CN102586428A - 一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其监测方法包括感染玉米青枯病源镰刀菌玉米的制备、引物设计及合成、感染玉米青枯病源镰刀菌玉米DNA的提取、目的基因的扩增及分离和扩增终产物的分离、进行测序鉴定，并在基因库Genbank进行比对，确定为玉米上感染玉米青枯病源镰刀菌，本发明一种玉米青枯病源镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其鉴定方法操作简单，鉴定结果迅速准确，可以应用到实际生产中。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体的说是一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法。
背景技术
玉米是全世界总产量最高的粮食作物。玉米青枯病又称玉米茎基腐病、基腐病，是世界玉米的主要病害之一。其危害非常大，相关资料报道，有些国家，由于玉米青枯病造成玉米产量的损失可达25—33%，有的甚至高达50%以上。
玉米青枯病是一种土传病害。由于土壤环境比较复杂，在研究土传病害，分离其病原菌时经常会受到多种因素的干扰，导致病原菌分离和鉴定的困难。在茎部的维管束病害中，当病害可为肉眼所见时，往往己到病害发展的中后期，不同的寄生菌和腐生菌己在发病部位大量繁殖，同样很难通过分离的方法来确定病原菌。通过致病性测定虽然可以鉴别分离物的致病属性，但由于根病和维管束病害所需发病周期长，环境条件不易控制，其它真菌的污染很难排除，因此也不易获得准确的结论。以往在对玉米青枯病病原菌苗期致病性的报道，多集中在研究玉米根部的发病情况，使用土埋法进行检测。由于复杂的土壤环境，再加上清洗根时容易对根部造成损伤，易导致统计上的误差，造成结果不准确，而郭-麦二氏法检测复杂，同时测定结果易不准确。
发明内容
本发明针对上述问题的不足，提供一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其制备方法简单，操作简便，检测结果准确。
本发明涉及的试剂：DNA凝胶回收试剂盒购买于碧云天生物技术研究所，该试剂盒中自配有成品的DNA纯化结合液，洗涤液，洗脱液，DNA纯化柱，收集管；
本发明中所涉及的玉米青枯病原镰刀菌为一般市售产品，均可由保藏中心或生物公司购买得到；
本发明为解决上述问题所采用的技术方案是：一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，所述的检测方法为：
步骤一、水-琼脂混合培养基的制备
1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；
2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.5--0.8cm的颗粒时止，混合均匀，形成水-琼脂混合培养基，备用；
步骤二、玉米苗培养
按重量分数比取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养3-4天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水-琼脂混合培养基中，25℃-30℃条件下，见光培养，备用；
步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种
1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮20-30分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；
2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养培养4-6天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌160-200分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；
3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至4-5片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入5-6mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，25-30℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；
步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测
1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入取1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；
2）将步骤1）中得到的物料全部转入5mL离心管内，在65℃条件下放置10分钟，后加入600μL浓度为7.5mol/L的乙酸铵溶液，置于0℃条件下，放置8分钟，取出，将含有物料的5mL离心管送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液Ⅰ，在1.5mL离心管a内加入500μL的上清液Ⅰ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅰ，将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a置于0℃条件下，放置8分钟，取出，后将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心10分钟，得到1.5mL离心管a底部的沉淀，备用；
3）在含有沉淀的1.5mL离心管a内加入200μL的TE溶液，将沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均匀，后置于65℃条件下，放置10分钟，再加入200μL的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀，形成混合液Ⅱ，将含有形成混合液Ⅱ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，在1.5mL离心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5mL离心管b送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀，备用；
4）用浓度为70%的乙醇对步骤3）中1.5mL离心管b内的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，在1.5mL离心管b内加入25μL的TE溶液，混合均匀，形成DNA模板，备用；
5）真菌ITS通用引物
上游引物：5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ
下游引物：5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ
6）在0.5ml离心管Ⅰ内加入2μL步骤一中得到的DNA模板、4.0μL的10倍缓冲液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去离子水，混合均匀，得到混合液Ⅳ，备用；
7）将含有混合液Ⅳ的0.5ml离心管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
8）利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像系统中确认扩增产物中含有551bp的目的条带，备用；
9）用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1）中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1.5ml离心管c中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50oC水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液Ⅴ，将混合液Ⅴ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5ml离心管中d中的液体，备用；
10）将步骤9）中回收、纯化后的液体进行测序，并在Genbank进行比对，确定为玉米青枯病原镰刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原镰刀菌；
所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；
所述的洗脱液的组成成份：每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的SDS裂解液的组成成份：每升SDS裂解液中含有50mM的三羟甲基氨基甲烷和10g的十二烷基硫酸钠，余量为水；
所述的氯仿和异戊醇混合液的组成成分：按体积比氯仿和异戊醇混合液中含有24份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的组成成份：每升TE溶液中含有10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量为水。
有益效果
本发明的一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，舍弃了传统的从土壤中检测玉米青枯病病原菌致病性的方法，而制备水-琼脂混合培养基，避免因土壤环境的变化，从而影响检测结果，同时缩短病原菌致病性检测的时间。本发明的检测方法简单，便于操作，节约生产成本，结果准确。
附图说明
图1为扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2为rDNAITS序列的玉米青枯病原镰刀菌的系统发育树；
图中：Marker自上而下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，检测样品为扩增产物的目的片段，其检测片段为551bp；
由BLAST pairwise alignments自动生成的玉米青枯病原镰刀菌的系统发育树，红色三角代表玉米青枯病原镰刀菌的rDNA ITS序列。
具体实施方式
一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其检测方法为：
步骤一、水-琼脂混合培养基的制备
1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；
2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.5--0.8cm的颗粒时止，混合均匀，形成水-琼脂混合培养基，备用；
步骤二、玉米苗培养
按重量分数比取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养3-4天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水-琼脂混合培养基中，25℃-30℃条件下，见光培养，备用；
步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种
1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮20-30分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；
2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养培养4-6天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌160-200分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；
3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至4-5片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入5-6mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，25-30℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；
步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测
1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入取1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；
2）将步骤1）中得到的物料全部转入5mL离心管内，在65℃条件下放置10分钟，后加入600μL浓度为7.5mol/L的乙酸铵溶液，置于0℃条件下，放置8分钟，取出，将含有物料的5mL离心管送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液Ⅰ，在1.5mL离心管a内加入500μL的上清液Ⅰ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅰ，将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a置于0℃条件下，放置8分钟，取出，后将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心10分钟，得到1.5mL离心管a底部的沉淀，备用；
3）在含有沉淀的1.5mL离心管a内加入200μL的TE溶液，将沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均匀，后置于65℃条件下，放置10分钟，再加入200μL的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀，形成混合液Ⅱ，将含有形成混合液Ⅱ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，在1.5mL离心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5mL离心管b送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀，备用；
4）用浓度为70%的乙醇对步骤3）中1.5mL离心管b内的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，在1.5mL离心管b内加入25μL的TE溶液，混合均匀，形成DNA模板，备用；
5）真菌ITS通用引物
上游引物：5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ
下游引物：5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ
6）在0.5ml离心管Ⅰ内加入2μL步骤一中得到的DNA模板、4.0μL的10倍缓冲液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去离子水，混合均匀，得到混合液Ⅳ，备用；
7）将含有混合液Ⅳ的0.5ml离心管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
8）利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像系统中确认扩增产物中含有551bp的目的条带，备用；
9）用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1）中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1.5ml离心管c中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50oC水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液Ⅴ，将混合液Ⅴ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5ml离心管中d中的液体，备用；
10）将步骤9）中回收、纯化后的液体进行测序，并在Genbank进行比对，确定为玉米青枯病原镰刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原镰刀菌；
所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；
所述的洗脱液的组成成份：每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的SDS裂解液的组成成份：每升SDS裂解液中含有50mM的三羟甲基氨基甲烷和10g的十二烷基硫酸钠，余量为水；
所述的氯仿和异戊醇混合液的组成成分：按体积比氯仿和异戊醇混合液中含有24份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的组成成份：每升TE溶液中含有10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量为水。
实施例1
一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其检测方法为：
步骤一、水-琼脂混合培养基的制备
1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；
2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.5cm的颗粒时止，混合均匀，形成水-琼脂混合培养基，备用；
步骤二、玉米苗培养
按重量分数比取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养3天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水-琼脂混合培养基中，25℃条件下，见光培养，备用；
步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种
1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮20分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；
2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养培养4天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌160分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；
3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至4片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入5mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，25℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；
步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测
1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入取1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；
2）将步骤1）中得到的物料全部转入5mL离心管内，在65℃条件下放置10分钟，后加入600μL浓度为7.5mol/L的乙酸铵溶液，置于0℃条件下，放置8分钟，取出，将含有物料的5mL离心管送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液Ⅰ，在1.5mL离心管a内加入500μL的上清液Ⅰ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅰ，将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a置于0℃条件下，放置8分钟，取出，后将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心10分钟，得到1.5mL离心管a底部的沉淀，备用；
3）在含有沉淀的1.5mL离心管a内加入200μL的TE溶液，将沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均匀，后置于65℃条件下，放置10分钟，再加入200μL的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀，形成混合液Ⅱ，将含有形成混合液Ⅱ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，在1.5mL离心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5mL离心管b送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀，备用；
4）用浓度为70%的乙醇对步骤3）中1.5mL离心管b内的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，在1.5mL离心管b内加入25μL的TE溶液，混合均匀，形成DNA模板，备用；
5）真菌ITS通用：
上游引物：5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ
下游引物：5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ
6）在0.5ml离心管Ⅰ内加入2μL步骤一中得到的DNA模板、4.0μL的10倍缓冲液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去离子水，混合均匀，得到混合液Ⅳ，备用；
7）将含有混合液Ⅳ的0.5ml离心管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
8）称取0.25克琼脂糖粉末加到含有25毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5微升的扩增产物和2微升DNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到551bp的条带时，备用；
9）用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1）中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1.5ml离心管c中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50oC水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液Ⅴ，将混合液Ⅴ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5ml离心管中d中的液体，备用；
10）将步骤9）中回收、纯化后的液体进行测序，后将测出的DNA序列在基因库Genbank进行BLAST比对，结果表明，本发明测出的液体序列与DNA序列数据库中登录编号为EU151482.1、DQ102438.1和GU966507.1的序列具有同源性，且同源性分别为99%、99%和99%，在BLAST系统发育树上观察到玉米青枯病原镰刀菌，登录编号（EU151482.1）为赤霉属菌，登录编号（DQ102438.1）为角担子菌属菌，登录编号（GU966507.1）为凸脐蠕孢属菌，根据rDNA的ITS区序列的一般分析准则，本发明中分离检测的菌株为玉米青枯病原镰刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原镰刀菌。
实施例2
一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其检测方法为：
步骤一、水-琼脂混合培养基的制备
1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；
2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.7cm的颗粒时止，混合均匀，形成水-琼脂混合培养基，备用；
步骤二、玉米苗培养
按重量分数比取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养3天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水-琼脂混合培养基中，28℃条件下，见光培养，备用；
步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种
1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮25分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；
2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养培养5天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌180分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；
3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至5片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入6mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，28℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；
步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测
1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入取1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；
2）将步骤1）中得到的物料全部转入5mL离心管内，在65℃条件下放置10分钟，后加入600μL浓度为7.5mol/L的乙酸铵溶液，置于0℃条件下，放置8分钟，取出，将含有物料的5mL离心管送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液Ⅰ，在1.5mL离心管a内加入500μL的上清液Ⅰ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅰ，将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a置于0℃条件下，放置8分钟，取出，后将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心10分钟，得到1.5mL离心管a底部的沉淀，备用；
3）在含有沉淀的1.5mL离心管a内加入200μL的TE溶液，将沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均匀，后置于65℃条件下，放置10分钟，再加入200μL的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀，形成混合液Ⅱ，将含有形成混合液Ⅱ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，在1.5mL离心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5mL离心管b送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀，备用；
4）用浓度为70%的乙醇对步骤3）中1.5mL离心管b内的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，在1.5mL离心管b内加入25μL的TE溶液，混合均匀，形成DNA模板，备用；
5）真菌ITS通用：
上游引物：5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ
下游引物：5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ
6）在0.5ml离心管Ⅰ内加入2μL步骤一中得到的DNA模板、4.0μL的10倍缓冲液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去离子水，混合均匀，得到混合液Ⅳ，备用；
7）将含有混合液Ⅳ的0.5ml离心管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
8）称取0.25克琼脂糖粉末加到含有25毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5微升的扩增产物和2微升DNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到551bp的条带时，备用；
9）用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1）中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1.5ml离心管c中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50oC水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液Ⅴ，将混合液Ⅴ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5ml离心管中d中的液体，备用；
10）将步骤9）中回收、纯化后的液体进行测序，后将测出的DNA序列在基因库Genbank进行BLAST比对，结果表明，本发明测出的液体序列与DNA序列数据库中登录编号为EU151482.1、DQ102438.1和GU966507.1的序列具有同源性，且同源性分别为99%、99%和99%，在BLAST系统发育树上观察到玉米青枯病原镰刀菌，登录编号（EU151482.1）为赤霉属菌，登录编号（DQ102438.1）为角担子菌属菌，登录编号（GU966507.1）为凸脐蠕孢属菌，根据rDNA的ITS区序列的一般分析准则，本发明中分离检测的菌株为玉米青枯病原镰刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原镰刀菌。
实施例2
一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其检测方法为：
步骤一、水-琼脂混合培养基的制备
1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；
2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.8cm的颗粒时止，混合均匀，形成水-琼脂混合培养基，备用；
步骤二、玉米苗培养
按重量分数比取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养4天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水-琼脂混合培养基中， 30℃条件下，见光培养，备用；
步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种
1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮30分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；
2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养培养6天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌200分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；
3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至5片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入6mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，30℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；
步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测
1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入取1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；
2）将步骤1）中得到的物料全部转入5mL离心管内，在65℃条件下放置10分钟，后加入600μL浓度为7.5mol/L的乙酸铵溶液，置于0℃条件下，放置8分钟，取出，将含有物料的5mL离心管送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液Ⅰ，在1.5mL离心管a内加入500μL的上清液Ⅰ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅰ，将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a置于0℃条件下，放置8分钟，取出，后将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心10分钟，得到1.5mL离心管a底部的沉淀，备用；
3）在含有沉淀的1.5mL离心管a内加入200μL的TE溶液，将沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均匀，后置于65℃条件下，放置10分钟，再加入200μL的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀，形成混合液Ⅱ，将含有形成混合液Ⅱ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，在1.5mL离心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5mL离心管b送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀，备用；
4）用浓度为70%的乙醇对步骤3）中1.5mL离心管b内的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，在1.5mL离心管b内加入25μL的TE溶液，混合均匀，形成DNA模板，备用；
5）真菌ITS通用：
上游引物：5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ
下游引物：5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ
6）在0.5ml离心管Ⅰ内加入2μL步骤一中得到的DNA模板、4.0μL的10倍缓冲液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去离子水，混合均匀，得到混合液Ⅳ，备用；
7）将含有混合液Ⅳ的0.5ml离心管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
8）称取0.25克琼脂糖粉末加到含有25毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5微升的扩增产物和2微升DNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到551bp的条带时，备用；
9）用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1）中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1.5ml离心管c中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50oC水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液Ⅴ，将混合液Ⅴ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5ml离心管中d中的液体，备用；
10）将步骤9）中回收、纯化后的液体进行测序，后将测出的DNA序列在基因库Genbank进行BLAST比对，结果表明，本发明测出的液体序列与DNA序列数据库中登录编号为EU151482.1、DQ102438.1和GU966507.1的序列具有同源性，且同源性分别为99%、99%和99%，在BLAST系统发育树上观察到玉米青枯病原镰刀菌，登录编号（EU151482.1）为赤霉属菌，登录编号（DQ102438.1）为角担子菌属菌，登录编号（GU966507.1）为凸脐蠕孢属菌，根据rDNA的ITS区序列的一般分析准则，本发明中分离检测的菌株为玉米青枯病原镰刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原镰刀菌；
所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；
所述的洗脱液的组成成份：每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的SDS裂解液的组成成份：每升SDS裂解液中含有50mM的三羟甲基氨基甲烷和10g的十二烷基硫酸钠，余量为水；
所述的氯仿和异戊醇混合液的组成成分：按体积比氯仿和异戊醇混合液中含有24份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的组成成份：每升TE溶液中含有10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量为水。
在本发明中图2为rDNAITS序列的玉米青枯病原镰刀菌的系统发育树，由BLAST pairwise alignments自动生成的玉米青枯病原镰刀菌的系统发育树，红色三角代表玉米青枯病原镰刀菌的rDNA ITS序列。
Claims (1)
1.一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其特征在于，所述的检测方法为：
步骤一、水-琼脂混合培养基的制备
1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；
2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.5--0.8cm的颗粒时止，混合均匀，形成水-琼脂混合培养基，备用；
步骤二、玉米苗培养
按重量分数比取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养3-4天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水-琼脂混合培养基中，25℃-30℃条件下，见光培养，备用；
步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种
1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮20-30分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；
2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养培养4-6天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌160-200分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；
3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至4-5片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入5-6mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，25-30℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；
步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测
1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入取1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；
2）将步骤1）中得到的物料全部转入5mL离心管内，在65℃条件下放置10分钟，后加入600μL浓度为7.5mol/L的乙酸铵溶液，置于0℃条件下，放置8分钟，取出，将含有物料的5mL离心管送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液Ⅰ，在1.5mL离心管a内加入500μL的上清液Ⅰ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅰ，将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a置于0℃条件下，放置8分钟，取出，后将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心10分钟，得到1.5mL离心管a底部的沉淀，备用；
3）在含有沉淀的1.5mL离心管a内加入200μL的TE溶液，将沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均匀，后置于65℃条件下，放置10分钟，再加入200μL的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀，形成混合液Ⅱ，将含有形成混合液Ⅱ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，在1.5mL离心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5mL离心管b送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀，备用；
4）用浓度为70%的乙醇对步骤3）中1.5mL离心管b内的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，在1.5mL离心管b内加入25μL的TE溶液，混合均匀，形成DNA模板，备用；
5）真菌ITS通用引物
上游引物：5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ
下游引物：5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ
6）在0.5ml离心管Ⅰ内加入2μL步骤一中得到的DNA模板、4.0μL的10倍缓冲液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去离子水，混合均匀，得到混合液Ⅳ，备用；
7）将含有混合液Ⅳ的0.5ml离心管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
8）利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像系统中确认扩增产物中含有551bp的目的条带，备用；
9）用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1）中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1.5ml离心管c中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50oC水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液Ⅴ，将混合液Ⅴ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5ml离心管中d中的液体，备用；
10）将步骤9）中回收、纯化后的液体进行测序，并在Genbank进行比对，确定为玉米青枯病原镰刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原镰刀菌；
所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；
所述的洗脱液的组成成份：每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的SDS裂解液的组成成份：每升SDS裂解液中含有50mM的三羟甲基氨基甲烷和10g的十二烷基硫酸钠，余量为水；
所述的氯仿和异戊醇混合液的组成成分：按体积比氯仿和异戊醇混合液中含有24份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的组成成份：每升TE溶液中含有10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量为水。
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