CN105018631B - 基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其引物组合物及检测试剂盒 - Google Patents

基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其引物组合物及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其引物组合物及检测试剂盒，其中，用于检测胡萝卜软腐果胶菌的LAMP引物组由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LOOP组成。本发明的引物组合物及检测试剂盒特异性高、灵敏度好，明显优于现有技术的其他检测手段；与传统PCR相比，本发明的检测方法及试剂盒结果可视，操作简单，成本低廉；能有效实现多种植物发病组织总DNA中的胡萝卜软腐果胶杆菌检测，且可对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液进行直接检测，为病害的田间直接诊断奠定基础。

Description

基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其 引物组合物及检测试剂盒
【技术领域】
本发明基因检测诊断领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，其涉及的引物组合物、所述引物组合物的应用及胡萝卜软腐果胶杆菌的检测试剂盒。
【背景技术】
胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)是引起蔬菜细菌性软腐病的一种世界性流行病害，其宿主范围十分广泛，可以引起多种园艺作物例如芹菜、胡萝卜、番茄、黄瓜、马铃薯、甜瓜等发生软腐病并带来巨大的经济损失。由于胡萝卜软腐果胶杆菌的致病性较强，病害一但发生很难防治，且市场上缺乏针对细菌性软腐病的专一性杀菌剂，因此目前该病害的防治以预防为主。对于预防病害的发生，早期的病原菌检测技术显得尤为重要。
植物病原微生物检测通常采用形态学、生理生化及分子技术手段。随着生物信息及DNA测序技术的发展，分子检测技术的应用正在向检测广度及深度多层次进行深入。目前常用的病原菌分子检测技术包括：普通PCR、荧光定量PCR、免疫测定法等。这些检测技术的应用通常因昂贵的实验仪器及苛刻的实验条件而受到一定的限制，很难实现病害病原微生物的田间现场检测。
目前用于检测软腐果胶杆菌的方法包括普通PCR、巢式PCR及荧光定量PCR等，该类检测方法需要依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，检测时间较长，不能满足病原菌快速检测的需要。
例如中国发明专利申请CN 102559901A公开了一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，以致病菌果胶裂解酶基因特异的引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。并公开其特异性引物包括正向引物：5’-CTATAGCGGTAATGAAG-3’，反向引物：5’-TTACCGACGCCAGCATAG-3’。
然而，该技术中所用引物未进行实验验证，也没有对引物进行灵敏性检测，且特异性检测中仅涉及了3种其它对照菌株，其灵敏性及特异性存在争议。而且，其PCR扩增方法只能对菌株提取后的DNA进行检测，不能实现菌悬液的直接检测。更重要的是该方法检测所需要的时间在2小时以上，扩增产物不能直接目视检测，必须通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，操作繁复。
2000年，日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法即环介导等温扩增技术(Loop-Mediated IsothermalAmplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温60分钟左右，即可完成核酸扩增反应。LAMP反应的结果可以通过电泳检测形成梯形条带，也可以通过加入不同种类的核酸染料进行目视观察。然而，目前尚缺乏将LAMP技术应用于胡萝卜软腐果胶杆菌检测的技术的设想及验证。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术缺陷，针对现有的胡萝卜软腐果胶杆菌的生物学检测方法耗时长、操作复杂、准确性差等缺陷，并针对PCR检测技术必须依赖热循环仪器、因此无法快速检测胡萝卜软腐果胶杆菌从而存在推广困难的问题，提供了一种胡萝卜软腐果胶杆菌的新型检测方法及实现该方法的特异性引物及检测试剂盒。
本发明基于将环介导等温扩增技术应用至胡萝卜软腐果胶杆菌检测的思路，提供了用于检测胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovor um)的引物组合物，所述引物组合物由以下组成：
正向内引物FIP:5’-CCTGAGAGCCGGCTTTCAGCTGCTGACGCCGAAAGAGT-3’，
反向内引物BIP:5’-CCTGGAACGATGACCCGTCTTCCTTGTGACGCAGATTGTGGA-3’，
正向外引物F3:5’-GCTGGATGACAAGCCAGTG-3’，
反向外引物B3:5’-CGGATGCGGTCTTTCCCTA-3’，
环引物LOOP:5’-ACCAGGCGGGACAGTATCG-3’。
本发明还涉及上述引物组合物在检测胡萝卜软腐果胶杆菌中的应用。
进一步地，本发明提供上述引物组合物在环介导等温扩增反应中检测软腐果胶杆菌的应用。
本发明还提供一种胡萝卜软腐果胶杆菌的环介导等温扩增反应检测试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物组合物。
优选地，所述试剂盒包含检测溶液以及荧光染料；其中，所述检测溶液含有40μM正向内引物FIP、40μM反向内引物BIP、5μM正向外引物F3、5μM反向外引物B3、20μM环引物LOOP、0.23mM dNTPs、0.83mM Tris－HCl(pH8.8)、0.41mM KCl、0.33mM MgSO4、0.41mM(NH4)2SO4、33.3mM三甲铵乙内酯、0.2wt％Tween20、8U Bst DNA聚合酶。
在本发明中，所述荧光染料可采用钙黄绿素。
本发明的试剂盒具有良好的特异性和敏感度，特别对胡萝卜软腐果胶杆菌DNA样本的检测灵敏度达到1.92×10-3ng/μl，或对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的检测灵敏度达到1.27×104cfu/ml。
本发明还提供一种检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，取待检微生物DNA或菌悬液，以该DNA或菌悬液为模板，通过上述引物组合物及含有所述引物组合物的检测溶液进行环介导等温扩增，通过扩增结果得到检测结果。
优选地，在进行上述检测时，环介导等温扩增反应条件为63℃，60min。
本发明还提供胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种pmrA基因序列作为靶标在环介导等温扩增反应中检测软腐果胶杆菌的应用。
以下将更详细地阐述本发明的技术方案。
1、提取病原菌总DNA和植物总DNA
采用细菌DNA提取试剂盒(购买自北京天根公司)提取胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种病原菌总DNA，利用离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒(购买自北京天根公司)由发病植株组织提取总DNA，提取DNA保存于-20℃备用。
2、特异性引物设计
为避免LAMP反应中出现假阳性结果或对非目标菌株产生非特异性扩增，本发明通过系统分析胡萝卜软腐果胶杆菌的总基因组序列信息，筛选并明确采用胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种特异性pmrA基因序列作为靶标，利用LAMP引物在线设计软件http://primerexplorer.jp/e/针对该序列设计了胡萝卜软腐果胶杆菌特异性LAMP引物组。通过Blastn program(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比较所设计的引物序列与其它生物种属没有显著同源性。上述各引物在胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种特异性pmrA基因序列上的具体位置如下：
表1：引物序列信息
其中正向外引物F3和反向外引物B3在普通PCR反应及荧光定量PCR反应下扩增片段大小为170bp。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)的pmrA基因序列已向公众公开，在GenBank中的登录号为AB447882.1。
3、环介导等温扩增反应(LAMP反应)
LAMP反应体系为：总体系为25μl，其中浓度为20μmol/L的正向内引物FIP和反向内引物BIP各2μl、浓度为10μmol/L的环引物LOOP 2μl、浓度为10μmol/L的正向外引物F3和反向外引物B3各0.5μl、0.23mM dNTPs、0.83mMTris－HCl(pH8.8)、0.41mMKCl、0.33mMMgSO4、0.41mM (NH4)2SO4、33.3mMBetaine(三甲铵乙内酯)、0.2％Tween20、8U Bst DNA聚合酶1μl(BstDNAPolymerase)、钙黄绿素核酸染料1μl，加入超纯净水制备得到。LAMP反应程序为：恒温63℃，60min。
4、胡萝卜软腐果胶杆菌LAMP检测试剂盒的制备
基于胡萝卜软腐果胶杆菌LAMP检测技术的试剂盒包括胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种标准阳性DNA模板、环介导等温扩增反应液。
标准阳性DNA模板由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的标准菌株进行DNA提取获得。
本发明提供的胡萝卜软腐果胶杆菌LAMP检测试剂盒，针对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种特异性pmrA基因设计引物。采用恒温装置，可用于胡萝卜软腐果胶杆菌灵敏、快速、准确的检测。此LAMP检测方法多次重复试验误差值小，复现性良好，引物组合物的检测灵敏度极限为0.19fg/μL菌株DNA。
本发明具有以下优点：
1)特异性高，鉴定速度快
引物扩增胡萝卜软腐果胶杆菌的特异性序列，LAMP检测特异性高。普通PCR及荧光定量PCR的检测周期需要2h以上，本发明扩增全程仅需60min，检测速度快，明显优于PCR方式。
2)操作简便、成本低廉
与传统PCR相比，本发明的LAMP检测方法结果不需要进一步进行琼脂糖凝胶电泳检测，在反应前添加钙黄绿素荧光染料可以直接使结果可视化，操作更加简单。此外该LAMP检测只需要在恒温装置上便能完成反应，不需要昂贵的实验仪器，检测成本低廉。
3)实用性强、应用范围广
可以检测多种植物发病组织总DNA中的胡萝卜软腐果胶杆菌，且可对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液进行直接检测，为病害的田间直接诊断奠定基础，且为病害的早期预测预报提供方法和依据。
【附图说明】
图1为引物组合物特异性检测的结果；
其中，LAMP扩增曲线中纵轴为浑浊度，横轴为反应时间；
其中，1-28为胡萝卜软腐果胶杆菌DNA(菌株编号见表2)；29～31为黄单胞杆菌、32-33为丁香假单胞杆菌、34为菊苣假单胞杆菌、35为菊欧文式菌、36为密执安棒形杆菌、37为劳尔氏菌、38为是嗜酸菌属甜瓜种、39为茄病镰刀菌、40为核盘菌、41为芹菜尾孢菌的对应DNA、42为无菌水对照；
图2为引物组合物灵敏性检测的结果；
其中，LAMP扩增曲线中纵轴为浑浊度，横轴为反应时间；
其中，1-8为软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的DNA，浓度分别为1.92×101ng/μl-5.8×10-6ng/μl；N为无菌水对照；
图3为芹菜组织中胡萝卜软腐果胶杆菌的LAMP检测，扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳的结果；
其中，1-3为分别为北京、河北、河南田间采集得到的芹菜软腐病病样组织总DNA，4-10为接种不同病原菌的芹菜发病组织总DNA(菌株编号见表3)，11为健康芹菜组织DNA，M为5000bp DNAladder(博迈德生物有限公司)；
图4为芹菜组织中胡萝卜软腐果胶杆菌的LAMP检测，扩增产物在自然光下颜色变化的观察结果；
其中，1-3为分别为北京、河北、河南田间采集得到的芹菜软腐病病样组织总DNA，4-10为接种不同病原菌的芹菜发病组织总DNA(菌株编号见表3)，11为健康芹菜组织DNA；
图5为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌悬液的LAMP检测，扩增产物在自然光下颜色变化的观察结果；
其中，阳性为软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的DNA，阴性为灭菌NA培养基对照，1-8为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的菌悬液，菌株编号为QC14052001，菌液浓度分别为1.27×108cfu/ml-1.27×101cfu/ml。
【具体实施方式】
下面结合具体实例进一步阐述发明。下列实例仅用于非限制性地说明本发明的技术方案，而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1胡萝卜软腐果胶杆菌的引物特异性检测
分别采用胡萝卜软腐果胶杆菌28株及其它蔬菜上常见真菌、细菌病害病原菌13株(如表2)，对胡萝卜软腐果胶杆菌引物组合物进行特异性检测。其中，病原细菌菌株采用NA培养基培养，病原真菌菌株用PDA培养基培养。随后病原细菌由NA培养基活化后转入NB培养基在温度26-30℃与转速120-130rpm的条件下振荡培养22-26h，收集菌悬液提取DNA。病原真菌由PDA培养基活化后转入PD培养基，在26-30℃与转速120-130rpm的条件下振荡培养7d后收集菌丝体提取DNA。采用DNA提取试剂盒对病原菌进行DNA的提取。
其中，NA培养基的组分为10g/L蛋白胨、3g/L牛肉粉、5g/L氯化钠与18g/L琼脂粉，余量为水，PH调为7。
NB培养基的组分为10g/L蛋白胨、3g/L牛肉粉与5g/L氯化钠，余量为水，PH调为7。
PDA培养基的组分为200g/L马铃薯、20g/L葡萄糖及20g/L琼脂粉。
PD培养基的组分为200g/L马铃薯及20g/L葡萄糖。
上述用于特异性检测的41株病原菌均为已经公开的、公众可以获得的实验用微生物，其中第35株菌株从在中国农业微生物菌种保藏中心购买获得，其余菌株均可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所购买获得。
表2特异性检测菌株
以上述41株病原菌基因组DNA为模板，利用本发明的引物组合物FIP/BIP/F3/B3/LOOP及如下LAMP反应程序对上述菌株分别进行扩增，以检测该引物组合物的特异性。
LAMP反应体系如下：总体系为25μl，其中浓度为20μmol/L的正向内引物FIP和反向内引物BIP各2μl、浓度为10μmol/L的环引物LOOP 2μl、浓度为10μmol/L的正向外引物F3和反向外引物B3各0.5μl、0.23mM dNTPs、0.83mM Tris－HCl(pH8.8)、0.41mM KCl、0.33mMMgSO4、0.41mM(NH4)2SO4、33.3mM Betaine、0.2wt％Tween20、8U Bst DNA聚合酶1μl(BstDNAPolymerase)加入超纯净水制备得到。LAMP反应程序为：63℃，60min。LAMP扩增结果通过实时浑浊仪数据输出后整理所得。
图1给出了分别对应于41株病原菌的LAMP扩增结果，其中编号1-28表现出明显的浑浊。如图1所示，实验证实该引物组合物可对28株不同寄主(包括白菜、芹菜、油菜、番茄、花菜、西葫芦、黄瓜)上的不同亚种的胡萝卜软腐果胶杆菌的DNA进行扩增，同时对13株蔬菜上的其他常见细菌、真菌性病害病原菌基因组DNA和无菌水对照均无相应扩增产物，结果说明该引物组对胡萝卜软腐果胶杆菌的特异性良好。
实施例2胡萝卜软腐果胶杆菌的引物灵敏性检测
以2014年由北京地区采集的芹菜寄主上分离得到的(编号为QC14052001)胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌株DNA为模板用于引物灵敏性检测。该目标菌株DNA提取后进行浓度测定，随后10倍梯度稀释制备成1.92×101ng/μl-1.92×10-6ng/μl，分别编号为1-8，纯水对照编号为9，按照实施例1记载的反应体系及反应过程进行LAMP反应。
如图2所示，检测结果显示该LAMP检测技术对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的检测在浓度范围1.92×101ng/μl-5.8×10-3ng/μl结果良好，表明对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌株DNA样本的检测灵敏度达到1.92×10-3ng/μl。
实施例3发病芹菜组织样本中胡萝卜软腐果胶杆菌的检测
对自然发病的芹菜组织(分别采集自北京、河北、河南田间，编号1-3)及人工接种的芹菜组织(编号4-10，如表3所示)进行取样，样本为带有典型软腐病发病症状的芹菜茎段，发病症状包括茎秆呈现湿腐状且变黑发臭，同时选取未发病区域的健康芹菜组织作为阴性对照样本(编号11)。
表3芹菜寄主人工接种的病原菌
样本收集后分别进行反复清洗，采用75vol％乙醇进行表面消毒，随后无菌水反复清洗，利用离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒(购买自北京天根公司)分别进行植株组织提取、纯化DNA，按照实施例1记载的反应体系和反应过程进行LAMP检测。
如图3所示，编号1-6表现出明显的阳性克隆，编号7-11未观察到明显反应。扩增结果显示LAMP检测体系可以准确地检测到发病植株组织中带有的胡萝卜软腐果胶杆菌，包括不同采集地的自然发病样本或人工接种样本均表现出明显的阳性克隆，此外接种其它非目标菌株及健康芹菜组织的DNA均无阳性克隆。LAMP检测的阳性扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上呈现梯形条带，而阴性扩增产物没有条带。
此外，在添加了钙黄绿色核酸染料的LAMP检测产物中，自然光下编号1-6的阳性扩增产物为绿色，而编号7-11的阴性扩增产物为浅红色，如图4所示。综合以上结果说明本发明的LAMP检测体系特异性高，不受寄主DNA的影响，也不受采集地或发病手段影响。
实施例4胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的直接检测
将2014年由北京地区采集的芹菜寄主上分离得到的(编号为QC14052001)胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌株在NA培养基内在26-30℃与转速120-130rpm的条件下振荡培养12h后，采用紫外分光光度计测量菌悬液浓度。得到最高菌悬液浓度为1.27×108cfu/ml，随后经十倍梯度稀释分别制备成1.27×108cfu/ml-1.27×101cfu/ml的菌悬液，分别编号为样品1-8。各取不同浓度的菌悬液1ml，经95℃金属浴处理5min后，取2μl菌悬液按照实施例1记载的反应体系和反应过程进行LAMP检测。
如图5所示，扩增结果显示编号1-5的1.27×108cfu/ml-1.27×104cfu/ml的菌悬液检测结果为阳性(扩增产物为绿色)，其余为阴性(扩增产物为浅红色)。由此可见本发明的LAMP检测技术对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的最高检测灵敏度可达到1.27×104cfu/ml。
由此可见，本发明的引物组合物及检测试剂盒特异性高、灵敏度好，对不同寄主上的不同亚种的胡萝卜软腐果胶杆菌特异性好，对DNA样本的检测灵敏度达到1.92×10-3ng/μl，对菌悬液灵敏度可达到1.27×104cfu/ml，明显优于现有技术的其他检测手段；与传统PCR相比，本发明的检测方法及试剂盒结果可视，操作简单，成本低廉；有效实现多种植物发病组织总DNA中的胡萝卜软腐果胶杆菌检测，且可对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液进行直接检测，为病害的田间直接诊断奠定基础，且为病害的早期预测预报提供方法和依据。

Claims (8)

1.用于检测胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)的引物组合物，其特征在于所述引物组合物由以下组成：
正向内引物FIP:5’-CCTGAGAGCCGGCTTTCAGCTGCTGACGCCGAAAGAGT-3’，
反向内引物BIP:5’-CCTGGAACGATGACCCGTCTTCCTTGTGACGCAGATTGTGGA-3’，
正向外引物F3:5’-GCTGGATGACAAGCCAGTG-3’，
反向外引物B3:5’-CGGATGCGGTCTTTCCCTA-3’，
环引物LOOP:5’-ACCAGGCGGGACAGTATCG-3’。
2.权利要求1所述的引物组合物在环介导等温扩增反应中检测软腐果胶杆菌的应用。
3.胡萝卜软腐果胶杆菌的环介导等温扩增反应检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有根据权利要求1所述的引物组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含检测溶液以及荧光染料；其中，所述检测溶液含有40μM正向内引物FIP、40μM反向内引物BIP、5μM正向外引物F3、5μM反向外引物B3、20μM环引物LOOP、0.23mM dNTPs、0.83mM pH8.8Tris－HCl、0.41mM KCl、0.33mM MgSO4、0.41mM(NH4)2SO4、33.3mM三甲铵乙内酯、0.2wt％Tween20、8U Bst DNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述荧光染料是钙黄绿素。
6.权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于对胡萝卜软腐果胶杆菌DNA样本的检测灵敏度达到1.92×10-3ng/μl，或对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的检测灵敏度达到1.27×104cfu/ml。
7.一种检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，其特征在于取待检微生物DNA或菌悬液，以该DNA或菌悬液为模板，通过权利要求4所述的试剂盒进行环介导等温扩增。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于环介导等温扩增反应条件为63℃，60min。
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