CN102230015B - 检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒，属于植物检验检疫领域。检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。本发明的优点是：通过本发明建立的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒能够特异、灵敏、快速地检出洋葱腐烂病菌。
Description
技术领域
本发明涉及检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒，属于植物检验检疫领域。
背景技术
洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv. alliicola）隶属于原核生物界(Procaryoces)、薄壁菌门(Gracilicutes)、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）。唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）是一种引起唐菖蒲球茎腐烂的病原菌，Severini在1913年的文献中最早描述了这种病原菌，并将其命名为Pseudomonas gladioli。1992年，Pseudomonas gladioli与其它六个同属于假单胞菌属（Pseudomonas） rRNA Group Ⅱ的菌种一起被划分到了一个新属——伯克霍尔德菌属（Burkholderia），从而被命名为Burkholderia gladioli。
洋葱腐烂病菌最初只是被当成一种植物病原菌。寄主植物主要是葱属植物（Allium cepa）和郁金香属（Tulipa spp.）。主要致病症状是鳞茎的内部鳞片腐烂，初期外观看不到症状，但后期整个鳞茎变软，可看到大量细菌分泌物。在叶片上也可产生干燥的坏死斑。洋葱腐烂病菌侵染洋葱叶片后，一到两片叶片会枯萎变白，并且脱落，病原菌由叶片再侵染至球茎。受侵染的洋葱鳞球茎，先期外部无明显特征，只在鳞球茎颈部出现腐烂，剖开后，发现内部一到两个小鳞茎已呈水浸状。后期肉质鳞状组织出现水浸状，由白黄色变为浅褐色，逐渐腐烂变软，在病害发病后期会有粘性、腐烂难闻液体流出，直至整个球茎变干、枯萎。田间发病率可达到 89.1 %。传播途径包括带菌种子、鳞球茎，土壤等。
1985年，Christenson首次报道了Burkholderia gladioli 感染囊性纤维化（CF，Cistic Fibrosis）病人呼吸道的病例。接着，陆续在慢性肉芽肿和免疫功能减弱的病人体内发现了Burkholderia gladioli。Burkholderia gladioli感染的病症还包括败血病、脓肿、骨髓炎、角膜炎和淋巴腺炎。Burkholderia gladioli可能主要导致CF病人的急性感染以及肺移植术后的血液感染，目前还没有Burkholderia gladioli在病人与病人之间传播的报道。
洋葱腐烂病菌是引起洋葱腐烂的高风险检疫性病菌，其准确检测和鉴定在检验检疫工作中具有重要意义。鉴于我国目前没有洋葱腐烂病的发生危害报道，为了减少境外洋葱腐烂病菌传入的风险、保护公众健康，本发明研究开发出一种特异的洋葱腐烂病菌检测技术。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列。
本发明要解决的另一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸序列。
检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，为序列表SEQ ID No.3的寡核苷酸序列。
所述探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。
本发明根据 NCBI 数据库中 Burkholderia gladioli pv. alliicola ITS 基因序列保守区，设计并经大量筛选得到最佳引物和探针。探针5′端标记报告荧光染料6-Carboxy fluorescein (FAM)，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1。引物和探针由宝生物工程有限公司合成。上游引物PBAF：5′- GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC -3′（SEQ ID No.1）；下游引物PBAR：5′- ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC -3′（SEQ ID No.2）；探针为：FAM-ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1 （SEQ ID No.3）。
检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物和检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针；所述检测引物为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸序列，所述探针为序列表SEQ ID No.3的寡核苷酸序列，探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。
一种检测洋葱腐烂病菌的试剂盒，由以下组分组成：
（1）PCR反应液：由2×反应液Premix EX Taq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；反应液Premix EX Taq的终浓度为1×，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为 0.3uM，探针的终浓度为0.1uM；
2×反应液Premix EX Taq购于Takara公司；引物和探针均委托Takara公司合成，其中，引物PBAF（引物1）为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR（引物2）为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针5′端标记报告荧光染料6-Carboxy fluorescein (FAM)，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1；
（2）无DNA酶的灭菌纯化水：用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS 纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。Millipore –Q纯化水151bf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟；
（3）阴性对照：1mL×1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121℃灭活30min；
（4）阳性对照：1mL×1管；为含有洋葱腐烂病菌Bga核糖体基因保守区序列（SEQ ID NO.4）的重组质粒，Ct值为22.0～28.0。
阳性对照的制备方法为：用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物序列对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138 bp 核糖体基因保守区序列（SEQ ID No.4），与pGEM-T easy载体（购自Promega公司）进行连接，转化E.coli Competent Cells DH5α感受态细胞（购自Promega公司），使用Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0（购自TaKaRa公司）质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga。10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.0～28.0均可作为阳性对照。
核糖体基因保守区序列如下（SEQ ID No.4）：
ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGACTCGAGTCTTTGTCATTGGCGATTGAGCCAGTCAGAGTGATGAGTACACAAGTGTGCTTATCGGCTGTCGTTCTTTAACAATCTAGAAGAAGTAGTAATTTGGATAGCGGAAGC 。
本试剂盒还可以含有细菌基因组DNA提取试剂，其目的是从培养的待测细菌中提取得到基因组DNA，属于本领域常规操作。多种商业来源的细菌基因组DNA提取试剂盒均可满足要求。例如：本发明还可以包括（5）细菌基因组DNA提取试剂盒：购自TIANGEN公司，货号DP302-02。
本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法能在摇培12 h后，从模拟的最低含菌量的洋葱种子中检出洋葱腐烂病菌。研究表明，在3000粒洋葱种子表面，最低带菌量118个、制样时完全被从种子表面洗脱下来的情况下，通过本发明建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速有效地检出洋葱腐烂病菌。
本发明的优点是：本发明建立了特异、灵敏、快速的 TaqMan 探针荧光定量 PCR 方法和试剂盒用于检测洋葱腐烂病菌。利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计引物和 TaqMan 探针并进行筛选，优化 PCR 反应条件和体系，对 Burkholderia gladioli pv.alliicola 菌、对照菌进行检测，验证该方法和试剂盒的特异性、敏感度、重复性等。该方法利用高特异性引物对目的基因进行扩增，实现了快速、高特异性和高灵敏度的结合，检测灵敏度达 1 个拷贝/ 反应，反应时间仅需 1 h左右。实验结果表明该方法和试剂盒适合于口岸对洋葱腐烂病菌的快速检测。
以下通过实施例和说明书附图详细说明本发明技术方案，并不以此限定本发明的实施范围。
附图说明
图1为实施例1的荧光定量PCR标准曲线。
图2为实施例1的 Burkholderia gladioli pv.alliicola菌TaqMan 探针荧光定量 PCR特异性检测结果。
图3为实施例1Burkholderia gladioli pv.alliicola菌TaqMan 探针荧光定量 PCR灵敏度检测结果。
图4为实施例3各个梯度不同时间点荧光定量PCR检测结果。
图5为实施例3各个梯度不同时间点荧光定量PCR检测结果。
具体实施方式
实施例1：洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测
一．材料与方法
1．材料试剂
Burkholderia gladioli pv.alliicola ATCC20157、ATCC20159、ATCC20160、ATCC20161由美国Campbell Vegetable Research & Development Center的Hasan Bolkan博士提供。Burkholderia andropogonis ATCC 23060，Burkholderia caryohpy ATCC 11441，Burkholderia glumae ATCC 33617购自中国菌种保藏中心。Burk. Cepacia Y3，Burk. Multivorans PW99，Burk. cenocepacia Y10，Burk. cenocepacia 317，Burk. stabilis J100， Burk. vietnamiensis 419， Burk. anthina YP46，Burk. pyrrocinia 301，Burk. arboris HT1，Burk. seminalis R45，Burk. contaminans Y4 DNA由浙江大学谢关林教授提供。细菌培养使用NA培养基、反应液Premix EX Taq等试剂均购自Takara公司；PCR所用探针引物合成自Takara公司。
2．仪器
SLAN荧光定量PCR仪，超低温冰箱(Thermo)，超净台(苏净集团)，培养箱(Memmert)。
3．特异性探针及引物设计
根据 NCBI 数据库中 Burkholderia gladioli pv. alliicola 核糖体基因序列保守区，设计引物和探针。探针5′端标记报告荧光染料6-Carboxy fluorescein (FAM)，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1。引物和探针由宝生物工程有限公司合成。
上游引物PBAF：5′- GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC -3′；
下游引物PBAR：5′- ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC -3′；
探针为：FAM-ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1 。
4．标准曲线
将摇培的菌悬液进行10倍倍比稀释作为标准品，采用3M PetrifilmTM菌落总数测数片对菌悬液进行计数，分别取1 μL做模板，在最佳反应条件下进行定量扩增，利用荧光定量PCR仪配套软件绘制以初始模板浓度的对数为X轴，Ct值为Y轴的标准曲线。
5．荧光定量PCR特异性检测
荧光定量PCR 扩增体系和反应条件：总反应体系为 20 μL，包括 Premix EX Taq 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，探针 0.3 μL，模板菌液1 μL（模板DNA采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取），用 ddH2O 补足至20 μL。
反应条件为 95 ℃ 5 mins，1个循环；95 ℃ 5 s；60 ℃ 20 s，40个循环。选取细菌菌液为模板进行Burkholderia gladioli pv.alliicola菌特异性检测，阴性对照选取伯克氏菌属的菌株作为参比菌株。
6．荧光定量PCR灵敏度检测
用灭菌水按十倍梯度稀释Burkholderia gladioli pv.alliicola菌液进行相对灵敏度检测，取1 μL 菌液进行PCR检测，并同时取相同量菌液涂布平板，30 ℃培养36 h后进行单菌落计数，以确定每稀释倍所含菌量。
二．结果与分析
1．标准曲线
5个梯度的菌悬液，在最佳反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增,利用荧光PCR仪配套软件生成扩增反应标准曲线和直线回归方程。标准曲线方程为y = -3.416 x+44.287, r=-0. 9999。标准曲线表明,菌悬浓度在1.02×107cfu/mL～1.02×103cfu/mL 范围内与Ct值之间呈良好的线性关系, 荧光定量PCR的扩增效率为96.3 %，也就是说，每个循环的重点，扩增子的拷贝数增加1.96倍，或96.3 %的模板被扩增。标准曲线见图 1。
2．供试的4株洋葱腐烂病菌（ATCC 20157、ATCC 20159 、ATCC 20159、ATCC 20159）、14种洋葱腐烂病菌近似种（Burkholderia andropogonis ATCC 23060，Burkholderia caryohpy ATCC 11441，Burkholderia glumae ATCC 33617，Burk. Cepacia Y3，Burk. Multivorans PW99，Burk. cenocepacia Y10，Burk. cenocepacia 317，Burk. stabilis J100， Burk. vietnamiensis 419， Burk. anthina YP46，Burk. pyrrocinia 301，Burk. arboris HT1，Burk. seminalis R45，Burk. contaminans Y4）在相同条件下进行 TaqMan 探针荧光定量 PCR 检测。该方法中4株洋葱腐烂病菌均有明显的扩增曲线生成,说明本试验 TaqMan 探针及引物具有高特异性(图2)。
3．灵敏度检测结果
供试的洋葱腐烂病菌梯度菌液在同一反应中，通过细菌总数测数片测得梯度浓度依次为：1.02×107、1.02×106、1.02×105、1.02×104、1.02×103、1.02×102 cfu/mL以及空白对照。本试验的检测下限为1.02×103 cfu/mL，体现了该方法的高灵敏度，如图3所示。
实施例2：检测洋葱腐烂病菌的试剂盒
一种检测洋葱腐烂病菌Burkholderia gladioli pv. alliicola的试剂盒，由以下组分组成：
（1）PCR反应液：由2×反应液Premix EX Taq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；反应液Premix EX Taq的终浓度为1×，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为 0.3uM，探针的终浓度为0.1uM；
2×反应液Premix EX Taq购于Takara公司；引物和探针均委托Takara公司合成，其中，引物PBAF（引物1）为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR（引物2）为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针5′端标记报告荧光染料6-Carboxy fluorescein (FAM)，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1。
（2）无DNA酶的灭菌纯化水：用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS 纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。Millipore –Q纯化水151bf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。
（3）阴性对照：1mL×1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121℃灭活30min。
（4）阳性对照：1mL×1管；为含有洋葱腐烂病菌Bga核糖体基因保守区序列（SEQ ID NO.4）的重组质粒，Ct值为22.0～28.0。
阳性对照的制备方法为：用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物序列对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138 bp 核糖体基因保守区序列（SEQ ID No.4），与pGEM-T easy载体（购自Promega公司）进行连接，转化E.coli Competent Cells DH5α感受态细胞（购自Promega公司），使用Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0（购自TaKaRa公司）质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga。10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.0～28.0均可作为阳性对照。
（5）细菌基因组DNA提取试剂盒：购自TIANGEN公司（天根生化科技（北京）有限公司），货号DP302-02。
操作流程详细说明如下：
1．切去洋葱鳞球茎的部分腐烂组织或者病健交界处组织，放入灭菌的研钵中，加入适量的0.8 %的生理盐水，充分研磨，用移液器吸取研磨液转入1 mL EP管中，1500 rpm～3000 rpm低速离心去除大的颗粒，将上清液转入另一干净的1 mL EP管中，13000 rpm高速离心，弃上清液，加入100μL灭菌水重悬沉淀，进行划线涂板培养；
从平板培养基上挑取疑似单菌落接种至1～4 mL的液体培养基中过夜培养。
2．取1～4 mL的过夜培养菌液，10,000 rpm离心2分钟，弃上清。
3．按照细菌基因组DNA提取试剂盒（购自TIANGEN公司）说明书操作提取、纯化得到菌液模板DNA。
4．荧光定量PCR 扩增体系和反应条件：
总反应体系为20 μL，包括1×反应液Premix EX Taq 10 μL, 上游引物 0.5 μL（0.3uM），下游引物 0.5 μL（0.3uM），探针 0.3 μL（0.1uM），菌液模板DNA 1 μL（步骤3试剂盒提取得到），用无DNA酶的灭菌纯化水补足至20 μL。
按上述的PCR反应体系配制反应体系，放入荧光定量PCR仪中进行反应，程序设置为：95 ℃ 5 mins，1个循环；95 ℃ 5 s；60℃ 20 s，40个循环。
对待检样品进行检测时，每次试验应设阴性对照和阳性对照，反应体系中菌液模板DNA分别用阴性对照和阳性对照替代。阴性对照用于判定反应体系及整个操作过程是否受污染，阳性对照用于判定整个反应过程的有效性。
5．结果判定：反应结束后，根据Ct值判断反应结果，Ct值在36个循环以内判定为阳性，Ct值超过36个循环判定为阴性。其中，阴性对照Ct值应为无或至少大于36个循环，阳性对照Ct值应处于22～28个循环范围内，阴性对照或阳性对照任何一个不满足要求，则整个检测过程判定为无效。
实施例3：检测洋葱腐烂病菌的试剂盒
（1）PCR反应液：由2×反应液Premix EX Taq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；反应液Premix EX Taq的终浓度为1×，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为 0.3uM，探针的终浓度为0.1uM；
2×反应液Premix EX Taq购于Takara公司；引物和探针均委托Takara公司合成，其中，引物PBAF（引物1）为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR（引物2）为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针5′端标记报告荧光染料6-Carboxy fluorescein (FAM)，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1。
（2）无DNA酶的灭菌纯化水：用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS 纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。Millipore –Q纯化水151bf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。
（3）阴性对照：1mL×1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121℃灭活30min。
（4）阳性对照：1mL×1管；为含有洋葱腐烂病菌Bga核糖体基因保守区序列（SEQ ID NO.4）的重组质粒，Ct值为22.0～28.0。
阳性对照的制备方法同实施例2。
本试剂盒的使用方法同实施例2，其中待测的细菌基因组DNA可采用本领域公知技术或通过任何市售的基因组提取试剂盒获得。
实施例4：用实施例2的试剂盒模拟带菌种子制样液的制备及荧光定量PCR检测一．材料与方法
1．材料试剂
Burkholderia gladioli pv.alliicola ATCC20157，进口洋葱种子（以色列），实施例2的试剂盒（北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供）。
2．仪器设备
SLAN荧光定量PCR仪，超净台(苏净)，培养箱(Memmert)。
3．菌悬液制备
培养30 mL Burkholderia gladioli pv.alliicola菌悬液，将摇培的菌悬液进行10倍梯度倍比稀释，采用3M PetrifilmTM菌落总数测数片对菌悬液进行计数，每个梯度取100 μL，做三个重复，将测试片置于28 ℃温箱中培养72 h，取出计算测试片所有红色菌落的数目（不论大小和颜色深浅），同一梯度三个重复的平均值乘以稀释度作为菌悬液的浓度。
4．模拟带菌种子制样液的制备及荧光定量PCR检测
（1）将摇培的菌悬液进行10倍梯度稀释至100 cfu/mL，每个梯度100 mL，在每个梯度菌悬液中加入3000 粒不含包衣的洋葱种子，然后放在28 ℃培养箱中摇培，每个梯度取1 mL摇培液加入1.5 mL EP管中低速离心，去除大的杂质颗粒，然后高速离心沉淀，去掉上层液体，用100 μL无菌水重悬沉淀，制成菌悬液，每个梯度菌悬液各取1 μL作为模板，按照实施例2试剂盒使用方法进行荧光定量PCR检测。
（2）将含洋葱种子的各个梯度的菌悬液分别摇培6 h、12 h、24 h，分别取不同时间点的摇培液进行荧光定量PCR，同时取不同时间点的摇培液各1 mL进行，加入1.5 mL EP管中低速离心，去除大的杂质颗粒，然后13000 rpm高速离心沉淀，去掉上层液体，用100 μL无菌水重悬沉淀，制成菌悬液，每个梯度菌悬液各取1 μL作为模板，进行荧光定量PCR检测，以比较不同摇培时间的差别。
二．结果
（1）不同时间点摇培液检测结果
取0h、6h、12h、24h不同时间点的摇培液1 μL，按实施例2操作方法进行荧光定量PCR检测结果，各个梯度各个时间点的荧光定量PCR检测结果见图4，各个梯度各个时间点的荧光定量PCR检测Ct值见表1。从检测结果的Ct值可以看出，同一梯度不同时间点的荧光定量PCR检测Ct值基本以3个Ct左右增加，在荧光扩增效率100 %的情况下，模板浓度相差十倍，则Ct值相差约3.32，建立的荧光定量PCR体系扩增效率为96.3 %，也就是说大致可以判断在不同时间点菌体浓度是以十倍的比例增加。加入的摇培液为100 mL，菌悬液计数结果显示摇培菌悬液浓度为1.18×108CFU/mL，也就是说梯度稀释摇培液最低含菌量为118个，从荧光定量PCR检测结果可以看出，建立的荧光定量PCR体系，能在摇培24 h后从含菌量为118个的模拟带菌种子样品中检出Burkholderia gladioli pv.alliicola。
（2）不同时间点摇培制样液检测结果
取6h、12h、24h不同时间点的摇培液1 mL进行制样，各个梯度各个时间点各取1 μL进行荧光定量PCR检测，检测结果见图5。各个梯度各个时间点的荧光定量PCR检测Ct值见表2。从检测结果可以看出，样品经过浓缩以后，本研究建立的荧光定量PCR体系能在摇培24 h后从最低梯度的模拟带菌种子样品中检出Burkholderia gladioli pv.alliicola，并没有因为样品富集可能导致的反应抑制物的富集而影响检测效果。
序列表
<110> 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcttccgcta tccaaattac tacttc 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgacaaatg ttcgagtcag ttgac 25
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
attgttaaag aacgacagcc gataagcaca c 31
<210> 4
<211> 138
<212> DNA
<213> 洋葱腐烂病菌 Burkholderia gladioli pv. alliicola
<400> 1
atgacaaatg ttcgagtcag ttgactcgag tctttgtcat tggcgattga gccagtcaga 60
gtgatgagta cacaagtgtg cttatcggct gtcgttcttt aacaatctag aagaagtagt 120
aatttggata gcggaagc 138
Claims (6)
1.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于：引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，所述探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。
2.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物和检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针；所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。
3.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于由以下组分组成：
（1）PCR反应液：由2×反应液Premix EX Taq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；其中，引物PBAF的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，引物PBAR的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的，探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，探针5′端标记报告荧光染料FAM，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1；
（2）无DNA酶的灭菌纯化水；
（3）阴性对照：1mL×1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121℃灭活30min；
（4）阳性对照：1mL×1管；为含有洋葱腐烂病菌Bga核糖体基因保守区序列SEQ ID NO.4的重组质粒，Ct值为22.0～28.0。
4.根据权利要求3所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述反应液Premix EX Taq的终浓度为1×，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为 0.3uM，探针的终浓度为0.1uM。
5.根据权利要求3所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照的制备方法为：用核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138 bp 核糖体基因保守区序列SEQ ID No.4，与pGEM-T easy载体进行连接，转化E.coli Competent Cells DH5α感受态细胞，使用Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga；10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.0～28.0者作为阳性对照。
6.根据权利要求3或4或5所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有（5）细菌基因组DNA提取试剂盒。
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