CN1312475C

CN1312475C - 镰刀菌毒素的分子检测方法及应用

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Publication number: CN1312475C
Application number: CNB2004100093002A
Authority: CN
Inventors: 廖玉才; 武爱波; 李和平; 赵纯森
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2004-07-02
Filing date: 2004-07-02
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2024-07-02
Also published as: CN1715915A

Abstract

本发明属于植物检验检疫技术领域，具体地说涉及一种镰刀菌毒素的分子检测技术领域。本发明的特征是，通过自行设计的一对引物，从中国和国外采集得到的镰刀菌中检测分离得到镰刀菌毒素DON和NIV基因片段，该片段全长分别为300bp和360bp。本发明仅仅采用一对特异性引物，进行一次PCR扩增反应，利用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，直接根据产物片断的长度，即可检测出禾谷镰刀菌产生毒素的类型deoxynivalenol(DON)或者nivalenol(NIV)，本发明可应用于谷物、饲料和食品安全中毒素DON和NIV污染的检测。

Description

镰刀菌毒素的分子检测方法及应用

技术领域

本发明属于植物检验检疫技术领域，具体地说涉及一种镰刀菌毒素的检验检疫方法，与分子检测技术有关。

背景技术

由镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是世界潮湿温带地区危害小麦的一种重要病害，导致严重减产，而且赤霉病产生的毒素能使人畜中毒，使小麦食用品质降低，威胁人和动物的健康。镰刀菌可产生多种单端孢霉烯族毒素(trichothecene)。这些毒素可抑制真核生物细胞蛋白质合成，破坏人和动物的免疫系统，中毒者常伴有呕吐、腹泻、头晕等症状，而赤霉病病麦中毒是我国最主要的真菌性食物中毒之一。在我国赤霉病发病区，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)是主要致病菌种，其有性阶段为玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)。禾谷镰刀菌产生B型trichotheeene毒素，主要包括毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)和雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，简称NIV)。由于DON和NIV严重威胁到人类和动物的安全，国内外育种界、病理学界、医学界以及各国政府检验检疫部门均对这两种毒素的检测监控研究十分重视。

目前镰刀菌毒素的检测方法主要是化学测定法，但其纯化程序比较费时和复杂，需要昂贵的仪器设备。免疫化学法如酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)也用于镰刀菌毒素测定，主要应用于粮食样品中真菌毒素的检测。目前仅仅有快速检测镰刀菌毒素DON的ELISA试剂盒，因为其检测出的毒素中常含有一些其它衍生物，所以测定的结果往往偏高，而且目前还没有检测毒素NIV的商业试剂盒问世。随着国际贸易中各国之间粮食进出口规模不断扩大，各国口岸加强了对小麦和玉米的出入境管理，检疫实践中急需一种快速、灵敏、准确地检测出进口粮食中是否存在毒素污染，以判断其是否合格，能否进关。

近年来随着镰刀菌分子生物学研究的快速发展，对毒素的合成、毒素基因表达调控方面已经取得了一些十分有意义的结果，特别是在trichodiene合成酶基因的研究上，已经揭示了毒素合成途径中涉及的许多基因及在毒素合成代谢途径中的作用。因此，许多研究者都希望能够有效的利用这些最新的分子生物学研究结果和相关基因序列信息，以找到一种简单、快速、低成本地鉴定出镰刀菌产生毒素类型和含量的方法。最近，几个国家的研究人员做了一些有益的尝试，Kim等通过Tri5、Tri13和Tri7基因序列信息，检测分析分别来自大麦、小麦和棉花的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)产生的毒素DON和NIV(Kim，H-S et al.Polymorphism of trichothecene biosynthesis genes in deoxynivalenol-andnivalenol-producing Fusarium graminearum isolates.Mycol.Res.，2003107，190-197)，其中Tri5检测法的操作过程涉及到Southern杂交技术，费用较高，很难在实际中大量应用，而且根据Tri5、Tri13和Tri7两种检测方法在三种作物大麦、小麦和棉花中出现了鉴定结果与化学分析检测结果不一致的情况，导致检测结果了出现一定的偏差；Bakan等通过PCR技术检测了的高产DON和低产DON毒素的6个法国黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)菌株的差异(Bakan et al.Identification by PCR of Fusarium culmorum strains producing largeand small amounts of deoxynivalenol.Appl.and Environ.Microbiol.，2002，68：5472-5479)，应用了多种不同的引物，而且仅仅涉及到一种毒素DON的检测，菌株为镰刀菌属黄色镰刀菌，非禾谷镰刀菌；Chandler等通过Tri7和Tri13检测了三种镰刀菌Fusariumgraminearum，Fusarium culmorum和Fusarium cereali产生毒素的情况(Chandler et al.Development of PCR assays to Tri7 and Tri13 trichothecene biosynthetic genes，andcharacterization of chemotypes of Fusarium graminearum，Fusarium culmorum andFusarium cerealis.Physiol.and Mol.Plant Pathol.，2003，62：355-367)，应用了10对引物进行检测，毒素DON和NIV的特异性片断长度不确定，而且较多的毒素检测结果相互之间不吻合。由于存在以上的一些缺限，导致这些方法距离在粮食和食品安全中毒素的检测实际应用相差较远。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺限和不足，研制出一种能够快速准确检测镰刀菌菌株本身产生的毒素和粮食、食品安全中镰刀菌毒素污染的分子鉴定方法，以达到准确、快速、低成本的同时检测出2种镰刀菌毒素DON和NIV的目的。

本发明是这样实现的：利用Genbank中已经公开发表的几个禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌的毒素调控基因Tri5-Tri6基因间隔区域序列信息( http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，设计一对

特异性引物，以扩增出菌株产毒素基因之间差异最大的片段。经过一次PCR扩增后，产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR产物带型可直接快速检测出禾谷镰刀菌本身产生毒素DON和NIV，同时可用于田间小麦籽粒和玉米籽粒中镰刀菌毒素DON和NIV的检测。具体步骤如下：

一种镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的特异片段，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：3所示，序列全长为300bp。

一种镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)毒素雪腐镰刀菌烯醇(NIV)的特异片段，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：4所示，序列全长为360bp。

用于扩增上述镰刀菌毒素DON、NIV的DNA特异片段的引物，它的DNA序列如序列表SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

一种镰刀菌毒素的分子检测方法，其步骤包括：

1)分离、纯化禾谷镰刀菌，鉴定后保存；

2)将步骤1)得到的菌株置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上25℃、黑暗条件下培养7天，收集的菌丝在液氮中研磨成粉末，用CTAB法抽提菌丝DNA；

3)取0.5g左右待检测的生物样品在液态氮中磨碎后，用CTAB法提取DNA，用50ul TE溶解，加2ul 10mg/ml RNA酶，37℃水浴30min后，用体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液纯化DNA，重复沉淀DNA一次，最后再用50ul TE溶解DNA，其中的待检测的生物样品是受镰刀菌毒素污染的籽粒、饲料或食品，或是受镰刀菌毒素病菌侵染的植物的植株和组织；

4)用序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对进行PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的特异片段；

5)用步骤2)和3)得到的DNA片段检测所述的禾谷镰刀菌菌株的产毒类型或/和被测生物材料是否存在所述的毒素DON和/或NIV；镰刀菌毒素DON和NIV的特异性带分别为300bp和360bp。

上述步骤4)所说的PCR具体步骤是：

1)扩增反应体系：在25ul PCR反应液中，含有50ng模板DNA，2.5ul PCR缓冲液，1.5ul 25mM MgCl₂，2ul 1.25mM dNTPs，0.5ul Primerl(10 pmol/ul)，0.5ul Primer2(10pmol/ul)，1 U Taq DNA聚合酶；

2)PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 55sec，30个循环；

及终

延伸72℃ 6min；

3)反应完成后，取15ul PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的大小判定结果。

很显然，应用上面的技术方案，本发明可应用于镰刀菌本身毒素的鉴定以及在粮食作物的籽粒、饲料或食品安全中的因潜在的镰刀菌毒素侵染或污染的生物材料或产品的快速检测。更详细的技术方案如下所述：

1.1菌株收集

从中国不同地区收集赤霉病病穗样品，经过组织分离和单孢纯化培养，经形态标准程序鉴定后，得到禾谷镰刀菌菌株(Fusarium graminearum Schwabe)，包括毒素类型为DON的中国菌株4020。还有来自欧美、尼泊尔的已知产生毒素DON和NIV的禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，上述菌株由英国约翰英纳斯研究所的Nicholson博士提供(文献见Carter等，Variation in Fusarium graminearum isolates from Nepal associated with their hostof origin.Plant Pathol，2000(49)：1-10)，如表1所示。

表1 本发明所采用的不同国家和地区的产毒素的禾谷镰刀菌菌株

菌株编号	来源国家	寄主	毒素类型
菌株编号	来源国家	寄主	毒素类型	IL42^aRL1^aLor9^aF700^bF701^b4020^b5005^b7105^b8029^bML4^aRK10^aWL1^a	美国尼泊尔意大利德国德国中国中国中国中国尼泊尔尼泊尔尼泊尔	小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦玉米水稻小麦	DONDONDONDONDONDONDONDONDONNIVNIVNIV

注：本表是利用特异性PCR检测已知产生毒素DON和NIV的禾谷镰刀菌菌株。^a表示由英国的Nicholson博士提供的已知产毒类型的菌株；^b表示本发明中中经HPLC法测定的毒素类型的菌株。

1.2毒素检测

将中国禾谷镰刀菌菌株(见表1，下标注b)接种于盛有50ml PDB液体培养基(商业培养基potato dextrose broth，购自英国DIFCO公司)的无菌塑料管中，振荡培养(20℃，150rpm)一周。离心(4℃，3000rpm)后，取5ml上清夜，加5ml己烷(商品分析纯)，涡漩15秒，静置至分层；用真空泵吸出上层有机相，下层样品加入到硅胶柱中，用1ml乙酸乙脂(商品分析纯)冲洗3次，溶液蒸干(通N₂，50℃)，至溶液剩余1ml左右时，再加1ml乙酸乙脂，涡漩30sec，溶液完全蒸干(通N₂，50℃)。毒素样品用0.5ml 15％甲醇(商品分析纯)溶解，经0.2m孔径滤膜(购自美国Waters公司)过滤后，在高效液相色谱仪(购自美国Waters公司，型号为2690)上进样分析。系统运行参数为：流动相为15％甲醇；流速0.40ml/min；波长224nm；进样量20ul；色谱柱为Chrompack/varian，Chromspher C18 2 GlassCartridges of 3mm ID×10cm；保护柱为Chromguard reversed phase 3.0mm×12.5mm。

1.3菌丝DNA抽提

将表1所示的菌株置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上25℃、黑暗条件下培养7天；用无菌的刮片刀收集菌丝，在液氮中研磨成粉末，用CTAB法抽提菌丝DNA(Nicholson et al.Differentiation and quantification of the cereal eyespot fungi Tapesia yallundae and Tapesiaacuformis using a PCR assay.Plant Pathol.，1997，46：842-856)。取100mg菌丝，在液态氮中研磨后，加入400ul DNA提取缓冲液(0.4 M NaCl，10mM Tris-HCl，pH8.9，2mM EDTA，pH8.0)，混匀后加入40ul 20％十二烷基硫酸钠(SDS)，8.6ul浓度为18.6mg/ul的蛋白酶K(购自美国Promega公司)，置于65℃ 1h，然后加入300ul 6M NaCl，涡漩30秒，离心(转速10000rpm，30min，4℃)。将上清液转入新管中，加入等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃ 1h，离心(转速10000rpm，20min，4℃)沉淀DNA，经70％酒精洗涤后，室温下干燥15min，DNA溶解在50ul TE(配比：10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0)中。

1.4分子孢子悬浮液的制备

将纯化、鉴定后的菌株接种在CMC液体培养基(配方：羧甲基纤维素7.5g，NH₄NO₃0.5g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄.7H₂O0.25g，酵母膏0.5g，加蒸馏水定容至1 L，121℃高压灭菌15min后使用，pH7.0)中振荡培养(25℃，150rpm)产生分生孢子后，用血球计数板计数，将孢子浓度调为5×10⁵个/毫升左右，将分别产生毒素DON和NIV的禾谷镰刀菌菌株4020和WL1(表1)的分生孢子悬浮液等量混合后用于接种。

1.5田间花期接种

在感病小麦品种“安农8455”扬花期，用不锈钢剪刀剪去中部小麦小穗的内外颍顶部少许，用微量注射器注入禾谷镰刀菌4020和WL1的分生孢子等量混合液20ul，接种100穗，套袋保湿，7天后去掉保湿袋，20天后采集样品，用于小麦籽粒毒素分析。

1.6籽粒样品收集及DNA抽提

田间采集接种病麦穗，60℃烘干后，手工脱粒；从河北、湖北等地采集田间自然感染赤霉病的玉米果穗，将小麦和玉米的籽粒按照感染病害级别分类(附图3、附图4)。取0.5g左右的籽粒在液态氮中磨碎后，装入2ml离心管中，加入70℃预热的1ml提取缓冲液(配比：100mM Tris-HCl pH7.5，500mM NaCl，50mM EDTA，3％SDS，1ul/mlβ巯基乙醇)，65℃水浴30min；12000rpm离心5min，取上清夜，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀；13000rpm离心5min；取上清夜至新的离心管，管内预加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 M NaAc溶液，冰上静置10min；130000rpm离心5min；用70％的酒精浸泡和清洗沉淀，自然干燥30min，提取的籽粒DNA用50ul TE溶解，加2ul 10mg/nml RNA酶(购自美国Sigma公司)，37℃水浴30min后，用苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25∶24∶1)的纯化DNA，重复沉淀DNA一次，最后再用50ul TE溶解DNA，用于PCR扩增。

1.7引物设计

本发明所用的几个产生毒素镰刀菌的毒素调控基因TRI5和TRI6之间的间隔区域序列信息已经公开发表(参见http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html，2个分别产生毒素DON和NIV的禾谷镰刀菌，GeneBank登录号为AF33636和AF336365；3个产生毒素DON的黄色镰刀菌GeneBank登录号为AF480836，AF480837，AY134892)。通过对这些序列进行多重比较分析后(Multiple Sequence Alignment)，设计一对特异性引物：P1(正向，5’-GCCGTGGGGRTAAAAGTCAAA-3’)和P2(反向，5'-TGACAAGTCCGGTCGCACTAGCA-3’)，以扩增出菌株产生毒素基因之间差异最大的片段(60bp)，从PCR产物长度直接判断出菌株是否产生毒素DON(序列长度为300bp)或者NIV(序列长度为360bp)，从而检测受镰刀菌菌株侵染的病小麦和玉米的籽粒中是否含有毒素DON和NIV。

1.8特异性PCR检测

在25ul PCR反应液中，含有50ng模板DNA，2.5ul PCR缓冲液，1.5ul 25mM MgCl₂，2ul1.25mM dNTPs，0.5ul Primerl(10pmol/ul)，0.5ul Primer2(10pmol/ul)，1U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 55sec，30个循环；最后72℃ 6min。反应完成后，取15ul PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像系统中紫外灯下照相(购自美国Bio-rad公司)，直接根据PCR产物片断的长短判断出禾谷镰刀菌菌株本身产生毒素和小麦、玉米籽粒中是否含有镰刀菌毒素DON和NIV。

1.9 PCR产物测序

采用四色荧光末端终止法，对产生毒素DON和NIV的菌株4020和WL1的PCR扩增产物进行序列测定，PCR产物经UItra Clean TM15 DNA纯化试剂盒(购自美国MOBIO公司)纯化后，使用ABI PRISM Big DyeTM Terminators v3.0 Cycle测序试剂盒(购自美国ABI公司)在ABI377型测序仪上(购自美国ABI公司)对PCR产物进行双向测序。

本发明的有益的效果

利用已发现的毒素生物合成调控路径基因信息，仅仅设计一对特异引物，只经过一次PCR扩增，即可简单快速可靠的鉴定出禾谷镰刀菌产生毒素的类型DON或者NIV。从附图5可以看出，12个已知不同产毒类型不同禾谷镰刀菌菌丝DNA扩增的PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上可以清楚完全的分开，呈2种不同带型，分别为毒素DON(序列长度为300bp)和NIV(序列长度360bp)的特异性带，所有禾谷镰刀菌产生毒素经PCR扩增鉴定的结果与化学分析法检测菌株本身的产毒类型均完全吻合(表2)。含有2种不同产毒类型的禾谷镰刀菌4020和WL1的菌丝DNA模板经在相同扩增条件下的同一个反应中能够同时扩增出DON和NIV的特异性带，相互之间没有干扰(附图5)。采集的小麦和玉米籽粒样品按附图3和附图4可分为不同等级：健康、轻微感病、中度感病、严重感病。健康的籽粒因为没有外来菌株的侵染，也就没有相关毒素的累积和污染，故与阴性空白对照一样，没有出现任何一种毒素的特异性带；而在轻微、中度和严重感病的籽粒中同时检测到了2种毒素的存在，而且相互之间也没有干扰(附图6)。这些都充分说明了本发明具有特异性高、准确度高和灵敏度高的特点。PCR产物的序列比较分析，表明产生毒素DON和NIV的禾谷镰刀菌菌株清楚的聚为2类(附图2)。序列在NCBI database中进行BLAST分析后( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，发现所有序列均存在于trichothecenes基因家族中，从而从分子水平上验证了本发明的特异性和准确性。所以本发明在毒素的基因和分子生物学检测研究水平上是一个较大的进步，为直接利用这些基因信息奠定了一定的基础。据此，可以简单快速地检测出粮食、饲料和食品安全中毒素DON和NIV的污染状况。

表2 特异性PCR检测已知产生毒素的禾谷镰刀菌菌株

菌株编号	来源国家	寄主	毒素类型	特异性PCR检测毒素类型
				特异性PCR检测毒素类型		PCR产物长度(bp)	毒素类型
				IL42RL1Lor9F700F7014020500571058029ML4RK10WL1	美国尼泊尔意大利德国德国中国中国中国中国尼泊尔尼泊尔尼泊尔	PCR产物长度(bp)	毒素类型	小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦小麦玉米水稻小麦	DONDONDONDONDONDONDONDONDONNIVNIVNIV	360360360360360360360360360300300300	DONDONDONDONDONDONDONDONDONNIVNIVNIV

附图说明

图1，是本发明的技术流程图。

图2，是中国禾谷镰刀菌4020、尼泊尔禾谷镰刀菌WL1和韩国的2个禾谷镰刀菌菌株的TRI5-TRI6基因间隔序列比较分析。WL1为产生毒素NIV的中国禾谷镰刀菌菌株；4020为产生毒素DON的中国禾谷镰刀菌菌株，AF336366和AF336365为韩国禾谷镰刀菌菌株，分别产生毒素DON和NIV。其中“-”表示相同的序列；“*”表示缺失的序列，下划线部分为引物扩增的序列。

图3，是本发明中应用特异性PCR法扩增的禾谷镰刀菌DNA产生毒素DON和NIV片断。泳道M为100bp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照；其他泳道样品菌丝DNA来源编号见表1。

图4，是用于特异性PCR进行毒素DON和NIV检测分析的四个病害感染级别小麦籽粒。图中标注A表示健康的籽粒；B表示轻微感病的籽粒；C表示中度感病的籽粒；D表示严重感病的籽粒。

图5，是用于特异性PCR进行毒素DON和NIV检测分析的四个病害感染级别玉米籽粒。图中标注A表示健康的籽粒；B表示轻微感病的籽粒；C表示中度感病的籽粒；D表示严重感病的籽粒。

图6，是应用特异性PCR法检测小麦和玉米感染赤霉病籽粒中的毒素DON和NIV的片断。泳道M为100bp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照；其他泳道分别为附图3和附图4中健康、轻微感病、中度感病、严重感病的小麦和玉米籽粒样品DNA扩增的片断。

具体实施方式

实施例1

中国禾谷镰刀菌菌株4020产生毒素的检测鉴定

将从中国河南省洛阳市收集到的小麦赤霉病穗样品作组织分离：将病穗的内外颖和籽粒分别用1‰升汞溶液浸泡处理1min，用无菌水反复冲洗3次，置于PDA平板上25℃条件下培养3-5天。将在PDA上产生的菌丝接种于CMC液体培养基中，光照条件下置于摇床上振荡培养(25℃、150rpm)5-7天，产生分生孢子后，用平板稀释法在琼脂培养基中进行单孢分离，然后将单孢转植在PDA斜面上培养得到单孢菌株，按Booth[Booth，C..The Genus Fusarium.Commonwealth Mycological Institute，Kew.1971]和Nelson[Nelson，P.E，et al.Fusarium Species-An Illustrated manual for identification.Penn.State Uni.Press，Uni.Park.1984]提出的标准形态鉴定程序鉴定后保存。分离的禾谷镰刀菌的大型分生孢子呈镰刀形，有隔膜2-7个，多数3-5个隔膜，顶端钝圆，基部足细胞明显，单个孢子无色，聚集在一起成粉红色粘稠状，小型孢子很少产生。经有性阶段产生的子囊呈棍棒状，内含8个子囊孢子。子囊孢子无色，纺锤形，两端钝圆，多为三个隔膜。供试的禾谷镰刀菌菌株均能在人工诱导条件下产生子囊孢子。

将菌株4020置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上25℃、黑暗条件下培养7天；用无菌的刮片刀收集菌丝，在液氮中研磨成粉末，用CTAB法抽提菌丝DNA。取100mg菌丝，在液态氮中研磨后，加入400ul DNA提取缓冲液(配比：0.4M NaCl，10mM Tris-HCl，pH8.9，2mM EDTA，pH8.0)，混匀后加入40ul 20％SDS，8.6ul蛋白酶K(18.6mg/ul)，置于65℃1h，然后加入300ul 6M NaCl，涡漩30秒，离心(10000rpm，30min，4℃)。将上清液转入新管中，加入等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃ 1h，离心(10000rpm，20min，4℃)沉淀DNA，经70％酒精洗涤后，室温下干燥15min，DNA溶解在50ul TE(配比：10mMTris-HCL pH8.0，1mM EDTA pH8.0)中。采用一对特异性引物P1(正向，5'-GCCGTGGGGRTAAAAGTCAAA-3’)和P2(反向，5'-TGACAAGTCCGGTCGCACTAGCA-3’)进行PCR扩增(Biometra，T1，Germany)。在25ulPCR反应液中，含有50ng模板DNA，2.5ul PCR缓冲液，1.5ul 25mM MgCl₂，2ul 1.25mMdNTPs，0.5ul Primerl(10pmol/ul)，0.5ul Primer2(10pmol/ul)，1U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 55sec，30个循环；最后72℃ 6min。反应完成后，取15ul PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像系统中紫外灯下照相(购自美国Bio-rad公司)，直接根据PCR产物片断的长短判断出菌株产生毒素类型DON和NIV(如序列表SEQ ID NO：3和序列表SEQ ID NO：4所示)。产生毒素DON和NIV的特异性带分别为300bp和360bp，根据PCR产物的带型判断出禾谷镰刀菌4020产生毒素DON，发明效果如附图5所示。

实施例2

尼泊尔禾谷镰刀菌菌株WL1产生毒素的检测鉴定

禾谷镰刀菌菌株WL1(来源于尼泊尔)由英国约翰英纳斯研究所的Nicholson博士提供(表1)，菌株菌丝DNA抽提、特异性PCR反应体系和扩增条件均同实施例1中的中国禾谷镰刀菌4020的毒素DON和NIV的检测分析步骤，获得毒素NIV的特异片段，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：4所示，序列全长为360bp，其发明效果如附图5所示。

实施例3

小麦赤霉病麦粒中镰刀菌毒素的检测

取0.5g左右的小麦籽粒(来源于中国湖北省)在液态氮中磨碎后，装入2ml离心管中，加入70℃预热的1ml提取缓冲液(配比：100mM Tris-HCl pH7.5，500mM NaCl，50mMEDTA，3％SDS，1ul/mlβ-巯基乙醇)，65℃水浴30min；12000rpm离心5min，取上清夜，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀；13000rpm离心5min；取上清夜至新的离心管，管内预加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc溶液，冰上静置10min；130000rpm离心5min；用70％的酒精浸泡和清洗沉淀，自然干燥30min，提取的籽粒DNA用50ul TE溶解，加2ul 10mg/ml RNA酶(Sigma公司，USA)，37℃水浴30min后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)纯化DNA，重复沉淀DNA一次，最后再用50ul TE溶解DNA，用于PCR扩增。PCR扩增的反应体系和条件见实施例1，产生毒素DON和NIV的特异性带也分别为300bp和360bp(附图6)，可直接根据PCR产物的带型判断出籽粒样品中是否存在毒素DON和NIV，其发明效果如附图6所示。

实施例4

田间自然感染赤霉病玉米籽粒中镰刀菌毒素的检测

玉米籽粒(来源于中国湖北、河北省)DNA提取、PCR扩增反应体系、扩增条件和PCR产物的电泳检测分析均同于实施例3中小麦籽粒中毒素DON和NIV的检测，其发明效果如附图6所示。

禾谷镰刀菌产生毒素的特异性序列1-4(SEQUENCE LISTING)

<110>华中农业大学

<120>一种镰刀菌毒素的分子检测方法

<130>

<141>2004-06-26

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Forward primer

<400>1

gccgtggggr taaaagtcaa a 21

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>Reverse primer

<400>2

tgacaagtcc ggtcgcacta gca 23

<210>3

<211>300

<212>DNA

<213>Deoxynivalenol-specific

<400>3

gccgtggggg taaaagtcaa atcagacaag tgcacagcaa ccggcaaggc tcacggacgg 60

gctacagtga atattcgtga tatgattgtg gcctcctcta tatcactcac atatccatag 120

ttattccaaa cagttcgagt tctgtagata gtggatacgt cttccaggat gtatgtaatc 180

tagcagccgg tagttgaaac acctactatg tagaggcgag gagcccagca tcgccagtat 240

gcaccaagta tgatgatctc cattgtgctt cccctgctgc tagtgcgacc ggacttgtca 300

<210>4

<211>360

<212>DNA

<213>Nivanlenol-specific

<400>4

gccgtggggg taaaagtcaa agtcaaatca gataagtacg tagcaaccgg aaaggctccg 60

tggcttcagt acggtagcga gataaatcac cttgatgtgg ttgccgcttc ctccatatca 120

ctcacatatc catagttatt ccaaacaatt cgagttctgc agatagtgga tacatcgtcc 180

aggatgtagt ctagcagtcg gtagttgaaa cacctactat gtagaggcga ggagcccgct 240

ttaccttgag cctggcagca tcgccagtac tatgtatgca ctaaaagtga tgatctcaat 300

cgtgcttccc cctgttgcga ctttcctagg gctaaattgc tagtgcgacc ggacttgtca 360

Claims

1、一种镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的特异片段，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：3所示，序列全长为300bp。

2、一种镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)毒素雪腐镰刀菌烯醇(NIV)的特异片段，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：4所示，序列全长为360bp。

3、用于扩增权利要求1和2的引物，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。

4、一种镰刀菌毒素的分子检测方法，其步骤包括：

1)从被测的生物材料中抽提DNA，得到DNA样品；

2)用序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对步骤1)所述的DNA样品进行PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的DNA片段；

3)用步骤2)得到的DNA片段，检测所述的生物材料中是否存在所述的毒素DON和/或NIV。

5、根据权利要求4所述的方法，其中所说的PCR步骤包括：

1)扩增反应体系：在25ul PCR反应液中，含有50ng模板DNA，2.5ul PCR缓冲液，1.5ul 25mM MgCl₂，2ul 1.25mM dNTPs，0.5ul的10pmol/ul的Primer1，0.5ul的10pmol/ul的Primer2，1U Taq DNA聚合酶，其中所述的Primer1为SEQ ID NO：1，所述的Primer2为SEQ ID NO：2；

2)PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 55sec，30个循环；及终延伸72℃ 6min；

3)电泳检测：反应完成后，取15ul PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的大小判定结果。

6、权利要求4所述的方法在检测镰刀菌毒素中的应用。

7、权利要求4所述的方法在检测籽粒、饲料或食品安全中的镰刀菌毒素中的应用。

8、权利要求1或2所述的DNA序列在检测镰刀菌毒素中的应用。

9、权利要求3所述的DNA序列在检测籽粒、饲料或食品安全中的镰刀菌毒素中的应用。