CN106434998B

CN106434998B - 芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物及检测方法

Info

Publication number: CN106434998B
Application number: CN201611110428.7A
Authority: CN
Inventors: 兰成忠; 姚锦爱; 阮宏椿; 吴玮
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2016-12-06
Filing date: 2016-12-06
Publication date: 2019-08-27
Anticipated expiration: 2036-12-06
Also published as: CN106434998A

Abstract

本发明公开了一种芋疫霉菌环介导等温扩增（LAMP）检测引物及其快速检测方法，可用于芋疫霉菌的特异性检测。通过设计芋疫霉菌的LAMP检测引物，经恒温扩增，采用SYBR green Ⅰ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。本发明的LAMP引物及检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，为芋疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于生产实践中芋疫霉菌感染的植株或者发病初期芋疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治芋疫病提供可靠的技术和理论依据。

Description

芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物及检测方法

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种芋疫霉菌的环介导等温扩增（LAMP）检测引物及其快速检测方法，可用于芋疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于芋头疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae）属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。芋疫霉菌是芋头生产上的一种危害极为严重的病原菌。由芋疫霉菌侵染引起的芋头疫病是芋头栽培中的主要病害之一，在芋头产区广泛分布与发生。该病初侵染主要来源于带菌的种苗和遗留田间的病株，一般4月份开始零星发生，6-9月盛行，发病率一般为20%-35%，主要危害叶片、叶柄，严重时亦危害球茎，遇高温、雨天病斑快速发展，导致叶片大量腐烂、植株折倒枯死，造成芋头产量和品质下降，芋头受害之后，产量损失高达30%-40%。近年来，随着种植结构的调整及经济效益的提升，芋头种植面积不断扩大，但是由于连年种植，芋疫病呈逐年加重趋势。

芋疫霉菌具有很强的侵染性，一旦扩散蔓延则难以控制，如果能够在芋疫霉菌感染早期，及时、准确地进行检测鉴定，可以做到提前预防，如选择敏感有效的杀菌剂，对控制病情的流行大暴发具有重要意义。因此，建立一种能够快速、准确的监测和鉴别芋疫霉菌的检测方法对于我国芋头的安全生产具有重大的意义。

植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。

随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多，但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR 等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，不利于基层生产上推广应用，上述缺欠限制了这些先进方法的推广应用。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至10⁹~10¹⁰个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR GreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济，且无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于芋疫霉菌的LAMP检测国内外均未见报道。

本发明基于环介导等温扩增（LAMP）技术原理，选取疫霉菌Ypt1基因为检测靶标，在Ypt1基因靶标序列的6个区域设计了4条芋疫霉菌特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，建立以SYBR GreenⅠ为荧光显色指示剂的芋疫霉菌可视化LAMP 检测技术。该技术操作简单、灵敏度和特异高，且无需贵重仪器设备，适宜于田间芋疫病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对芋疫病及时、有效的防治具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物及检测方法，针对现有技术中对芋疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了一种芋疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法，本发明检测方法易于操作、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 芋疫霉菌LAMP检测特异性引物的设计：通过测定芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae）和其它疫霉菌（Phytophthora spp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套芋疫霉菌特异性LAMP引物，包括1对外侧引物PcoF3/PcoB3和1对内侧引物PcoFIP/PcoBIP，其序列为：

外侧引物：

PcoF3:5’-ACTCGTCATCCACCTGAGT- 3’，

PcoB3:5’-CCACTGCTTGACGTTGTTGA- 3’；

内侧引物：

PcoFIP:5’-AATCGTGCGGAAACGCTCCTGTGGTTGTGCCAACTCCCT- 3’，

PcoBIP:5’-CTAGCAGCTACTACCGTGGTGCCTCTTGGTCCGTCACATCG- 3’。

2. 芋疫霉菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA为模板。

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

用于检测芋头组织中存在芋疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在芋疫霉菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物PcoF3和PcoB3各1.0 μL，40 μM内侧引物PcoFIP和PcoBIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水补足至25 μL；

（3）LAMP反应条件：64 ℃温育60 min，85℃灭活5min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBRgreenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。

本发明的有益效果：本发明建立了芋疫霉菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的LAMP检测技术体系，可用于带菌植株组织和土壤中芋疫霉的检测，或用于芋疫霉菌引起病害的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强、结果可靠：本发明所设计的LAMP引物是基于疫霉菌Ypt1基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。本发明利用所设计出的LAMP引物建立了芋疫霉的LAMP检测方法对芋疫霉菌和其它疫霉菌或病原真菌进行了特异性测试，只有芋疫霉能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明LAMP检测方法特异性强，结果可靠。

2、灵敏度高：本发明对芋疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性。

3、实用性好：本发明的LAMP检测方法不像PCR法需要要热循环仪（PCR仪）等贵重仪器设备，摆脱了对热循环仪等贵重设备的依赖，只要有稳定的热源，LAMP 反应就可以发生，极大扩展了LAMP使用的范围。同时本发明的LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。

4、操作简便快速：本发明提供的检测芋疫霉菌的LAMP方法克服了现有技术中芋疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及PCR检测技术需要热循环仪等贵重设备，无法快速检测芋疫霉菌的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到芋疫霉菌，不需要复杂仪器，只需一个恒温设备即可，能较好满足对芋疫霉菌的现场检测。

附图说明

图1 为本发明芋疫霉菌的LAMP特异性检测。图1-a为LAMP扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图1-b为LAMP扩增后的荧光染料可视化显色结果，其中：M为DL 2000 DNAmarker，1-6为芋疫霉菌，7-10分别为辣椒疫霉菌、晚疫病菌、大豆疫霉菌和豇豆疫霉菌，11为阴性对照，1-6显示绿色荧光。

图2 为本发明芋疫霉菌LAMP检测灵敏性。图2-a为LAMP扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图2-b为LAMP扩增后的荧光染料显色结果，其中： M 为2000 DNA marker，1-8模板DNA浓度分别为10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag、1 ag，9为阴性对照，1-4显示绿色荧光。

图3 为本发明检测方法对发病植株和带菌土壤中芋疫霉菌的检测。图3-a为LAMP扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图3-b为LAMP扩增后的荧光染料显色结果，其中：M为DL2000 DNA marker，1为阳性对照，2-3为发病叶片，4-5为带菌土壤，6-7为健康叶片，8为高压灭菌土壤，9为阴性对照，1-5显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：芋疫霉菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物的设计及引物对芋疫霉菌的特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

采用CTAB 法提取供试菌株（表1）基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/LNaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r.min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

表1 供试菌株

2.芋疫霉菌环介导等温扩增（LAMP）特异引物的设计

通过测定芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae）和其它疫霉菌（Phytophthora spp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/ elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套芋疫霉菌特异性LAMP引物，包括1对外侧引物PcoF3/PcoB3和1对内侧引物PcoFIP/PcoBIP，其序列为：

外侧引物：

PcoF3:5’-ACTCGTCATCCACCTGAGT- 3’，

PcoB3:5’-CCACTGCTTGACGTTGTTGA- 3’；

内侧引物：

PcoFIP:5’-AATCGTGCGGAAACGCTCCTGTGGTTGTGCCAACTCCCT- 3’，

PcoBIP:5’-CTAGCAGCTACTACCGTGGTGCCTCTTGGTCCGTCACATCG- 3’；

3.芋疫霉菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证

以表1供试菌株的DNA为模板，利用外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物PcoF3和PcoB3各1.0μL，40 μM内侧引物PcoFIP和PcoBIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM(NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.%Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min，85℃灭活5min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。

4.引物特异性验证结果

LAMP扩增结果表明，供试的芋疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，其余疫霉菌和真菌显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带（附图1），说明所设计的芋疫霉菌外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP可以将芋疫霉菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于芋疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：芋疫霉菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组DNA的制备

用无菌超纯水对芋疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的芋疫霉菌基因组DNA为模板，利用外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物PcoF3和PcoB3各1.0 μL，40 μM内侧引物PcoFIP和PcoBIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mMdNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同浓度DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min，85℃灭活5min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μLLAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。

3. LAMP扩增灵敏度检测结果

LAMP扩增灵敏度检测结果表明，10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的芋疫霉菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明所设计的芋疫霉菌外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP通过LAMP扩增，对芋疫霉菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（附图2）。

实施例3：芋头发病叶片中芋疫霉菌的LAMP检测

样品采集：从福建福州、霞浦、福鼎采集芋头疫病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

发病叶片中芋疫霉菌DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物PcoF3和PcoB3各1.0 μL，40 μM内侧引物PcoFIP和PcoBIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mMTris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄， 1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min，85℃灭活5min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。

检测结果：检测结果（附图3）表明，芋头疫病发病症状典型的叶片基因组DNA通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明该套技术能用于芋头组织中芋疫霉菌的快速分子检测。

实施例4：带菌土壤中芋疫霉菌的LAMP检测

样品采集：从福建福州、霞浦、福鼎芋头疫病发病严重的田块采集植株根部土壤带回实验室备用，以高压灭菌的土壤为对照；

土壤DNA提取：采用Sigma公司的土壤DNA提取试剂盒（Sigma,DNB100,Soil DNAIsolation Kit）提取土壤中的总DNA，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

检测结果：检测结果（附图3）表明，芋头疫病发病严重田块土壤DNA通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征的梯形带，而高压灭菌土壤及阴性对照显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明该套技术可用于土壤中芋疫霉菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物及检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcgtcatc cacctgagt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccactgcttg acgttgttga 20

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aatcgtgcgg aaacgctcct gtggttgtgc caactccct 39

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagcagcta ctaccgtggt gcctcttggt ccgtcacatc g 41

Claims

1.芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物，其特征在于，所述引物包括1对外侧引物PcoF3/PcoB3和1对内侧引物PcoFIP/PcoBIP，其序列为：

外侧引物：

PcoF3:5’-ACTCGTCATCCACCTGAGT- 3’，

PcoB3:5’-CCACTGCTTGACGTTGTTGA- 3’；

内侧引物：

PcoFIP:5’-AATCGTGCGGAAACGCTCCTGTGGTTGTGCCAACTCCCT- 3’，

PcoBIP:5’-CTAGCAGCTACTACCGTGGTGCCTCTTGGTCCGTCACATCG- 3’。

2.利用权利要求1所述引物的芋疫霉菌LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA；

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物PcoF3和PcoB3各1.0 μL，40 μM内侧引物PcoFIP和PcoBIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：64 ℃温育60 min，85℃灭活5min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定；

采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。

3. 根据权利要求2所述的芋疫霉菌LAMP检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的LAMP反应混合液由以下组分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100。

4.如权利要求1所述的引物在田间芋头疫病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。