CN104962639A - 一种快速检测多主棒孢菌的lamp引物组及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄瓜棒孢叶斑病病原多主棒孢菌的LAMP引物组和检测方法。本发明针对黄瓜多主棒孢菌特异的毒素cassiicolin基因序列设计和筛选了一套特异性的检测引物组，该引物组由4条特异性引物CC-FIP、CC-BIP、CC-F3和CC-B3组成。本发明建立了含有该引物组的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，检测结果可以通过肉眼直接观测，或以SYBR GreenⅠ的颜色变化作为判定标准，进而确定待检测样品中是否存在多主棒孢菌。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率好、检测时间短、仪器设备简单的优点，从样品处理到报告结果只需1.5h，不需要PCR仪和电泳仪，操作简单，比其它PCR方法具有更高的特异性。

Description

一种快速检测多主棒孢菌的LAMP引物组及检测方法

技术领域

 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测多主棒孢菌的检测引物组和检测方法。

背景技术

 多主棒孢（Corynespora cassiicola（Berk&M.A.Curtis）C.T.Wei）是一种重要的植物病原真菌，可寄生于热带及亚热带地区的蔬菜、树木和园艺观赏作物。它主要危害植物的叶片，形成典型的病斑，也可侵染根、茎、花和果实，严重时造成落叶、落果等现象。近年来，我国蔬菜棒孢叶斑病的危害逐年加重，主要涉及黄瓜、茄子、番茄、菜豆等蔬菜和经济作物橡胶等寄主，每年发生面积超过1000万亩，损失超过50亿，成为决定主要寄主产业发展的重要限制因素。多主棒孢可以通过菌丝体、厚垣孢子或分生孢子的形式随病残体、杂草在土壤中，非寄主植物上越冬存活，也可以附着于种子表皮或潜伏在种子内部，土壤传播和种子带菌是多主棒孢远距离传播的主要途径。

 由多主棒孢引起的黄瓜棒孢叶斑病在叶片上症状多样，极易与其它病原菌引起的病害相混淆，病原菌侵染不同时期，与黄瓜角斑病、霜霉病和炭疽病产生相似的症状。在田间由于许多农民误、错诊，而没有对病害进行及时有效的控制，造成巨大的经济损失。因此，建立黄瓜棒孢叶斑病的现场检测技术，对栽培期病害发生的预测预报具有重要的意义。

 目前，植物组织中多主棒孢菌的检测主要沿用传统的组织分离培养、形态学特征观察、致病力鉴定等方法，检测周期长，灵敏性低，易受人为及环境等诸多因素干扰，不易在病害潜伏期和初发期作出及时正确的诊断。

 近年来，随着分子生物学的发展，基于PCR 技术的检测方法以成功应用于多种病原菌的检测，虽然PCR技术具有特异性强和灵敏度高的优点，但其检测时间比较长，需要专用 PCR仪、电泳仪和专业操作人员实施和观测检测结果，检测过程复杂，技术难度高，难以在基层大规模推广应用。

环介导恒温扩增（LAMP）是日本学者发明的一种新的基因高效扩增技术，不仅反应体系简单，而且仅需要恒温条件即可完成，同时结果判别简单明了。LAMP反应体系由模板DNA、2对特异性引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液构成，在65℃左右的恒温条件下，Bst DNA聚合酶催化引物反复进行高效的链置换反应和环介导扩增，整个反应约需60 min左右，大量合成目标DNA的同时伴随副产物的产生，反应管底部可见大量白色沉淀。

 LAMP方法与 PCR 技术相比，具有检测时间短，灵敏度和特异性高，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测等优点。目前，LAMP方法已经成功应用于多种植物病原微生物的检测，如葫芦卷叶病毒、番茄黄花曲叶病毒、柑橘溃疡菌（Xanthomonas campestris）、镰刀菌（Fusarium graminearum）、灰霉菌(Botrytis cinerea)、小麦叶锈病菌（Puccinia striiformis）等，在病害发病初期即可快速的对病害进行诊断，及时指导农民采取有效的防治措施。而对于多主棒孢菌的LAMP检测方法的建立目前还没有报道。

 本发明利用多主棒孢菌特异性的毒素cassiicolin基因序列特征设计了4条特异性的LAMP引物，在此基础上建立多主棒孢菌的LAMP检测方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种多主棒孢菌的特异性好、灵敏度高、快速简单的环介导等温扩增检测技术，发明内容涉及多主棒孢菌的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。

 一种快速检测多主棒孢菌的检测方法涉及的引物组，由4条特异性的引物组成，分别为内引物CC-FIP和CC-BIP、外引物CC-F3和CC-B3。4条特异性的引物序列如下：

正向外引物CC-F3 (5’ to3’)：GAAGGTAGGCTTCTTTCCCG（如 SEQ ID NO.1所示） ；

 反向外引物CC-B3 (5’ to3’)：GGATGTGCGTCATGGTGTT（如 SEQ ID NO.2所示） ；

 正向内引物CC-FIP (5’ to3’)：ATAACGGCTACGCACAGCGGCTTTTGCCCCCGCGA

TTC（如 SEQ ID NO.3所示） ；

 反向内引物CC-BIP(5’ to3’)：GCACTGAGGGGCAATTTGCATGGAGTTGGCGAATG

TCCGG（如SEQ ID NO.4所示）。

 所述的引物组合在检测多主棒孢菌中应用。

 所述的待检样品可以为黄瓜组织或者真菌纯培养物。

 所述的通过环介导等温扩增的方法利用上述特异性的引物组，反应体系的总体积为25μL，包括2.5μL 1×Thermol反应缓冲液、1.5μL 1.4mM dNTPs、0.5μL 0.2μM 正向外引物CC-F3、0.5μL 0.2μM反向外引物CC-B3、2μL 1.6μM 正向内引物CC-FIP、2μL 1.6μM反向内引物CC-BIP、1μL 0.8mM甜菜碱、13μL灭菌双蒸水，0.5μL 8U/μL Bst DNA 聚合酶和1.5μL DNA模板。反应条件为65℃水浴锅中恒温反应60min，然后80℃ 2min终止反应。

 所述的扩增产物的检测，可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测。优选用荧光显色检测，具体是等温扩增后，扩增反应管中加入SYBR GreenⅠ显色剂0.25μL，5min后肉眼直接观察结果，如果颜色为橙色，则样品阴性，无多主棒孢菌，如果颜色为绿色，则样品阳性，含有多主棒孢菌。

所述的1×Thermol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其含有 20mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、10mmol/L氯化钾（KCl）、10mmol/L 硫酸铵(NH4)₂SO₄、2mmol/L硫酸镁(MgSO₄)和0.1%曲拉通X-100（TtitonX-100），余量为灭菌双蒸水。

 本发明根据多主棒孢菌特异的毒素cassiicolin靶基因序列设计和筛选了一套特异性检测引物组，并通过环介导等温扩增的方法，确定待检测样品中是否存在多主棒孢菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）成本低、操作简单。本发明最大的优点是不需要以往 PCR 检测所需要的 PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统等昂贵的专业仪器，仅需一台恒温仪器，如水浴锅即可；本发明不需要PCR检测中繁琐的操作步骤和规程，简单易行。

（2）检测快速。应用本发明的检测方法，可在1.5h内得到检测结果，而以往的 PCR 或巢式PCR检测需4～6h才可得到检测结果；本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速。

（3）检测结果肉眼可直接判断。本发明扩增产物加入显色剂染色后，绿色为阳性，即待测样品中含多主棒孢菌；橙色为阴性，待测样品中不含多主棒孢菌。无需电泳检测及凝胶成像系统。

（4）特异性强：本发明设计的引物组是该技术的关键，该引物组根据多主棒孢菌特异性的毒素cassiicolin基因设计得到，引物组包含4条特异性的引物，可识别靶标序列上的6个独立区域，相对于PCR反应的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都大大提高。

 本发明建立的多主棒孢菌LAMP检测方法，克服了现有PCR等分子生物学检测技术的技术难度大、检测周期长、硬件设备要求高等问题，LAMP检测方法可以在恒温条件下，快速、简单、方便的检测到多主棒孢菌，试验不需要复杂的仪器，检测结果可肉眼直接观察，满足了黄瓜棒孢叶斑病田间诊断的需要，实现了病害潜伏期监测，早期诊断的目的。

具体实施方式

 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

 实施例1多主棒孢菌的LAMP检测

 为了验证LAMP检测方法的可行性，选择黄瓜棒孢叶斑病标本上分离到的、经形态学和分子生物学鉴定的多主棒孢菌HB2纯培养物作为靶标菌株，以其基因组DNA为模板。LAMP反应体系的总体积为25μL，包括2.5μL 1×Thermol 反应缓冲液、1.5μL 1.4mM dNTPs、0.5μL 0.2μM 正向外引物CC-F3、0.5μL 0.2μM反向外引物CC-B3、2μL 1.6μM 正向内引物CC-FIP、2μL 1.6μM反向内引物CC-BIP、1μL 0.8mM甜菜碱、13μL灭菌双蒸水，0.5μL 8U/μL Bst DNA 聚合酶和1.5μL DNA模板，以加入1.5μL灭菌双蒸水的作为阴性对照。反应条件为65℃水浴锅中恒温反应60min，然后80℃ 2min终止反应。检测结果判定方法：加入0.25μL SYBR GreenⅠ反应显色剂，5min后肉眼直接观察。结果显示以4条特异性的引物扩增多主棒孢菌纯培养物的DNA模板，经反应显色剂作用后，反应管溶液变为绿色，而阴性对照的反应管没有颜色变化。这表明本发明建立的LAMP方法可以在多主棒孢菌检测中应用。

 实施例2多主棒孢菌的LAMP引物特异性扩增试验

收集靶标病原多主棒孢菌及非靶标病原、常见污染菌共19株（试验菌株见表 1）， 以19株菌株的基因组DNA为待测模板DNA。LAMP反应体系的总体积为25μL，包括2.5μL 1×Thermol 反应缓冲液、1.5μL 1.4mM dNTPs、0.5μL 0.2μM 正向外引物CC-F3、0.5μL 0.2μM反向外引物CC-B3、2μL 1.6μM 正向内引物CC-FIP、2μL 1.6μM反向内引物CC-BIP、1μL 0.8mM甜菜碱、13μL灭菌双蒸水，0.5μL 8U/μL Bst DNA 聚合酶和1.5μL DNA模板，以加入105μL灭菌双蒸水的作为阴性对照。反应条件为65℃水浴锅中恒温反应60min，然后80℃ 2min终止反应。检测结果判定方法：加入0.25μL SYBR GreenⅠ反应显色剂，5min后肉眼直接观察。结果显示以4条特异性的引物扩增靶标病原多主棒孢菌DNA模板，经反应显色剂作用后，靶标多主棒孢菌DNA反应管的溶液变为绿色，而扩增非靶标DNA和阴性对照的反应管均没有颜色变化（见表1）。本实施例说明本发明的LAMP方法具有较好的特异性，只有多主棒孢菌菌株扩增阳性，其他非靶标菌株为阴性。

 表1 试验所用菌株及测试结果

 +：扩增反应为阳性；-：扩增反应为阴性

 由表1可以看出，本发明中的LAMP方法具有较好的特异性，只有多主棒孢菌菌株扩增阳性，其他非靶标病原菌及常见污染菌均为阴性。

实施例3多主棒孢菌的LAMP引物的灵敏度试验

 为了确定多主棒孢LAMP检测方法的灵敏度，将提取的多主棒孢菌纯培养物的DNA用分光光度计测定浓度，调节为浓度为1μg/μl的DNA溶液，然后用 DEPC水进行10倍梯度稀释，制备浓度为1μg/μl，100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl,100pg/μl，10pg/μl和1pg/μl的标准DNA溶液，分别取1.5μl各浓度标准溶液作为模板DNA，按实施例1的方法进行 LAMP反应和结果观察。结果显示建立的LAMP方法可以检测到浓度是0.1ng/μl的多主棒孢菌的DNA。

Claims (6)

1.一种用于快速检测黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述的引物为外引物CC-F3和CC-B3，内引物CC-FIP和CC-BIP，其引物的核酸序列为分别为 SEQ ID NO：1-4。

2.权利要求1所述的引物组合在多主棒孢菌的快速检测中应用。

3.一种黄瓜棒孢叶斑病病原多主棒孢菌的检测方法，其特征在于，提取待测样品的DNA，然后通过环介导等温扩增的方法利用权利要求1所述的检测引物组对待检样品DNA进行特异性扩增，确认是否存在扩增产物。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的待测样品为黄瓜叶片或真菌纯培养物。

5.根据权利要求3所述的检测方法， 其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求 1 所述的检测引物组对多主棒孢菌的 DNA 进行特异性扩增，具体扩增体系总体积为25μL，包括2.5μL 1×Thermol 反应缓冲液、1.5μL 1.4mM dNTPs、0.5μL 0.2μM 正向外引物CC-F3、0.5μL 0.2μM反向外引物CC-B3、2μL 1.6μM 正向内引物CC-FIP、2μL 1.6μM反向内引物CC-BIP、1μL 0.8mM甜菜碱、13μL灭菌双蒸水，0.5μL 8U/μL Bst DNA 聚合酶和1.5μL DNA模板；其中1×Thermol Buffer成分为：20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH₄) ₂ SO₄，2 mmol/L MgSO₄，0.1％Triton X-100。

6.一种黄瓜棒孢叶斑病病原多主棒孢菌的快速检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物组合；扩增反应体系依据权利要求5配制；将配制好的反应液在65℃水浴锅中恒温反应60min，然后80℃ 2min终止反应；扩增反应结束后，加入染料SYBR Green I，以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准：日光下目测呈绿色表示检测结果为阳性，存在多主棒孢菌，日光下目测呈橙色表示检测结果为阴性，不存在多主棒孢菌。