CN101608234B - 瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针及其检测方法属于农作物防病治病及植物检疫范畴。用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针序列:P-a.a.c:CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCPIP2CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG。以此探针为基础结合Macroarray技术的检测方法具较强的特异性、灵敏性及稳定性,为瓜类细菌性果斑病菌的检测提供了快速、灵敏、特异的技术方法。图为padlock探针检测瓜类细菌性果斑病菌的检测结果。

Description

瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针及检测方法
(一)技术领域
本发明涉及检测瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)padlock探针及其检测方法,属于生物技术领域。适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。 
(二)背景技术
瓜类细菌性果斑病是葫芦科植物上的毁灭性细菌病害,自1989年,美国佛罗里达洲、印第安纳洲及特拉华洲发生该病害以来,该病不断扩展蔓延至美国的15个洲。现主要分布在美国、澳大利亚、马利亚纳群岛、印度尼西亚、土耳其等国家(Langston et al,1999)。我国一些省份也有报道瓜类细菌性果斑病的发生和危害,给果农造成巨大损失。为了防止该病害危害和扩散蔓延,我国于2006年将其列入全国农业植物检疫性有害生物。 
该病菌主要附着在种子和病株残体上越冬,种子带菌为主要侵染,病菌随风、雨水或灌溉侵入植株气孔或受伤部位。受害果实病菌在其受害部位大量繁殖扩散造成再侵染(Schaad N.W.et al,1978;Rane K.K.et al,1992)。在我国,和瓜类细菌性果斑病对哈密瓜生产及相关产业构成极大的威胁。因此该病对我国哈密瓜产业的威胁不容忽视,需要我们尽快拿出综合防治方案,快速、准确地检测病原物是行之有效防治措施的基础和前提。 
传统的检测技术包括利用半选择性培养基分离和鉴定病菌、免疫学检测方法、致病性测定及过敏反应测定、生理生化反应测试等。这些方法往往需耗费较长时间并且灵敏度和准确性不高,因此常规的检测方法难以适应检疫的需求。近年来,采用PCR扩增病原菌的致病性基因、未知的DNA片段、质粒DNA和rDNA转录间隔区(ITS)等进行病原菌鉴定、检测及病害诊断为国际上广泛使用。目前已经验证的传统PCR检测方法主要根据Walcott.R R.(2000)的报道,在瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)16SrRNA设计了特异性引物WFB1和WFB2,但是该和这对引物用于A.a.c的特异性不强,对类产碱假单孢杆菌和嗜酸菌属的几个种扩增结果均呈阳性。根据张祥林(2007)对A.a.c的16SrDNA序列设计的引物对BFB64/65,以此构建的PCR检测体系更灵敏、准确,对A.a.c的检测灵敏度 可达50CFU/μL。Walcott.R R.(2000)在A.a.c16S-23S ITS序列设计了特异性引物(SEQID4)和(SEQID5)。Song W Y.(2003)的报道,将配制的系列10倍梯度菌悬液用特异引物对Aacf3/Aacr2和探针Aap2进行实时荧光PCR检测。谢关林等(2006)采用将免疫学和经典PCR结合的免疫捕获PCR(IC-PCR)技术对带菌种子进行检测。 
Padlock探针(PLPs)是一种用于病原菌分子检测的新方法。Padlock探针是一条长度为100bp左右的单核苷酸探针(图4-1),包括磷酸化的5’端和羟基化的3’端,这两端能够识别特定目标物的DNA序列(Nilsson et al,1994),我们通常称之为T1端和T2端。在T1端和T2之间,存在着一段通用序列和一段特异序列,我们称之为P1、P2端和ZipCode。在进行反应时,首先将padlock探针和要检测的目标DNA进行连接,在TaqDNA连接酶的作用下,探针的T1端和T2端通过和特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合,探针的5’端和3’端连成环状。由于TaqDNA连接酶的特性,只有DNA序列和探针的T1端和T2端完全互补时,探针才能形成环状,否则,探针以线性存在。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针,然后采用所有探针的通用端T1端和T2端的引物对切除后的产物进行滚环扩增。然后将扩增后的产物与固定在膜上或者Microarray上的与ZipCode序列互补的核酸序列进行杂交(Shoemaker et al,1996)。通过膜上的地高辛标记信号或者Microarray上的荧光来判断检测样品中是否有特定的病原物。由于padlock探针可与Macroarray或者Microarray技术相结合,因此能够在检测的过程中实现高通量(Hardenbol et al,2003)。目前,padlock检测探针因其灵敏度高、特异性强的优点多与基因芯片相结合应用于病毒性疾病分子的检测(Baner J et al,2007)和单核苷酸突变检测当中(Baner J et al,2003)。目前尚未有将padlock探针应用于植物病原菌实际检测的实例。 
参考文献 
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(三)发明内容
技术问题 
本发明的目的是解决现有技术中瓜类细菌性果斑病菌的padlock检测探针及其检测方法,意在避免常规的PCR检测方法易受检测样品杂质干扰、以及假阳性的现象。对瓜类细菌性果斑病菌进行检测,准确性高、周期短、灵敏性好。 
技术方案 
本发明的目的意在克服上述现有技术的不足,提供快速、可靠、灵敏度高、特异性强的检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针以及检测方法。 
实现上述目的的技术方案: 
用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针序列: 
P-aac:CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCPIP2CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG
探针的靶标识别序列(加下划线的序列)取自待测病原菌16S-23S rDNA(ITS)区域特异的核酸序列。探针中间PIP2(CTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGAT GTACCGCTATCGT)为引物结合区。 
Padlock探针是一种长寡核苷酸探针,其两端的序列可通过核酸间的互补与靶标DNA结合。通过和靶标DNA的杂交,padlock探针的两端在连接酶的作用下连成环状,具有非常高的特异性。Padlock探针可与Macroarray技术结合进行多重检测。 
Padlock探针检测方法,包括如下步骤: 
(1)探针的连接与外切酶处理。首先将padlock探针和待检测的目标DNA进行杂交,在TaqDNA连接酶的作用下,探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合,探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。(2)探针的扩增。采用两条探针P-a.a.c经地高辛标记的通用引物对连接产物进行扩增。利用2.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析检测结果。(3)Macroarray检测。将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针(cZipcode探针)进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中是否含有病原物。 
有益效果采用上述技术方案,突出的技术进步在于: 
(1)本发明设计了分别适用于瓜类细菌性果斑病菌检测的padlock探针。(2)本发明利用padlock探针结合Macroarray技术,实现了对瓜类细菌性果斑病菌的多重检测,检测方法可靠、灵敏度高、特异性强。(3)采用padlock探针作为分子检测工具,有效地避免传统PCR检测方法的假阳性现象。传统的基于PCR扩增的分子检测通常只能检测单种病原物,荧光定量PCR的出现在一定程度上解决了这一问题,通过在反应的体系中添加不同荧光染料,可以同时检测1种以上的病原物。但是由于荧光染料种类的限制和彼此之间的干扰,采用这种方法对多种病原物进行检测时候效果往往不好。采用padlock探针作为分子检测工具,结合Macroarray技术弥补了实时定量PCR检测因受到引物设计问题、荧光染料的种类和荧光定量PCR仪光源是单一光源等问题而不能同时检测非常多的病原物的不足。 
(四)说明书附图 
图1.Padlock探针的结构示意图及检测原理。 
图2A.瓜类细菌性果斑病菌特异性验证结果。 
M为DNA Maker DL2000,1~10为瓜类细菌性果斑病菌,11~21为其他细菌,22为阴性对照。 
图2B.瓜类细菌性果斑病菌的灵敏度验证结果。 
M为DNA Maker DL2000,1-6为病原菌DNA依次为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg7为阴性对照。分别以十倍梯度稀释的DNA为模板,利用padlock探针检测,最低可检测到1pg。 
图3.Padlock探针结合Macroarray技术检测瓜类细菌性果斑病菌结果。cZip control=TATGGTCGGCAATTCCCTGC。 
图4.利用padlock探针对市售哈密瓜种子的检测结果。 
结果表明从市售6份的哈密瓜种子样品中共检测出4份带有瓜类细菌性果斑病菌。 
(五)具体实施方式
实施例1:一种利用padlock探针的分子检测方法,用于检测瓜类细菌性果斑病菌。 
用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针序列: 
P-aac:CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCPIP2CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG
(1)连接反应液包括:20mM Tris-HCL,pH 9.0,25mM KCH3COO,10mMMg(CH3COO)2,10mM DTT,1mM NAD,0.1%Triton X-100,2.4U Taq DNA连接酶,1μl待测模板,100pm探针P-a.a.c。连接的反应程序为:95℃预变性5分钟;然后进入循环,95℃变性30秒,65℃连接5分钟,反应共进行20个循环;然后95℃灭活15分钟。采用核酸外切酶切除自连和错连的探针:在连接后的产物中加入2个单位的核酸外切酶I和2个单位的核酸外切酶III,37℃反应2个小时,然后将反应后的产物95℃灭活3小时。 
(2)采用引物P1-F(5’-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3’)P2-R(5’-CCGAGAT GTACCGCTATCGT-3’)对连接产物进行PCR扩增,反应液包括:0.5μMP1-F和P2-R,4种dNTP各50μM,2.5μl 10×PCR反应缓冲液,2mM Mg2+,2.5μ1 1%BSA,1.25单位Taq酶(TaKaRa),3μl经核酸外切酶处理后的连接产物。反应程序为:94℃预变性5min;然后进入循环,94℃变性30sec,60℃退火30sec,72℃延伸 30sec,共35个循环;最后72℃延伸7min。利用2.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析检测结果。 
(3)Macroarray检测。将1μL cZipcode探针点于尼龙膜上,每条cZipcode探针重复4次,经紫外交联30s固定。将固定好的膜放入杂交管中,加入预杂交液(0.02%SDS、5×SSC、50%去离子甲酰胺、0.1%N-laurysarosine、50mmol·L-1磷酸钠、pH 7.02%封闭剂)于杂交炉中42℃预杂交1h,弃预杂交液,将经地高辛标记的扩增产物沸水浴中变性10min,迅速移至冰上,5分钟后加入预杂交液中,42℃杂交过夜后,用大量2×SSC、0.1%SDS室温洗膜2次,每次5min,再用0.5×SSC、0.1%SDS于68℃洗膜2次,每次15min。洗膜后把膜加入洗涤液(0.1mol·L-1马来酸、0.15mol·L-1NaCl,pH 7.5、0.3%吐温)中洗膜2min,弃去,用封闭液(1%封闭剂、0.1mol·L-1马来酸、0.15mol·L-1NaCl,pH 7.5)封闭30min后,加入用封闭液稀释了5000倍的Anti-DIG-AP,轻摇30min。最后,将结合完抗体的膜用洗涤液洗膜2次,每次15min,加入检测液(0.1mol·L-1Tris-HCl、0.1mol·L-1NaCl、pH 9.5)平衡3min,再加入NBT/BCIP溶液,黑暗中静止显色2h,待观察到理想的显色后,用无菌水浸泡10min终止反应,进行拍照。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中是否含有病原物。 
实例1从市售的哈密瓜种子中检测瓜类细菌性果斑病菌 
上述瓜类细菌性果斑病菌的padlock检测探针及检测方法检测市售的哈密瓜种子,包括: 
1)参照Walcott(2000)的方法将市售的哈密瓜种子的悬浮液作为模板。 
2)参照上述技术方案利用padlock检测探针P-a.a.c结合Macroarray检测样品。检测结果见图4。结果表明从市售6份的哈密瓜种子样品中共检测出4份带有瓜类细菌性果斑病菌。证明了上述技术方案能够应用于瓜类细菌性果斑病菌的实际检测。 
序列表 
<110>南京农业大学 
<120>瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针及检测方法 
<160>1 
<210>1 
<211>102 
<212>DNA 
<213>瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli) 
<400>1 
CGGCACGGTG CAGTTTCCTG CTTTCCGCCT CGACCGTTAG 
CAGCATGACC GAGATGTACC GCTATCGTCC TTACGCTAGG 
TCGAGAGTAT TTTTGTCACC GG 

Claims (2)

1.用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针P-a.a.c,其特征在于,所述探针P-a.a.c的序列为:
5’-CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTCCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG-3’。
2.权利要求1的探针结合Macroarray技术对瓜类细菌性果斑病菌进行检测的方法,其检测步骤为:
(1)探针的连接与外切酶处理,首先将padlock探针P-a.a.c和待检测的目标DNA进行杂交,在TaqDNA连接酶的作用下,探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合,探针的5’末端和3’末端连成环状,采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针,所述探针P-a.a.c序列为:
5’-CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTCCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG-3’;(2)探针的扩增,采用经地高辛标记的引物对连接产物进行扩增,利用2.5%琼脂糖凝胶电泳;(3)Macroarray多重检测,将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针即cZipcode探针进行杂交,通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中是否含有病原物。
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