，Efficiency为99.45%，Y-intercept为39.945，Y=-3.335X+39.945。

附：甘蔗宿根矮化病致病菌的分离

一、采集病蔗

二、取病蔗下部，用刀把甘蔗表面的杂质、蜡粉刮干净，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗两遍。

多个样本要防止交叉污染，每处理一个样本，刀具都要冲洗干净，然后用酒精灯烧消毒。

以下过程都要严格按照无菌操作进行。

三、在超净台边将甘蔗砍成小段，表面喷洒酒精，放入超净台内，点火快速烧消毒两遍。

四、在超净台内用灭过菌的大剪刀或刀将甘蔗截成6cm左右的小段，放入50mL无菌离心管。

五、25℃，3500rpm离心15min。（注意配平，要求误差＜0.01g）

六、收集离心管底部的蔗汁，放入无菌的2mL离心管。

七、25℃，3000rpm离心5min。

八、取上清液放入无菌2mL离心管。

九、梯度稀释，做两个处理

处理1：取10个无菌的2mL离心管，编好号码，②—⑩号管分别加入0.9mL的PBS（1x，无菌）

① 管为无稀释的蔗汁，浓度为100；

② 管中加入0.1mL蔗汁，混匀，浓度为10^-1；

③ 管中加入0.1mL②管的溶液，混匀，浓度为10^-2；

④ 管中加入0.1mL③管的溶液，混匀，浓度为10^-3；

⑤ 管中加入0.1mL④管的溶液，混匀，浓度为10^-4；

⑥ 管中加入0.1mL⑤管的溶液，混匀，浓度为10^-5；

⑦ 管中加入0.1mL⑥管的溶液，混匀，浓度为10^-6；

⑧ 管中加入0.1mL⑦管的溶液，混匀，浓度为10^-7；

⑨ 管中加入0.1mL⑧管的溶液，混匀，浓度为10^-8；

⑩ 管中加入0.1mL⑨管的溶液，混匀，浓度为10^-9。

处理2：将上清液用0.45μm的滤膜过滤后再进行梯度稀释，稀释方法同处理1。

十、用移液枪将处理1和处理2各个梯度浓度的蔗汁点滴到平板培养基上，等蔗汁完全被培养基吸收后，用封口膜将培养皿封好。

十一、将培养皿放入培养箱中，28℃倒置培养28d。（由于RSD菌落很小，生长缓慢，若是在2周时间内有菌落出现，说明样品已经被污染）

实施例2

将2011年福建农林大学校内的国家第九轮甘蔗区域实验的甘蔗分别提取蔗汁DNA， 11个不同品种甘蔗有以下：YA05-179、柳城LC1、 YG35、 YG34 、ROC20、 FN36 、YZ05-5 、ROC22 、RC16、Y06-407、 LC03-1137。按照传统的核酸提取方法CTAB法，以纯化后的基因组DNA作为模板，利用ABI公司7500实时荧光定量PCR仪，采用本发明特异性的引物对与TaqMan探针进行PCR扩增。反应体系包括：TaqMan Universal Master Mix (2×) 12.5 μL；正反向引物(10 μmol/L)各0.75 μL；TaqMan探针(10 μmol/L) 0.40 μL；DNA模板1.0 μL；补水至25 μL，每个样品做3次重复。反应条件：50 ℃，2 min，预变性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，退火延伸，1 min，40个循环，在60℃进行单点荧光检测。然后导入已建立的标准曲线利用荧光定量PCR仪软件计算生成的Ct值，将Ct值导入标准曲线方程计算检测到核酸分子的拷贝数。

经过计算宿根矮化病菌在11个不同甘蔗品种中的数量分别为：YA05-179 为5.0×10⁴/mL、

柳城LC1为7.9×10⁴/mL、YG35为3.2×10⁴/mL、YG34为4.0×10³/mL、ROC20为5.0×10³/mL、FN36为1.6×10⁴/mL、而YZ05-5、LC03-1137、ROC22 、RC16 、Y06-407没有检测到宿根矮化病病原菌。

申请人采用本方法检测过多种其他病菌（包括大肠杆菌、Leifsonia ginsengi 和 Leifsonia poae菌DNA、以健康种苗的蔗汁DNA为阴性对照，以宿根矮化病菌DNA为阳性对照，以双蒸水为空白对照），分别进行上述引物与探针的特异性检测，结果发现该反应特异性强，其他待测菌株没有扩增曲线产生，检测结果如图1所示。

本发明的检测限为10个拷贝，检测在10⁸-10个拷贝数之间。

<110> 福建农林大学

<120> 一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

ggttccattg cttaccgatt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

caagtttcga caggaacagc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 3

ccacggctac gtcaattcgg g 21

<210> 4

<211> 942

<212> DNA

<213> 赖氏菌木质部亚种（Leifsonia xyli subsp．xyli）

<220>

<223> Pat1基因

<400> 4

ttgtttagtt ttcgttggcg tgttttacgt cgccgagcat cgatcgcggg tctcgtacta 60

gctttggtcg ccggcctggg ggtagccacc acagggcccg catccgcggt ccaacccatc 120

cgttcgggcc cgatgatcgt cgggggaacc gaactacaat tccccgggaa tacagaatgt 180

acggcaggtt tagtgatggt caatacccgt ttgtggaata acatcacggc gtaccagcgg 240

aatactcgct atgtgttgac cgcgggtcac tgcggaaatg taggtgaccg cgtgaaggtc 300

aacaacgtag atattggatg ggttagctgg aaaccagggc cacctgaccc tagcaggcca 360

cctggccctg gcaggccacc tggccctggc aggccacctc accctgtgat tccttaccct 420

gacatgatga tggttcaggt taagccgact gttaatacta cttttcattg ccataatgag 480

cgttccgggt tccattgctt accgatttat cacagcgccc cccgcgctgt cggccgggtc 540

ataacctacc aaccacggct acgtcaattc ggggctgttc ctgtcgaaac ttggcaggat 600

gacgtcccgg ataatgtgaa ctggttctgc acgagcggta tatccacgga tttcacctgt 660

ctctgggaaa aataccagca gctccctccc ggggttgata tcggccccta tcggaaggct 720

gcgcgcagtc tgagttctac tgcacctcca ggagattcgg gaggtccggt gttcagcgat 780

cccaacgcgg gtaacgctaa tccgaacggc gtcgctttct acggcatagt attgggccgt 840

ttcgctcccc cagccccgga aaatgccatg tattatctcc ctgctggggt tttcttcact 900

cagtgggagt ggggacaagc ttatgctgtg gctccagcat ag 942

Claims

1.一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗宿根矮化病菌的引物及探针，其特征在于：所述的引物为以下序列的引物对：正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探针序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA。

2.一种根据权利要求1所述的引物及探针检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为25μL：2×TaqMan Universal Master Mix 12.5μL；10μmol/L正向引物与反向引物各0.75μL；10μmol/L探针0.4μL；DNA模板1.0μL；补水至25μL。

4.根据权利要求2所述检测甘蔗宿根矮化病病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：50 ℃，2 min，预变性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，退火延伸，1 min，40个循环，在60℃进行单点荧光检测。