CN106434993B - 用于检测黄瓜枯萎病菌的lamp引物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）的LAMP引物组合物及其应用。用于检测黄瓜枯萎病菌的LAMP引物组合物由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成。本发明还提供了一种应用上述引物的黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法，其具体步骤包括：1）提取待测样品基因组DNA，2）LAMP反应体系的建立，3）结果检测；本发明的LAMP反应体系在63℃等温条件下进行，通过1h温育便能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到黄瓜枯萎病菌。本发明不需要复杂仪器，能较好地满足对黄瓜枯萎病菌的现场检测，可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治黄瓜枯萎病提供可靠的技术和理论依据。
Description
技术领域
本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种用于检测黄瓜枯萎病菌的LAMP引物组合物及其应用，可用于黄瓜枯萎病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于黄瓜枯萎病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
背景技术
由黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen）引起的黄瓜枯萎病，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一种由土壤传染，从根或根茎部侵入，在维管束内寄生的系统性病害，是黄瓜生产上较难防治的病害之一，该病由于具有发病快、病害重、传播迅速等特点，一旦发生常造成经济巨大损失。此病的初侵染源主要是带病菌的土壤、病株残体、种子和粪肥等，病菌从腐烂的寄主组织里散布到土中可营腐生活，存活时间长达5～6年或更长的时间。黄瓜枯萎病菌可借助雨水、灌溉水等进行远距离传播，整个生长期均能发生，以开花结瓜期发病最多。随着农业结构的调整和设施栽培技术的不断发展，黄瓜种植的面积也越来越大，近年来黄瓜枯萎病有进一步加重的趋势，一般可导致黄瓜产量减少 25%~ 65%，重则达 70%以上，甚至全株枯死，导致绝收，严重影响黄瓜的产量和品质。由于黄瓜枯萎病是一种土传病害，防治上主要以预防为主，防治是否及时，直接影响了对土传病害的防治效果。因此生产上迫切需要建立一种快速、准确的黄瓜枯萎病检测方法,为病害的早期诊断与防治、监测、预测预报提供支持和服务，对发展黄瓜生产、增加瓜农收入、保障消费者健康、减少环境污染和维持农业可持续发展，都具有重大的理论和生产意义。
目前病原菌的检测方法较多，传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。然而真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。
随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为病原菌的分类鉴定提供了技术条件。如血清学免疫学技术、常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等技术为病原菌的分类鉴定提供了灵敏度高、快速的检测技术。但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性。PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR 等，PCR技术检测时间较长，需要依赖贵重、精密的PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备及相应的高新技术人员,因而提高了检测成本，并限制了其应用范围，不利于基层生产上推广应用，限制了这些先进方法的推广应用。
环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至109~1010个拷贝数。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低，LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR Green Ⅰ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于黄瓜枯萎病菌的LAMP检测国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中对黄瓜枯萎病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了黄瓜枯萎病菌新的分子检测方法，对黄瓜枯萎病菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1. 黄瓜枯萎病菌LAMP检测特异性引物组合物：
通过测定黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）和其它镰孢菌（Fusarium spp）的translation elongation factor 1-alpha gene (EF-1alpha)基因序列，对镰刀属及其它病原菌不同种间EF-1alpha基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套黄瓜枯萎病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：
F3: 5’-GCGTTTGCCCTCTTACCATT-3’，
B3: 5’-GCATGAGCGACAACATACCA-3’，
FIP: 5’-CGAGCTCAGCGGCTTCCTATTCACAACCTCAATGAGTGCGT-3’，
BIP: 5’-TTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA- 3’。
2. 黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA。
用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol· L-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
用于检测植物组织中存在黄瓜枯萎病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；
用于检测土壤样品中存在黄瓜枯萎病菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。
（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；
（3）LAMP反应条件：63 ℃温育60 min；
（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBRgreenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在黄瓜枯萎病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在黄瓜枯萎病菌；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在黄瓜枯萎病菌，没有出现条带则判断为阴性，不存在黄瓜枯萎病菌。
本发明的显著优点
本发明的有益效果：本发明提供的黄瓜枯萎病菌LAMP检测引物特异性强、扩增效果好；且将其应用于黄瓜枯萎病菌LAMP检测，具有快速、简便、特异性强、灵敏度高的LAMP检测技术体系，可用于带菌植株组织和土壤中黄瓜枯萎病菌的检测，或用于黄瓜枯萎病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。
本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、特异性强、结果可靠：靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区( Internal transcribed space ,ITS )，然而许多学者认为该靶标不能够很明确的区分镰孢属真菌及尖孢镰孢菌不同专化型。发明人以普通PCR技术检测黄瓜枯萎病菌的研究中发现EF-1alpha基因序列在Fusarium种内及尖孢镰孢菌不同专化型不同菌株间具有一定的保守性，种间存在丰富的变化，是相比rDNA‐ITS、β‐ tubulin序列更好的分子检测靶标。本发明分析了黄瓜枯萎病菌EF-1alpha基因和其他镰孢菌在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的LAMP引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明利用所设计出的LAMP引物基础上建立了黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法，黄瓜枯萎病菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明LAMP检测方法特异性强，结果可靠。
2、灵敏度高： 本发明对黄瓜枯萎病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性。
3、实用性好：本发明的LAMP检测方法不像PCR检测法需要要热循环仪（PCR仪）等贵重仪器设备，这样就摆脱了对热循环仪等贵重设备的依赖，只要有稳定的热源，LAMP 反应就可以发生，极大扩展了黄瓜枯萎病菌的检测范围。同时本发明的LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。
4、操作简便快速：本发明提供的检测黄瓜枯萎病菌的LAMP方法克服了现有技术中黄瓜枯萎病菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及PCR检测技术需要热循环仪等贵重设备，无法快速检测黄瓜枯萎病菌的问题。本发明检测方法在63℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到黄瓜枯萎病菌，不需要复杂仪器，只需一个恒温设备即可，能较好满足对黄瓜枯萎病菌的现场检测。
附图说明
图1 为本发明黄瓜枯萎病菌的LAMP特异性检测。图1-a为LAMP扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：M为DL 2000 DNA marker，1为黄瓜枯萎病菌，2为其它病原菌，3为阴性对照。图1-b为LAMP扩增后的荧光染料可视化显色结果，其中，管1为绿色，管2-3为浅橘色。
图2 为本发明黄瓜枯萎病菌LAMP检测灵敏性。图2-a为LAMP扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中： M 为2000 DNA marker，1-10模板DNA浓度分别为1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag、1 ag，11为阴性对照。图2-b为LAMP扩增后的荧光染料显色结果，其中，管1-6为绿色，7-11为橙色。
图3 为本发明检测方法对发病植株和带菌土壤中黄瓜枯萎病菌的检测。图3-a为LAMP扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：M为DL 2000 DNA marker，1、2为黄瓜枯萎病发病根部，3为健康黄瓜根部，4-5为黄瓜枯萎病发病茎杆（离地表4-6cm处），6-健康黄瓜茎杆（离地表4-6cm处），7、8为黄瓜枯萎病发病田块土壤，9为高压灭菌土壤，10为阳性对照，11为阴性对照。图3-b为LAMP扩增后的荧光染料显色结果，管1-2、4-5、7-8、10为绿色，管3、6、9、11为浅橙色。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
实施例 1：黄瓜枯萎病菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物组合物的设计及引物特异性验证
1.供试菌株基因组DNA的提取
采用CTAB 法提取供试菌株（表1）基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/LNaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r· min-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3mol·L-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
表1 供试菌株
2.黄瓜枯萎病菌环介导等温扩增（LAMP）特异引物组合物的设计
通过测定黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）和其它镰孢菌（Fusarium spp）的translation elongation factor 1-alpha gene(EF-1alpha)基因序列，对镰刀属及其它病原菌不同种间EF-1alpha基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套黄瓜枯萎病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列发下：
F3: 5’-GCGTTTGCCCTCTTACCATT-3’，
B3: 5’-GCATGAGCGACAACATACCA-3’，
FIP: 5’-CGAGCTCAGCGGCTTCCTATTCACAACCTCAATGAGTGCGT-3’，
BIP: 5’-TTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA- 3’。
3.黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证
以表1供试菌株的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在黄瓜枯萎病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在黄瓜枯萎病菌；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在黄瓜枯萎病菌，没有出现条带则判断为阴性，不存在黄瓜枯萎病菌。
4.引物特异性验证结果
LAMP扩增结果表明，供试的黄瓜枯萎病菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，其余镰孢菌和真菌显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带（附图1），说明所设计的黄瓜枯萎病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP可以将黄瓜枯萎病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于黄瓜枯萎病菌快速可靠的检测和鉴定。
实施例2：黄瓜枯萎病菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定
1.不同浓度基因组DNA的制备
用无菌超纯水对黄瓜枯萎病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；
2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察
以不同浓度的黄瓜枯萎病菌基因组DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同浓度DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μLLAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。
3. LAMP扩增灵敏度检测结果
LAMP扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的黄瓜枯萎病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明所设计的黄瓜枯萎病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP通过LAMP扩增，对黄瓜枯萎病菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（附图2）。
实施例3：发病组织中黄瓜枯萎病菌的LAMP检测
样品采集：从福建福州、霞浦、福安采集黄瓜枯萎病发病症状典型的根部、茎杆（离地表4-6cm处）及健康根部和茎杆带回实验室备用；
植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。
扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。
检测结果：检测结果（附图3）表明，黄瓜枯萎病发病的黄瓜根、茎部通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，说明存在黄瓜枯萎病菌，而健康根、茎及阴性对照显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明不存在黄瓜枯萎病菌，该套技术能用于植物组织中黄瓜枯萎病菌的快速分子检测。
实施例4：带菌土壤中黄瓜枯萎病菌的LAMP检测
样品采集：从福建福州、霞浦、福安黄瓜枯萎病发病严重的田块采集植株根部土壤带回实验室备用，以高压灭菌的土壤为对照；
土壤DNA提取：采用Sigma公司的土壤DNA提取试剂盒（Sigma,DNB100,Soil DNAIsolation Kit）提取土壤中的总DNA，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。
扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。
检测结果：检测结果（附图3）表明，黄瓜枯萎病发病严重田块土壤DNA通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，说明存在黄瓜枯萎病菌，而高压灭菌土壤及阴性对照显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明不存在黄瓜枯萎病菌，该套技术可用于土壤中黄瓜枯萎病菌的快速分子检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 用于检测黄瓜枯萎病菌的LAMP引物组合物及其应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> F3
<400> 1
gcgtttgccc tcttaccatt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> B3
<400> 2
gcatgagcga caacatacca 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> FIP
<400> 3
cgagctcagc ggcttcctat tcacaacctc aatgagtgcg t 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> BIP
<400> 4
ttcttgacaa gctcaaggcc gaaggagtct cgaacttcca ga 42
Claims (5)
1.用于检测黄瓜枯萎病菌的LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，其核苷酸序列如下：
F3: 5’-GCGTTTGCCCTCTTACCATT-3’，
B3: 5’-GCATGAGCGACAACATACCA-3’，
FIP: 5’-CGAGCTCAGCGGCTTCCTATTCACAACCTCAATGAGTGCGT-3’，
BIP: 5’-TTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA- 3’。
2.一种利用权利要求1所述引物组合物进行黄瓜枯萎病菌LAMP检测的方法，其特征在于包括以下具体步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）LAMP反应体系的建立：LAMP检测反应体系为25 μL，以步骤（1）提取的DNA为模板，反应体系包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；
（3）LAMP反应条件：63 ℃温育60 min；
（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定；
采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在黄瓜枯萎病菌，橙色或橘黄色判断为阴性，不存在黄瓜枯萎病菌；
采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在黄瓜枯萎病菌，没有出现条带则判断为阴性，不存在黄瓜枯萎病菌。
3.根据权利要求2所述的一种黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应混合液由以下组分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100。
4.利用权利要求1所述的黄瓜枯萎病菌LAMP检测引物组合物在黄瓜炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。
5.利用权利要求2所述的黄瓜枯萎病菌LAMP检测方法在黄瓜炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。
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