CN107828905A

CN107828905A - 烟草野火病菌lamp检测引物及检测方法

Info

Publication number: CN107828905A
Application number: CN201711362740.XA
Authority: CN
Inventors: 兰成忠; 游泳; 阮宏椿; 赵健伟; 姚锦爱
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2018-03-23

Abstract

本发明提供了烟草野火病菌LAMP检测引物及检测方法，用于烟草野火病菌的特异性检测。所述的引物由一对外侧引物（F3、B3）和一对内侧引物（FIP、BIP）组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4所示，烟草野火病菌的检测方法包括待测样品总核酸提取、LAMP恒温扩增、扩增产物SYBR green Ⅰ荧光染公法判断反应结果。本发明的LAMP 引物及检测方法可用于烟草野火病菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于烟草野火病的早期诊断和病菌的监测、鉴定。

Description

烟草野火病菌LAMP检测引物及检测方法

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及烟草野火病菌LAMP检测引物及检测方法，可用于烟草野火病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于烟草野火病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

由丁香荧光假单胞杆菌烟草致病变种（Pseudomonas syringae pv. tabaci）侵染引起的烟草野火病( wild fire o f tobacco)是世界烟草产区植普遍发生的一种毁灭性细菌病害。该病最早于1917年由美国人Wolf和Foster报道，此后在前苏联、德国、美国、日本和巴西等许多国家都有报道。近年来，由于地理条件及栽培制度的原因，烟草野火病在我国云南、贵州、河南、山东、湖北、辽宁和吉林等省烟草种植区大面积发生，并有逐年加重的趋势，已成为烟叶生产的主要病害之一。该病害主要在烟叶生长的团棵期至旺长期发生，主要危害烟草叶片，也可危害幼茎、蒴果、萼片等器官，其发生严重影响烟草的品质和产量。在病害发生初期快速准确地鉴定出病原菌，及时实施有效的防控措施，对防治该病害的扩散和蔓延十分重要。因此，建立烟草野火病菌的快速、准确和便捷的检测技术是防止该病害发生的重要举措。

传统的细菌病害鉴定方法主要是通过症状观察、生理生化指标测定、血清学检测及形态学鉴定等，这些测定方法过程复杂、费时，而且无法做到对病害早期准确诊断，从而影响病害及时准确防治并减少经济损失。

随着生物技术在病害鉴定方面开发应用及病原细菌DNA数据不断积累，使分子生物学方法鉴定细菌种类技术日趋完善和成熟。基于细菌16S~23S rRNA的ITS区的分子鉴定方法由于其快速、准确的优点已广泛应用于许多细菌微生物的检测鉴定中。许多研究人员采用16S ~ 23S rRNA的ITS区通用引物对目标菌ITS区进行扩增和测序，再通过和已知病原细菌的相同基因序列进行比对分析，设计出目标菌的特异性引物，从而建立目标菌的特异性PCR检测技术。但实践表明，PCR方法虽然具有快速、准确和特异优点，但其反应过程操作较为复杂，而且还需要PCR仪等贵重设备等，这些缺点限制了PCR技术在农业基层的推广和应用。

2000年日本科学家Notomi等研制了一种称为环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)的新型核酸恒温扩增技术。该方法针对靶标基因6个特异性区域设计4条引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst-DNA polymerase）在等温（60~65℃）条件下保温30 ~ 60 min，即可实现核酸的大量扩增，并且无需用电泳对产物进行分析，直接可用肉眼对反应产物进行判断。该检测方法具有特异性好、灵敏度高、反应时间短、操作方便和不需要昂贵的仪器等优点，目前已被广泛应用于病毒、细菌、原生动物和真菌等领域的检测中，但尚未用于烟草野火病菌检测中。本发明通过对烟草野火病菌16S~ 23S rRNA的ITS区序列进行测序比对，分析该基因区域遗传差异，设计合成烟草野火病菌的LAMP引物，建立了烟草野火病菌LAMP快速准确鉴定技术。

发明内容

本发明的目的是提供烟草野火病菌LAMP检测引物及检测方法，针对现有技术中对烟草野火病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了烟草野火病菌的分子检测方法，对烟草野火病菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 烟草野火病菌LAMP检测特异性引物的设计：

采用细菌ITS序列的通用引物L1/L2（L1:5ʼ- AGTCGTAACAAGGTAGCCGT -3ʼ，L2:5ʼ-GTGCCAAGGC ATCCACC -3ʼ）对烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）16S ~23S rRNA基因进行扩增测序。将获得的烟草野火病菌16S ~ 23S rRNA基因序列与GenBank中已有的原核生物(其它细菌)的16S ~ 23S rRNA基因序列进行比对分析,基于烟草野火病菌16S ~ 23S rRNA基因序列保守位点，利用在线LAMP引物设计软件Primer softwareExplorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken ChemicalCo., Japan)设计一套烟草野火病菌特异性LAMP引物组，由F3、B3、FIP和BIP组成，引物序列如下：F3:5’-TTAGAGCGCACCCCTGAT-3’，B3:5’- GTAAGTGGTGGAGCCAAGC-3’，FIP:5’-GCGTCCACTCTGACCAGCTAT C-GTCGGCAGTTCGAATCTGC-3’，BIP:5’-AATACGGGGCCATAGCTCAG C-ATCGAACCGCTGACCTCC -3’。

2. 烟草野火病菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA(菌体培养和DNA模版制备)。

用于检测病原菌纯培养物时，采用细菌DNA提取试剂盒提取待测菌株基因组DNA，具体过程如下：采用LB固体培养基活化待测菌体，涂板后放入25℃恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB液体培养基中25℃培养12h(OD600＝0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA 提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20℃备用；

用于检测植物组织中存在烟草野火病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为模板进行LAMP扩增；

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，在PCR管中配制25μL反应体系，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mMTris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mMdNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：将配制好的PCR管于64℃水浴锅中恒温反应60min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法对反应结果进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 µL，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含烟草野火病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含烟草野火病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含烟草野火病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含烟草野火病菌。

本发明的有益效果：本发明建立了烟草野火病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的LAMP检测技术体系，可用于带菌植株组织和土壤中烟草野火病菌的检测，或用于烟草野火病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强、结果可靠：本发明分析了烟草野火病菌和其他原核生物16S ~ 23S rRNA基因在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的LAMP引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明在所设计的LAMP引物基础上建立了烟草野火病菌LAMP检测方法，只有烟草野火病菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明LAMP检测方法特异性强，结果可靠。

2、灵敏度高：本发明对烟草野火病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性。

3、快速：应用本发明检测方法，在1～1.5h得到检测结果，而以往的PCR或巢式PCR检测需4～6h才得到检测结果，本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速。

4、成本低、易操作、简单：本发明最大的优点是不需要以往PCR检测所需要的PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等昂贵的专业仪器，仅需一台廉价的恒温仪器，如水浴锅，省去了繁琐的操作步骤和规程，简单易行。

5、检测结果直观，肉眼可判断：本发明扩增产物通过加显色剂进行染色，绿色为阳性，即待测样品中含烟草野火病菌，橙色为阴性，说明待测样品中不含烟草野火病菌，肉眼可判断检测结果，无需电泳检测及凝胶成像。

附图说明

图1 为环介导恒温扩增（LAMP）引物在靶标基因16S ~ 23S rRNA中的位点及序列(引物FIP由F2和F1c组成，引物BIP由引物B2和B1c组成)。

图2 为本发明烟草野火病菌的LAMP特异性检测。a为LAMP扩增后的常光照射可视化显色，b为LAMP扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-2为烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci），3-6分别为柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri）、瓜果细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. Avenae）、番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）和番茄细菌性溃疡病菌（ Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis），7为阴性对照，1-2显示绿色荧光。

图3 为本发明烟草野火病菌LAMP检测灵敏性。a为LAMP扩增后的常光照射可视化显色， b为LAMP扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-8模板DNA浓度分别为100 pg、10pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，9为阴性对照，1-5显示绿色荧光。

图4 为本发明检测方法对发病叶片中烟草野火病菌的检测。a为LAMP扩增后的常光照射可视化显色，b为LAMP扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1为阳性对照，2、4、6为烟草野火病发病叶片，3、5、7为健康烟草叶片，8为阴性对照，1-2、4、6显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：烟草野火病菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

采用细菌DNA提取试剂盒提取待测菌株基因组DNA，具体过程如下：采用LB固体培养基活化待测菌体，涂板后放入25℃恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB液体培养基中25℃培养12h(OD600＝0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN 细菌基因组DNA 提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20℃备用。

2. 烟草野炎病菌LAMP检测特异性引物的设计：

采用细菌ITS序列的通用引物L1/L2（ L1:5ʼ- AGTCGTAACAAGGTAGCCGT -3ʼ，L2:5ʼ-GTGCCAAGGC ATCCACC -3ʼ）对烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）16S ~23S rRNA基因进行扩增测序。将获得的烟草野火病菌16S ~ 23S rRNA基因序列与GenBank中已有的原核生物(其它细菌)的16S ~ 23S rRNA基因序列进行比对分析,基于烟草野火病菌16S ~ 23S rRNA基因序列保守位点，利用在线LAMP引物设计软件Primer softwareExplorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken ChemicalCo., Japan)设计一套烟草野火病菌特异性LAMP引物组，如图1所示，LAMP引物组由F3、B3、FIP和BIP组成，引物序列如下：F3:5’- TTAGAGCGCACCCCTGAT -3’，B3:5’-GTAAGTGGTGGAGCCAAGC -3’，FIP: 5’- GCGTCCACTCTGACCAGCTAT C-GTCGGCAGTTCGAATCTGC-3’，BIP: 5’- AATACGGGGCCATAGCTCAG C-ATCGAACCGCTGACCTCC -3’ （图1）。

3. 烟草野火病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证

以烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）及相关病原细菌（柑橘溃疡病菌 Xanthomonas citri、瓜果细菌性果斑病菌 Acidovorax avenae subsp. avenae、水稻白叶枯病菌 Xanthomonas oryzae pv.oryzae、大肠杆菌 Escherichia coli、杨桃细菌性斑点病菌丁香假单胞菌Pseudomonas syringae pv. Averrhoi、番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum、水稻细菌性条斑病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、番茄细菌性溃疡病菌 Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensi）的DNA为模板，利用F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mMTris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 µL，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含烟草野火病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含烟草野火病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含烟草野火病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含烟草野火病菌。

4.引物特异性验证结果

LAMP扩增结果表明，供试的菌株中只有烟草野火病菌显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，其它病原真菌显色结果为橙色、澄清透明状（图2），说明所设计的烟草野火病菌F3、B3、FIP和BIP可以将烟草野火病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于烟草野火病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：烟草野火病菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组DNA的制备

用无菌超纯水对烟草野火病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的烟草野火病菌基因组DNA为模板，利用F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 µL，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含烟草野火病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含烟草野火病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含烟草野火病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含烟草野火病菌。

3. LAMP扩增灵敏度检测结果

LAMP扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的烟草野火病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色、透明状，说明所设计的烟草野火病菌引物F3、B3、FIP和BIP通过LAMP扩增，对烟草野火病菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（图3）。

实施例3：发病组织中烟草野火病菌的LAMP检测

样品采集：从福建浦城、三明、南平、龙岩采集烟草野火病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为LAMP模板进行扩增。

LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；

检测结果：检测结果（图4）表明，烟草野火病发病的叶片通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，说明存在烟草野火病菌，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色、透明状，说明不存在烟草野火病菌，该套技术能用于植物组织中烟草野火病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 烟草野火病菌LAMP检测引物及检测方法

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttagagcgca cccctgat 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtaagtggtg gagccaagc 19

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgtccactc tgaccagcta tcgtcggcag ttcgaatctg c 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatacggggc catagctcag catcgaaccg ctgacctcc 39

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agtcgtaaca aggtagccgt 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgccaaggc atccacc 17

Claims

1. 一种烟草野火病菌的LAMP检测引物，其特征在于，所述的引物由一对外侧引物F3、B3和一对内侧引物FIP、BIP组成，其核苷酸序列分别为：外侧引物F3:5’-TTAGAGCGCACCCCTGAT -3’，B3: 5’-GTAAGTGGTGGAGCCAAGC-3’，内侧引物FIP: 5’-GCGTCCACTCTGACCAGCTATC-GTCGGCAGTT CGAATCTGC-3’，BIP: 5’-AATACGGGGCCATAGCTCAGC-ATCGAACCGCT GACCTCC - 3’。

2.利用权利要求1所述引物建立的烟草野火病菌LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）待测样品中DNA模板的提取：采用LB固体培养基活化待测细菌，用LB液体培养基扩繁菌体，离心收集菌体，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组作为LAMP检测模板；

（2）LAMP恒温扩增：在PCR管中配制25μL反应体系，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL，将配制好的PCR管于64℃水浴锅中恒温反应60min；

（3）反应结果判断：采用SYBR Green I荧光染色法判断反应结果，在反应产物中加入1μL SYBR Green I荧光显色剂轻轻混匀，静置5min进行显色观察，在常光下反应显现绿色则待测样品为阳性，即含烟草野火病菌，反应显现橙色则待测样品为阴性，即不含烟草野火病菌，在紫外光下观察到浑浊状沉淀则样品阳性，澄清透明则样品为阴性。

3. 根据权利要求2所述的烟草野火病菌LAMP检测方法，其特征在于，LAMP反应混合液由如下成分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100。

4.如权利要求1所述的引物在检测烟草野火病菌中的应用。