CN104726595B - 三种细菌性种传病害的多重pcr检测试剂盒及其专用引物和多重pcr检测方法 - Google Patents

三种细菌性种传病害的多重pcr检测试剂盒及其专用引物和多重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和多重PCR检测方法。本发明针对番茄溃疡病菌、番茄细菌性叶斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌，提供了检测番茄溃疡病菌的专用引物，目标产物片段为1086bp；检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物、目标产物片段为491bp；检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At、目标产物片段为290bp。本发明还提供了针对该三种病原菌的多重PCR最佳反应体系和反应条件。本发明不需克隆、测序和序列比对，即可快速同时检测番茄溃疡病菌，瓜类细菌性果斑病菌，番茄细菌性叶斑病菌，特异性强、快速、准确，节约了检测成本和时间，解决了单重反应的局限性。

Description

三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和 多重PCR检测方法
技术领域
本发明涉及三种植物病原的分子生物学检测技术领域，具体涉及到番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis),番茄细菌性叶斑病菌(pseudomonassyringae pv.tomato)及瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的多重分子生物学检测方法。
背景技术
我国是农产品贸易的第四大进口国和第五大出口国,但随着对外贸易的进一步扩大，植物及其产品的调运日趋频繁，特别是危险性最大的种子进出口更加频繁，使我国面临着更为严重的外来有害生物入侵的威胁，这己经成为危害我国生物多样性、生态环境和国民经济的一个十分重要和紧迫的问题.外来入侵生物的数量多、种类广。已有529种外来生物入侵遍及我国34个省级行政区，导致物种灭绝,生物多样性丧失和遗传多样性减少,对我国的生态安全产生了重大威胁。从国际自然保护联盟(IUCN)公布的全球100种最具威胁性的外来生物来看，我国已有50余种,每年对经济和环境造成的损失至少约2000亿元左右，使我国成为全球遭受外来生物入侵最为严重的国家之一。
本发明所述的三种细菌性种传病害是指番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis),番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringaepv.tomato),瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)引起的种传病害。
番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis)属于假单胞菌科，假单胞菌属,是一种重要的植物病原菌，可引起番茄溃疡和细菌性萎蔫，于1909年在美国首次发现。该病菌主要危害番茄，以及辣椒，龙葵，烟草等47种茄科植物。目前,除美国外,英国、日本、加拿大、澳大利亚等国都曾发生番茄溃疡病。20世纪30年代，番茄溃疡病在美国中西部地区流行,造成的产量损失最高可达80％以上。1943-1946年期间，该病害已经扩散至非洲、新西兰和澳大利亚，在番茄的种植造成了重大产量损失，欧共体将其列为检疫对象。1987年刘沣华和张乐在北京郊区首次发现此病害后，山西、内蒙古、辽宁、黑龙江也相继报道发生此病害。
番茄细菌性叶斑病亦称番茄细菌性斑点病或斑疹病，是由一种假单胞菌科，假单胞菌属,丁香假单胞菌番茄叶斑病致病型(Pseudomonas syringae pv.tomato)即番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)引起的病害，自1933年首次报道以来，在美国、加拿大、法国、英国、前苏联、南非、澳大利亚等26个国家和中国的台湾省有发生报道。该病菌主要为害番茄和辣椒,接种寄主为茄，主要危害番茄叶、茎、花、叶柄和果实。最主要的初侵染来源是带菌种子。大风大雨或大雾结露最易导致该病流行，所以在佛罗里达，随着雨季的到来往往引起季节性大流行。2006-2007年在甘肃省张掖地区调查研究,发现番茄细菌性叶斑病大面积爆发。发病率达40％以上，严重的达100％，导致当地番茄的产量减少,品质降低。
瓜类细菌性果斑病是由假单胞菌科噬酸菌属西瓜种病原(Acidovorax citrulli)引起的一种种传病害，其病原菌的命名经历了从类产碱假单胞菌西瓜亚种(Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp.citrulli)到嗜酸菌属燕麦种西瓜亚种(Acidovora avenaesubsp.citrulli)，再到嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)的过程。因而，也称为西瓜细菌性果斑病菌,瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)或者是瓜类果斑病菌。最早于1969年在美国发现该病，在美国、澳大利亚、中国、印度尼西亚、巴西、哥斯达黎加、土耳其等国均大面积暴发，给这些地区的瓜类生产造成了毁灭性的影响。我国从1986年开始陆续报道该病在国内的发生和危害，目前在台湾、海南、云南、广西、福建、吉林、陕西、内蒙古、新疆、甘肃、辽等地均有分布。该病原主要危害西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦等葫芦科作物，此外，还可侵染番茄、茄子和胡椒等作物。2000年内蒙古巴彦淖尔盟厚皮甜瓜细菌性果斑病大规模发生，平均减产46％，商品瓜率仅有1/3；2002年冬季海南省西瓜育苗场中由瓜类细菌性果斑病造成的毁苗率也高达30％～80％，给瓜农造成严重的经济损失。瓜类细菌性果斑病发病迅速、传播速度快、暴发性强，已成为影响我国瓜类生产的主要病害之一。
2007年，我国农业部颁布了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，公布了包括有害昆虫、软体动物、真菌、原核生物、线虫和病毒等，共435种有害生物。其中就包括了番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)和瓜类果斑病菌(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)，也称为瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)。这三种病菌不仅都会侵染番茄植株等粮食植物并且都能通过带菌种子进行远距离传播.以及借风雨、灌溉水和昆虫传播以及农事操作的刀具、器皿等进行近距离.导致农产品产量下降,极大的阻碍了我国农业发展.
目前,症状观察是进行植物病原检测常用的一种方法,主要是通过直接观察植物受害部位的病状特征主要是发病部位观察、症状变化的范围及不同发病个体之间症状特征的比较等.病状类型主要有：萎蔫(梨火疫病Erwinia amylovora)，斑点(水稻细菌性条斑病X.campestrispv.oryzicola、核桃斑点病X.juglandis)，溃疡(柑桔溃疡病X.citri、猕猴桃溃疡病Pseudomonas syringae pv.actinidiae)，软腐病(甘兰软Xantomonas.compeslris),畸形(冠瘿病Agrobecterium tumefaciens)和疮痂等.但是有的病害发病特征却极其相似,仅凭肉眼难以区分,当两种或以上病害侵染同一植株时也难以辨别.如番茄溃疡病症状与番茄细菌性疮痂病.症状观察难以做到检测的准确性。番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis),番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)以及瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)三种病菌在植物幼苗时都极易侵染植物幼苗，并且发病特征极其相似，凭症状观察更加难以区分，尤其是在植物的幼苗期都会从侵染子叶开始产生颜色较暗的斑点，随后逐渐扩散到果实，使果实表皮病变并产生小斑点，并会不断扩展。因此，这样难以做到诊断的准确性，极大的阻碍了对这三种病害的有效防治。严重降低了农产品的商品价值。
通过选择合适的培养基和分离方法对病原细菌的分离培养也可以做到对病害的分辨检测。常用的培养基有营养琼脂培养基(NA)、肉汁胨琼脂培养基(BPA)、金氏B培养基(KBA)、蔗糖蛋白胨培养基(SPA)等。分离纯化方法主要有半选择性培养基分离法、平板划线分离法、平皿稀释分离法等.但是在培养过程中不仅耗时费力而且难以做到大量样本的同时检测,无法达到快速,灵敏以及高通量的检测要求。
利用PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction简称PCR)方法检测作物病原具有灵敏、快速、特异性强等优点，其专一性和灵敏性则优于症状观察以及分离培养方法。中国专利申请号为200410009268.8的“一种瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法”(其公开号为CN1712538,公开日为2005年12月18日)建立了瓜类种子带细菌性果斑病菌快速检测的方法,该专利应用改良的ASCM选择性培养基富集分离、免疫吸附磁性分离和(实时荧光)PCR相结合的方法,从而提高了灵敏度和准确性并且快速。中国专利申请号为200410041287.9的“番茄溃疡病菌的检测基因及其检测试剂盒”(其公开号为CN1712538,公开日为2005年2月23日)选取位于16S-23S rDNA间的内源转录间隔区的核酸序列进行单重PCR检测。并且建立了最优反应体系达到对Cmm快速、简便、准确、灵敏的检测效果。中国专利申请号为CN201310737212.3的“一种基于LAMP技术的番茄细菌性溃疡病的检测方法”(其公开号为CN103773853A,公开日为2014年5月7日)建立了一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，其方法操作简便,成本低廉、高灵敏度、检测特异性大于99％、高特异性、不易污染。但是上述专利所述的检测方法只是分别针对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis),瓜类细菌性果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)的检测，并不能同时检测番茄溃疡病菌(Clavibacter Michiganensissubsp.michiganensis),番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)以及瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)，这就使得检测具有局限性。
发明内容
由于番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis),瓜类细菌性果斑病菌(Acidvorax citrulli)以及番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringaepv.tomato)可同时侵染番茄等植物，并且用一般的检测手段并不能有效的区分。本发明要解决的技术问题是克服现有针对这三种病原的单重PCR检测技术的局限性，提供一种基于应用特异性引物能准确，快速，同时检测这三种病害的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和多重PCR检测方法。
为解决上述技术问题，本发明有下列技术方案：
1.一种快速检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj，所述的检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj由上游引物和下游引物组成，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp。
2.一种快速检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc，所述的检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc由上游引物和下游引物组成，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为491bp。
3.一种快速检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At由上游引物和下游引物组成，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
4.三种细菌性病菌的多重PCR检测最优反应体系，其特征在于：该最优反应体系由以下反应物质和反应条件组成：
(1)反应物质的总体积为50μl，并由以下物质及用量组成：
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物1.5μl；
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物1.5μl；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物0.5μl；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物0.5μl；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物1.5μl；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物1.5μl；
10×PCR反应缓冲液5μl；
5U/μL Taq polymerase 0.4μl；
2.5mmol/L dNTPs 2.0μl；
50mmol/L Mg2+0.5μl；
1×105cfu/mL-1×108cfu/mL待检菌液样品1μl；
余量：RNase Free dH2O；
(2)反应条件：
95℃预变性5min，从94℃变性45sec,54℃退火45sec至72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min；
所述三种细菌性病菌分别为番茄溃疡病菌,番茄细菌性叶斑病菌，瓜类细菌性果斑病菌；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
5.三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒，包括：
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物；
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物；
10×PCR反应缓冲液；
5U/μL的Taq polymerase；
2.5mmol/L的dNTPs；
50mmol/L的Mg2+；
RNase Free dH2O；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：6所示，目标产物片段长度为290bp；
所述三种细菌性种传病害的三种细菌性病菌分别为番茄溃疡病菌,番茄细菌性叶斑病菌，瓜类细菌性果斑病菌。
6.一种快速检测番茄溃疡病菌、瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性叶斑病菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)待检种子样品浸泡液的制备
取待检种子放入灭菌离心管中,加入灭菌水,225r/min振荡培养3h,得待检种子样品浸泡液；
(2)多重PCR反应
取步骤(1)所述的待检种子样品浸泡液于试管中，加入10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上、下游引物各1.5μl，10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上、下游引物各0.5μl，10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上、下游引物各1.5μl，10×PCR反应缓冲液5μl，5U/μL的Taq polymerase 0.4μl，2.5mmol/L dNTPs 2.0μl，50mmol/L的Mg2+0.5μl，RNase Free dH2O补足至50μl；
反应条件为：95℃预变性5min，从94℃变性45sec,54℃退火45sec至72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min；
(3)电泳检测及判断
PCR反应终止后，取5μl PCR产物，用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，如果得到片段大小与预测的目标产物片段长度一致，则该待检种子样品中带有对应细菌；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的多重PCR检测试剂盒、专用引物、多重PCR检测方法、三种细菌性病菌的多重PCR检测最优反应体系，通过对该三种待检测病菌的目标片段的选择、三对专用引物的设计、退火温度和时间、延伸温度和时间、各反应成分的用量等参数设计，能同时检测番茄溃疡病菌、瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性叶斑病菌三种病菌，特异性高、检查结果准确、检查工序简化，无需再进行克隆、测序和序列比对，降低了检测成本、节省了检测时间，实现了对番茄溃疡病菌、瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性叶斑病菌三种病菌高效、快速、准确的检测，节约了检测成本和时间的，解决了单重反应的局限性。
本发明对于这三种病菌易同时感染植物的防治具有重要意义。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是本发明检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是本发明检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是本发明检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是本发明检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是本发明检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：6所示的是本发明检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列。
附图说明
图1是检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj对标准菌番茄溃疡病菌的PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图。图中：M为Marker，泳道1为番茄溃疡病菌，泳道2为瓜类细菌性果斑病菌，泳道3为番茄细菌性叶斑病菌，泳道4为阴性对照。
图2是检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc对标准菌番茄细菌性叶斑病菌的PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图。图中：M为Marker，泳道1为番茄细菌性叶斑病菌，泳道2为番茄溃疡病菌，泳道3为瓜类细菌性果斑病菌，泳道4为阴性对照。
图3是检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At对标准菌瓜类细菌性果斑病菌的PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图。图中：M为Marker，泳道1为瓜类细菌性果斑病菌即目标片段，泳道2为番茄溃疡病菌，泳道3为番茄细菌性叶斑病菌，泳道4为阴性对照。
图4是用本发明多重PCR检测试剂盒及本发明多重PCR检测方法对番茄溃疡病菌、瓜类细菌性果斑病菌、番茄细菌性叶斑病菌随机两两混合菌液以及混合三种菌液的PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图。图中：M为Marker，A、B、C表示各片段在图中横向的位置。泳道1为番茄细菌性叶斑病菌和番茄溃疡病菌的混合菌液样品，泳道3为番茄细菌性叶斑病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品，泳道5为番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品，泳道7为番茄细菌性叶斑病菌,番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌三种病菌的混合菌液样品。泳道2,4,6,8都为阴性对照；泳道1中A位置的条带、泳道5中A位置的条带、泳道7中A位置的条带都为番茄溃疡病菌的目标条带，目标条带长度为1086bp。泳道1中B位置的条带、泳道3中B位置的条带、泳道7中B位置的条带都为番茄细菌性叶斑病菌的目标条带，目标条带长度为491bp；泳道3中C位置的条带、泳道5中C位置的条带、泳道7中C位置的条带都为瓜类细菌性果斑病菌的目标条带，目标条带长度为290bp。
图5是用本发明的多重PCR检测试剂盒及本发明多重PCR检测方法对市售番茄种子浸泡液进行PCR扩增所得PCR产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图。图5中：M为Marker，泳道1至16均为市售番茄种子浸泡液.泳道4，泳道5，泳道6中自上而下的第一个条带为番茄溃疡病菌的目标条带，目标条带长度为1086bp，第二个条带为番茄细菌性叶斑病菌的目标条带，目标条带长度为491bp。泳道11,泳道12为番茄细菌性叶斑病菌的目标条带，目标条带长度为491bp；泳道1,泳道2,泳道3,泳道7,泳道8,泳道9,泳道10,泳道13,泳道14,泳道15,泳道16的番茄种子浸泡液为检测阴性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。
下列实施例中实验方法，均为常规方法，所用试剂、材料，均能从生化试剂商店以及种子市场购买到。所用的番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis),番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)以及瓜类细菌性果斑病菌(Acidvorax citrulli)三种病菌均可从微生物所购买到。
以下实施例对番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis),番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)以及瓜类细菌性果斑病菌(Acidvorax citrulli)三种细菌分别用无菌的牛肉膏蛋白胨培养液(配方为牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,蒸馏水100mL,pH 7.0～7.2)28℃恒温摇床180r/min培养48h，制成对应的菌液，且所得菌液的菌体个数约为1×108cfu/mL。
实施例1本发明快速检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的设计和用该对专用引物Xj采用常规分子生物学方法对番茄溃疡病菌的检测.
(1)检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的设计与合成
检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj是根据番茄溃疡病菌染色体基因组中16SrDNA基因片段，用DNAMAN6.0进行同源性分析，确定高度保守区域，再用Primer 6.0引物设计软件，设计特异性引物，将其编号为专用引物Xj，它是由专用引物Xj上游引物和专用引物Xj下游引物组成，所述的专用引物Xj上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述的专用引物Xj下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述的检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的目标产物片段长度为1086bp。
上述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
(2)用检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj检测番茄溃疡病菌的分子生物学方法，按以下步骤进行
①步骤(1)所述的检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj合成上述步骤(1)所述的专用引物Xj。该专用引物Xj由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
②番茄溃疡病菌的单重PCR反应
以番茄溃疡病菌的菌液为模板，瓜类细菌性果斑病菌的菌液，番茄细菌性叶斑病菌的菌液分别为阳性对照，灭菌后的空白牛肉膏蛋白胨培养液作阴性对照，按表1所述单重PCR反应体系进行PCR扩增，
表1单重PCR反应体系：
表1中：专用引物Xj的上游引物为检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的简写；专用引物Xj的下游引物为检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的简写。
PCR反应条件为:
95℃预变性4min，从94℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸7min。
③电泳检测
PCR反应终止后，取5μl PCR产物，用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出1086bp左右的片段即为番茄溃疡病菌，如图1。泳道1为番茄溃疡病菌目标片段，泳道2瓜类细菌性果斑病菌和泳道3番茄细菌性叶斑病菌均无条带。
④克隆和测序
用QIAquick PCR纯化试剂盒(购于Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)纯化PCR扩增产物，pGEM-T载体(购于Promega,Madison,WI,USA)连接，并通过Escherichia coli细胞(JM-109,购于北京索莱堡科技有限公司)转化，用标准生物学操作程序，由北京百泰克生物有限公司用AB13370DNA自动测序仪进行测序。
⑤序列比对
将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析，与Genbank报道的番茄溃疡病菌染色体基因组(登录号AM711867.1)的一致性为99％。证明本发明检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj对于番茄溃疡病菌有良好的特异性。
实施例2本发明快速检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的设计和用该对专用引物Dc采用常规分子生物学方法对番茄细菌性叶斑病菌的检测。
(1)检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的设计与合成
检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的专用引物Dc是根据番茄细菌性叶斑病菌染色体基因组中23SrDNA基因片段，用DNAMAN6.0进行同源性分析，确定高度保守区域，再用Primer 6.0引物设计软件，设计特异性引物，将其编号为专用引物Dc，它是由专用引物Dc上游引物和专用引物Dc下游引物组成，所述的专用引物Dc上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，所述的专用引物Dc下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，所述的检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的目标产物片段长度为491bp。
上述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
(2)用检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc检测番茄细菌性叶斑病菌的分子生物学方法除了以番茄细菌性叶斑病菌单种菌液为模板，以瓜类细菌性果斑病菌，番茄溃疡病菌的菌液分别为阳性对照,以及合成的专用引物和PCR反应中使用的专用引物是上述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc外，其余操作步骤及其条件等与实施例1(2)中②至④相同，不再赘述。该PCR反应终止后，取5μl PCR产物，用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增出491bp左右的片段即为番茄细菌性叶斑病菌，如图2,泳道1为番茄细菌性叶斑病菌即目标片段，泳道2番茄溃疡病菌和泳道3瓜类细菌性果斑病菌均无条带。
将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析，与Genbank报道的番茄细菌性叶斑病菌染色体基因组(登录号为NC_004578.1)的一致性为99％。证明本发明检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc对于番茄细菌性叶斑病菌有良好的特异性。
实施例3是本发明快速准确检测瓜类细菌性果斑病专用引物At的设计和用该专用引物At采用常规分子生物学方法对瓜类细菌性果斑病菌的检测.
(1)专用引物At及其设计与合成
检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At是根据瓜类细菌性果斑病菌染色体基因组中hrpB2基因片段，用DNAMAN6.0进行同源性分析，确定高度保守区域，再用Primer 6.0引物设计软件，设计特异性引物，将其编号为专用引物At，它是由专用引物At上游引物和专用引物At下游引物组成，所述的专用引物At上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述的专用引物At下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，所述的检测瓜类细菌性果斑病菌专用引物At的目标产物片段长度为290bp。
上述检测瓜类细菌性果斑病菌专用引物At由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
(2)用该专用引物At检测瓜类细菌性果斑病菌的分子生物学方法，该方法除以瓜类细菌性果斑病菌的菌液为模板，以番茄细菌性叶斑病菌，番茄溃疡病菌菌液分别为阳性对照,以及合成的专用引物和PCR反应中使用的专用引物是上述检测番茄溃疡病菌的瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At外，其余操作步骤及其条件等与实施例1(2)中②至④相同，不再赘述。该PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增出290bp左右的片段即为瓜类细菌性果斑病菌，如图3，图中泳道1为瓜类细菌性果斑病菌即目标片段，泳道2番茄溃疡病菌和泳道3番茄细菌性叶斑病菌均无条带。
将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析，与Genbank(登录号为CP000512.1)报道的瓜类细菌性果斑病菌染色体基因组的一致性为100％。证明本发明瓜类细菌性果斑病菌的专用引物对At对于瓜类细菌性果斑病菌有良好的特异性。
实施例4本发明提供的三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒，包括：
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物；
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物；
10×PCR反应缓冲液；
5U/μL的Taq polymerase；
2.5mmol/L的dNTPs；
50mmol/L的Mg2+；
RNase Free dH2O；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQID NO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQID NO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为290bp；
所述三种细菌性种传病害中的三种细菌分别为番茄溃疡病菌,番茄细菌性叶斑病菌，瓜类细菌性果斑病菌。
所述试剂盒中配有说明书，说明书中记载有用本发明多重PCR检测试剂盒进行多重PCR检测的最优反应体系如表2所示，反应条件为95℃预变性5min；从94℃变性45sec,54℃退火45sec,72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min；所述检测的三种细菌性病菌分别为番茄溃疡病菌,番茄细菌性叶斑病菌，瓜类细菌性果斑病菌。
表2本专利发明的最优反应体系
表2中：
专用引物Xj的上，下游引物为检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物，检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的简写；
专用引物Dc的上，下游引物为检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物，检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的简写。
专用引物At的上，下游引物为检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物，检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的简写。
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
实施例5随机混合的番茄溃疡病菌、瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性叶斑病菌三种病菌混合菌液的多重PCR检测
(1)混合菌液样品的PCR反应。
分别以番茄细菌性叶斑病菌和番茄溃疡病菌的混合菌液样品，番茄细菌性叶斑病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品，番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品，番茄细菌性叶斑病菌、番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌三种病菌的混合菌液样品为模板，以灭菌后的空白牛肉膏蛋白胨培养液作阴性对照，各样品模板分别用实施例4中表2所述的本发明最优反应体系进行PCR扩增。
反应条件为：95℃预变性5min；从94℃变性45sec,54℃退火45sec至72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min。
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
③电泳检测及判断
PCR反应终止后，分别取5μl PCR产物，用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增得到1086bp，491bp和290bp的相应组合片段即可认为对应成功检测出番茄溃疡病菌,瓜类细菌性果斑病菌以及番茄细菌性叶斑病菌，如图4，图中：M为Marker，泳道1为番茄细菌性叶斑病菌和番茄溃疡病菌的混合菌液样品，泳道3为番茄细菌性叶斑病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品，泳道5为番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品，泳道7为番茄细菌性叶斑病菌,番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌三种病菌的混合菌液样品。泳道2,4,6,8都为阴性对照。图4中A、B、C表示各片段在图中横向的位置，泳道1中A位置的条带、泳道5中A位置的条带、泳道7中A位置的条带都为番茄溃疡病菌的目标条带，目标条带长度为1086bp。泳道1中B位置的条带、泳道3中B位置的条带、泳道7中B位置的条带都为番茄细菌性叶斑病菌的目标条带，目标条带长度为491bp。泳道3中C位置的条带、泳道5中C位置的条带、泳道7中C位置的条带都为瓜类细菌性果斑病菌的目标条带，目标条带长度为290bp。
从图4可以看出，用本发明中的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和多重PCR检测方法能同时检测出番茄细菌性叶斑病菌，番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的随机组合样品。
图4中泳道1能够很清楚的看见长度为1086bp和491bp的条带，而泳道2的阴性对照无明显条带，这说明成功检测出番茄溃疡病菌和番茄细菌性叶斑病菌。说明了本专利同时检测番茄细菌性叶斑病菌和番茄溃疡病菌的准确性。
图4中泳道3是对番茄细菌性叶斑病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品的检测，图上能够很清楚的看见长度为491bp和290bp的条带，而泳道4的阴性对照无明显条带，这说明成功检测出番茄细菌性叶斑病菌和瓜类细菌性果斑病菌。说明了本专利同时检测番茄细菌性叶斑病菌和瓜类细菌性果斑病菌的准确性。
图4中泳道5是对番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品的检测，图上能够很清楚的看见长度为1086和290bp的条带，而泳道6的阴性对照无明显条带，这说明成功检测出番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌。说明了本专利同时检测番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的准确性。
图4中泳道7是对番茄细菌性叶斑病菌、番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的混合菌液样品的检测，图上能够很清楚的看见长度为1086bp、491bp和290bp的条带，而泳道8的阴性对照无明显条带，这说明成功检测出番茄溃疡病菌、番茄细菌性叶斑病菌和瓜类细菌性果斑病菌。说明了本发明同时检测番茄细菌性叶斑病菌、番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌的准确性。
实施例6用本发明多重PCR检测试剂盒及多重PCR检测方法检测市售16种番茄种子的带菌情况
(1)待检种子样品浸泡液的制备
取待检的16种番茄种子，分别编号为1至16。各取30粒分别放入2ml灭菌离心管中,加入1ml灭菌水,225r/min振荡培养3h,得到16个待检种子样品的浸泡液。
(2)多重PCR反应
分别取出步骤(1)16种待检种子样品浸泡液取1μL分别放入16个试管中，每个试管按如下方法操作：
每个试管中加入10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上，下游引物各1.5μl，10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上，下游引物各0.5μl，10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上，下游引物各1.5μl，10×PCR反应缓冲液5μl，5U/μL的Taq polymerase 0.4μl，2.5mmol/L dNTPs 2.0μl，50mmol/L的Mg2+0.5μl，RNase FreedH2O补足至50μl；
反应条件为：95℃预变性5min；从94℃变性45sec,54℃退火45sec至72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min；
(3)电泳检测及判断
PCR反应终止后，各试管取5μl PCR产物，分别用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，如果得到片段大小与预测的目标产物片段长度一致，则该种待检种子样品中带有对应细菌；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ IDNO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
检测结果如图5用本发明的多重PCR检测试剂盒及多重PCR检测方法对市售16种番茄种子的浸泡液带菌情况进行PCR扩增所得PCR产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图。图中：M为Marker，泳道1至16均为市售番茄种子浸泡液，泳道4，泳道5，泳道6中自上而下的第一个条带长度为1086bp，第二个条带为长度为491bp；泳道11,泳道12目标条带长度为491bp，泳道1,泳道2,泳道3,泳道7,泳道8,泳道9,泳道10,泳道13,泳道14,泳道15,泳道16的番茄种子浸泡液为检测阴性。
该试验结果表明：在代表16种番茄种子的浸泡液的泳道中,泳道4，泳道5，泳道6都检测出了代表番茄溃疡病菌和番茄细菌性叶斑病菌的目标条带，泳道11,泳道12检测出了代表番茄细菌性叶斑病菌的目标条带。其他泳道为检测阴性。这说明在检测的16种番茄种子中，对应4号种子，5号种子，6号种子含有番茄溃疡病菌和番茄细菌性叶斑病菌，11号种子，12号种子含有番茄细菌性叶斑病菌。1号到3号种子，7号到10号种子，13号到16号种子均不带有番茄细菌性叶斑病菌，番茄溃疡病菌和瓜类细菌性果斑病菌。
表明：本发明试剂盒及检测方法不需要再进行克隆、测序和序列比对，得到片段大小和预测目标片段一致，就可以确定该样品中带有对应细菌，简化了检测过程和实验成本。本发明多重PCR检测试剂盒、专用引物、多重PCR检测方法、多重PCR检测最优反应体系，对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)和瓜类细菌性果斑病菌(Acidvorax citrulli)三种病菌同时检测的特异性强、检测结果准确、快速，对于这三种病菌易同时感染植物的防治具有重要意义。克服了现有技术只能单一检测、检测过程复杂、成本较高、时间较长的缺陷。
<110> 云南农业大学
<120> 三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和多重PCR检测方法
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）
<400> 1
gaatgagcct gcgagtta 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）
<400> 2
ctacctgacc acctgagt 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 番茄细菌性叶斑病（Pseudomonas syringae pv.tomato）
<400> 3
gaggtatcag aagtgcgaat 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 番茄细菌性叶斑病（Pseudomonas syringae pv.tomato）
<400> 4
cgaagttacg gtgccatt 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)
<400> 5
gtccgagcgt acgttgag 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)
<400> 6
acggcacctg acccgttg 18

Claims (3)

1.三种细菌性病菌的多重PCR检测最优反应体系，其特征在于：该最优反应体系由以下反应物质和反应条件组成：
(1)反应物质的总体积为50μl，并由以下物质及用量组成：
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物1.5μl；
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物1.5μl；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物0.5μl；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物0.5μl；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物1.5μl；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物1.5μl；
10×PCR反应缓冲液5μl；
5U/μL Taq polymerase 0.4μl；
2.5mmol/L dNTPs 2.0μl；
50mmol/L Mg2+0.5μl；
1×105cfu/mL-1×108cfu/mL待检菌液样品1μl；
余量：RNase Free dH2O；
(2)反应条件：
95℃预变性5min；从94℃变性45sec,54℃退火45sec,72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min；
所述三种细菌性病菌分别为番茄溃疡病菌,番茄细菌性叶斑病菌，瓜类细菌性果斑病菌；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
2.三种细菌性种传病害的多重PCR检测试剂盒，包括：
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物；
10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物；
10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物；
10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物；
10×PCR反应缓冲液；
5U/μL的Taq polymerase；
2.5mmol/L的dNTPs；
50mmol/L的Mg2+；
RNase Free dH2O；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为290bp；
所述三种细菌性种传病害的三种细菌性病菌分别为番茄溃疡病菌,番茄细菌性叶斑病菌，瓜类细菌性果斑病菌。
3.一种快速检测番茄溃疡病菌、瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性叶斑病菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)待检种子样品浸泡液的制备
取待检种子放入灭菌离心管中,加入灭菌水,225r/min振荡培养3h,得待检种子样品浸泡液；
(2)多重PCR反应
取步骤(1)所述的待检种子样品浸泡液于试管中，加入10μmol/L检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上、下游引物各1.5μl，10μmol/L检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上、下游引物各0.5μl，10μmol/L检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上、下游引物各1.5μl，10×PCR反应缓冲液5μl，5U/μL的Taq polymerase 0.4μl，2.5mmol/L dNTPs 2.0μl，50mmol/L的Mg2+0.5μl，RNase Free dH2O补足至50μl；
反应条件为：95℃预变性5min；从94℃变性45sec,54℃退火45sec，72℃延伸45sec运行30个循环；72℃延伸10min；
(3)电泳检测及判断
PCR反应终止后，取5μl PCR产物，用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，如果得到片段大小与预测的目标产物片段长度一致，则该待检种子样品中带有对应细菌；
所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测番茄溃疡病菌的专用引物Xj的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1086bp；
所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测番茄细菌性叶斑病菌的专用引物Dc的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为491bp；
所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的专用引物At的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为290bp。
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