CN103014152A

CN103014152A - 一种用于检测大豆疫霉的lamp引物、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103014152A
Application number: CN2012104725877A
Authority: CN
Inventors: 赵伟; 戚仁德; 汪涛
Original assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明公开了一种用于检测大豆疫霉的LAMP引物、试剂盒及其检测方法：提取待检测物DNA，取1μL溶液作为反应模板，取试剂盒中的溶液24μL加入200μL反应小管中，模板混匀后放入65℃恒温水浴中，30-60min内观察小管中溶液颜色的变化，如果颜色由浅紫色变为天蓝色，则说明待检物中含有大豆疫霉，如果溶液颜色没有变化，说明待检物中不含有大豆疫霉。与传统的只是跟据形态特征来确定大豆疫霉的检测技术相比较，本发明具有更高的准确性、灵敏度和时效性。本发明通过实验验证，在不同的疫霉种之间，大豆疫霉的检出率为100%，准确性及特异性高；本发明最低可以检测出10pgDNA含量的样品，灵敏度高；本发明的耗时只要30—60min，加上样品的富集及DNA的提取，最快只需要半个工作日，时效性高。

Description

一种用于检测大豆疫霉的LAMP引物、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明主要涉及一种用于检测大豆疫霉的LAMP引物、试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

大豆是世界上重要经济农作物，大豆疫霉(Phytophthora sojae）侵染大豆而引起幼苗猝死和成株的根腐病是世界大豆生产上的主要病害之一，每年给世界大豆产业带来巨额经济损失。大豆疫霉菌可以在大豆生长的各个时期侵染大豆，在潮湿多雨的季节病害发生尤其严重，由于大豆疫霉以同宗配合的方式进行有性生殖，在发病植株上可以产生大量的卵孢子，植物收获后残留在土壤中的卵孢子就成为大豆疫霉的初侵染源，大豆疫霉的卵孢子可以在土壤中存活5年以上，因此，大豆疫霉根腐病一旦发生将很难消除。大豆疫霉是我国对外公布的A1类进境植物检疫对象。

近年来，随着我国大豆需求量的加大，从美国等国家进口的商品大豆日趋增多，每年进口大豆的数量几乎超过了国产大豆年生产量的总和，而这些国家大豆疫霉病害的发生普遍较严重。由于大豆疫霉是典型的土传病害，卵孢子能在土壤中长期生存，而进境大豆中所夹带的土壤极有可能携带大豆疫霉病菌，增加了大豆疫病传播扩散的风险，这种严峻的形势下，快速准确地检测病原菌和诊断病害是控制病害成灾的主要措施之一。

大豆疫霉的传统检测方法是用大豆叶碟从土壤中进行诱捕和平板培养或者将二者相结合，传统方法在大豆疫霉检测及菌株分离中发挥了重要作用。但大豆疫霉病原菌与其他疫霉菌的形态特征非常相似，以形态特征为基础的传统检测方法需要20天左右才能确定进口大豆中是否带菌，而且该方法要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，从而导致经常出现漏检，无法满足田间疫情调查和海关检疫的要求。

自聚合酶链式反应（PCR）发明以来，便以其快速灵敏的特性成为动植物病原物检测的重要方法。伴随着各个病原物基因组测序的完善，很多特异性的核酸序列被用来作为PCR反应特异性靶标，可以更加准确地对病原物进行鉴定。但PCR作为科研机构中普遍使用的分子操作方法，需要较为昂贵的仪器及价格不菲的分子试剂及耗材，而且其产物必须经过电泳、染色后才能检测到，使得这一技术很难在基层进行推广和普及，但基层又常常是最需要准确、快速进行病害诊断的地方。

2000年，Notomi等人研发出了一项全新的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术（LAMP, loop-mediated isothermal amplification）。该技术使用四条或六条引物，以Bst DNA聚合酶作为扩增酶，65℃恒温条件下对目标片段进行扩增。其产物可以通过凝胶电泳进行观察，同时可以通过目测直接进行观察，即在反应体系中加入羟基萘酚蓝（HNB, hydroxynaphthol blue），溶液颜色由紫色变为天蓝色说明存在被扩增的目的片段。LAMP技术的发明，为病原物快速检测建立了一个良好的平台，该技术具有非常鲜明的特点，不需要模板核酸片段的热变性、长时间的温度变化循环、实验结果不需要凝胶电泳染色后进行紫外观察，这就避免了普通PCR所需要昂贵的实验仪器以及专业的实验操作场所，因而该技术适合在基层、进出口检疫部门进行快速的病原物诊断。

发展分子检测最重要的一点就是选用合适的分子检测靶标。目前广泛采用的靶标是基于核糖体转录间隔区域（ITS）序列，ITS序列具有物种间高度变异和种内保守的特性，这使得ITS序列可以在物种的各个分类水平上进行区分。但是，伴随着现代分子生物学的快速发展，各个物种基因组序列的不断公布，发现很多不同种的ITS序列具有很高的相似性，使用ITS序列很难将这些种区分开。而且由于ITS在基因组中是多拷贝的，并不适合开发定量检测方法。因此必须开发出更多的分子检测靶标以满足植物病原菌分子检测的需要。随着疫霉基因组学的发展，不断有新的分子靶标被发现并用于分子检测。在这些新发现的分子靶标中，Ypt1被认为是一个适合用于疫霉菌分子检测的靶标。Ypt1是一个Ras相关编码蛋白基因，其DNA序列包含多个内含子，该基因保守编码区和变异的非编码区相互间隔，该基因所具有的这些特性使其非常适合作为分子检测的靶标。

本发明通过序列比对分析大豆疫霉和其他疫霉菌在Ypt1基因序列上的差异，设计了大豆疫霉特异性的LAMP引物，在此基础上建立了大豆疫霉LAMP快速检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测大豆疫霉的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测大豆疫霉的LAMP引物、试剂盒及其检测方法，所述的LAMP引物有3对，分别是：

F3: CCTTGTCTGCCCTCTCGA

B3: AGAAGCGTACACCCACCA

FIP: GAATTTTCTGGGCGGGACAACGCCAGGATGGCTAAGGTTTCC

BIP: GAGCTGGACGGCAAGACCATCCATAAGTGCGCTTAACCGG

LF: GCACAATATTGTCAGCAACTGGATC

LB: CAAGCTCCAGATTGTACGTTCA；

所述的试剂盒、试剂及其浓度为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、10 mM (NH₄)₂SO₄、50 mM KCl、8 mM MgSO₄、0.1 % Tween-20、 0.8M Betaine, 1.4M dNTPs, LAMP所用的大豆疫霉特异性引物0.2μM F3, 0.2μM B3, 1.6μM FIP, 1.6μM BIP, 0.8μM LF, 0.8μM LB, 150μM Hydroxynapthol Blue, 8U Bst DNA polymerase, 使用超纯水配制成1mL检测溶液，保存期为1年。

所述的检测方法包括以下步骤：提取待检测物DNA，取1μL溶液作为反应模板，取试剂盒中的溶液24μL加入200μL反应小管中，模板混匀后放入65℃恒温水浴中，30-60min内观察小管中溶液颜色的变化，如果颜色由浅紫色变为天蓝色，则说明待检物中含有大豆疫霉，如果溶液颜色没有变化，说明待检物中不含有大豆疫霉。

本发明的优点是：

与传统的大豆疫霉检测技术相比，本发明具有更高的准确性、灵敏度和时效性。以形态特征为基础的传统检测方法耗时长、需要检测的样品量大，而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的实践操作经验，因而经常导致漏检，检测准确率普遍较低。本发明通过实验验证，在不同的疫霉种之间，大豆疫霉的检出率为100%，准确性及特异性高；本发明最低可以检测出10pg DNA含量的样品，灵敏度高；本发明的耗时只要30—60min，加上样品的富集及DNA的提取，最快只需要半个工作日，时效性高。

与现在普遍使用的普通PCR分子检测技术相比较，本发明对实验场所的要求简单、实验操作方便、结果观察简便直观。普通PCR分子检测技术需要不同的温度变化循环，需要较为专业的PCR操作仪器，实验结果需要凝胶电泳染色后在凝胶成像仪中进行观察，因此整个实验需要专业、昂贵的实验操作仪器，而且操作较为繁琐。本发明在65℃恒温条件下对目标片段进行扩增，实验结果通过直接观察反应体系颜色的变化即可进行判断。因此本发明非常适合在基层及进出口检验检疫部门推广使用。

附图说明

图1为LAMP大豆疫霉引物的特异性验证：

大豆疫霉LAMP特异性引物对16个疫霉种、15个其它种的菌株共计86株菌株进行65℃水浴恒温扩增，60min后观察反应溶液颜色的变化，只有以大豆疫霉基因组为模板的小管中反应溶液的颜色由紫色变为天蓝色（图1A，1-4）、15个其它疫霉种（图1A，5-19）和真菌菌株（图1A，20-22）颜色均没有发生变化，仍然为紫色。进一步电泳、溴化乙淀染色后凝胶成像系统观察可以发现，大豆疫霉为模板可以扩增出一系列梯度条带（图1B,1-4），而其它疫霉种和真菌菌株没有扩增条带（图1B, 5-22）。

图2为LAMP大豆疫霉特异性引物的灵敏度验证：

LAMP大豆疫霉特异性引物的灵敏度验证，所用大豆疫霉的模板浓度为1ug-10fg，最低浓度为10pg时，反应小管中的溶液变为蓝色（图2.B），电泳检测结果进一步验证了结果（图2.A）

图3为大豆感病植株的检测：

1为阳性对照，以大豆疫霉的DNA为模板，2为大豆疫霉侵染后分离发病植株的茎部，用NaOH法提取基因组作模板，3为用NaOH法提取发病植株的叶片基因组作模板，4为NaOH法提取健康植株的DNA作模板，5为阴性对照，用水作模板。

图4为土壤中残留大豆疫霉卵孢子的检测：

1为阳性对照，以大豆疫霉的DNA为模板，2为大豆疫霉发病严重田块的土壤中分离到的卵孢子，提取基因组后用作模板，3为没有发生过大豆疫病的田块的土壤用作对照，4为阴性对照，用水作模板。

图5为大豆疫霉污染水源中游动孢子的检测

1为阳性对照，以大豆疫霉的DNA为模板，2为大豆疫霉发病严重田块的采集到的水样用作提取基因组后作为模板，3为没有发生过大豆疫病的田块的水样用作对照，4为阴性对照，用水作模板。

具体实施方式

实施例1

大豆感病植株的检测结果：

1)发病植株DNA的提取：将有水浸状病斑的大豆叶片或根茎部位用70%酒精消毒后，用液氮研磨后取少量粉末，采用CTAB法提取基因组（方法见上）。也可使用碱裂解法快速提取DNA，方法如下，取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10 μl 0.5 M NaOH，充分研磨后转移至1.5 ml的EP管中，12000 rpm离心5 min，取1 μl直接用于LAMP反应。

2）LAMP扩增验证：取1μLDNA溶液作为反应模板，取试剂盒中的溶液24μL加入200μL反应小管中，通模板混匀后放入65℃恒温水浴中，30-60min内观察小管中溶液颜色的变化，如果为大豆疫霉侵染引起的疫病，则小管中反应溶液的颜色由紫色变为天蓝色，没有被大豆疫霉侵染的植株和阴性对照组溶液颜色没有变化（图3）。

土壤中残留大豆疫霉卵孢子的检测结果：

1）土壤中卵孢子的富集：取待检土壤样品20-100克，研碎，先后采用200目筛网去除较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3-10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。

2）卵孢子DNA的提取：将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5 mL的离心管中，在12000 r.min^-1转速下离心5min，吸出上清液，留15μL液体吸打混匀后吸入研钵中，液氮研磨后取粉末于小管中，CTAB法提取基因组，方法如下，加900 μL 2% CTAB提取液和90 μl 10% SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1 h，中间每10 min上下颠倒几次，12000 rpm离心10 min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，12000 rpm离心10 min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心5 min。上清转移至新管中，加等体积甲醇沉淀，12000 rpm离心10 min，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次，室温晾干。加适量灭菌超纯水（含20 μg/ml RNase），37℃处理1 h后，用于后备实验。

3）LAMP扩增验证：取1μL DNA溶液作为反应模板，取试剂盒中的溶液24μL加入200μL反应小管中，通模板混匀后放入65摄氏度恒温水浴中，30-60min内观察小管中溶液颜色的变化，如果颜色由浅紫色变为天蓝色，则说明待检物中含有大豆疫霉，如果溶液颜色没有变化，说明待检物中不含有大豆疫霉（图4）。

大豆疫霉污染水源中游动孢子的检测结果：

1)游动孢子的富集及DNA提取：大豆疫霉在有水膜的环境下能够形成孢子囊并释放大量游动孢子，是再侵染的重要途径。取大豆疫霉污染水源500mL，在5000g的离心力下离心20min，倒去上清液，沉淀的游动孢子用100μL水悬浮，转入1.5mL离心管，加入0.05g石英砂，涡旋震荡10秒后， 2000r.min^-1离心5min后取上清用于LAMP扩增。

2）LAMP扩增验证：取1μL DNA溶液作为反应模板，取试剂盒中的溶液24μL加入200μL反应小管中，通模板混匀后放入65℃恒温水浴中，30-60min内观察小管中溶液颜色的变化，如果含有大豆疫霉的游动孢子，则小管中反应溶液的颜色由紫色变为天蓝色，没有被大豆疫霉污染的河水颜色没有变化（图5）。

Claims

1.一种用于检测大豆疫霉的LAMP引物、试剂盒，其特征在于所述的LAMP引物有3对，分别是：