CN104962659B - 丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针及应用，申请人通过将丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系与其他细菌的序列用软件进行序列比对，选取核苷酸特异部分为Padlock探针为T2端，靠近T2端的作为T1端，设计了一条特异性极好的Padlock探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。该探针可显著区分与丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系核苷酸序列极相似的丁香假单胞菌黄瓜致病变种甜瓜株系，同时与其他类别的菌株也能显著区分，且检测限达到了100fg/μL。检测方法可靠、灵敏度高、特异性强。可广泛适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护。

Description

丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)黄瓜株系Padlock探针及应用。本发明提供的探针适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

背景技术

黄瓜细菌性角斑病是在黄瓜上由丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)引起的的一种常见细菌性病害。主要在黄瓜幼苗和成株上发病，为害叶片、叶柄、卷须、茎蔓和瓜条。发病初始时产生水渍状小斑点，因受叶脉的限制，后期病斑呈现多角形，淡黄色至褐色，最后叶会干枯、破裂。黄瓜细菌性角斑病菌在发病叶片背部溢出乳白色的菌脓，但这种典型症状特点我们在实际田间或者大棚内不太能经常看到。一般我们能看到色泽不一致的多角形病斑。病菌在植物体内的新陈代谢作用往往受温度所影响，其最适温度为25℃左右。在适宜发病条件下，黄瓜细菌性角斑病的发病、扩展蔓延的时间很短，能使整株黄瓜叶片枯死，影响植株结果，造成严重的经济损失。

黄瓜细菌性角斑病主要以带菌种子进行远距离传播，种子也可随病残体遗留于土壤中作为最初侵染源。角斑病菌通过水溅或者其他途径，侵入幼苗子叶、水孔或伤口，引起寄主发病。黄瓜细菌性角斑病菌除了能侵染黄瓜外，还能侵染葫芦、西葫芦等葫芦科，以及一些非葫芦科作物。近年来黄瓜细菌性角斑病在中国有逐年加重的趋势，将严重影响黄瓜产业的发展。因此对黄瓜细菌性角斑病菌的研究具有重要的经济价值。

国内第一例黄瓜细菌性角斑病由俞大绂等报道，黄瓜细菌性角斑病在国内的传播蔓延和为害情况从八十年代末开始开始受到关注。黄仲生等于北京、内蒙和辽宁三地的黄瓜上分离到大量菌株，经过鉴定均为丁香假单胞菌黄瓜致病变种(P.syringaepv.lachrymans)，同时对其发病症状同样进行了描述。1991年金潜等人通过一系列的实验证明黄瓜细菌性角斑病和甜瓜细菌性角斑病均是丁香假单胞菌黄瓜致病变种引起的(金潜等，1991)。1988年孙福等人在黄瓜病株上分离得到该病原菌并通过人工接种的方法研究了其寄主范围，其黄瓜病株来源于辽宁省、内蒙古和北京市等地(孙福在等，1988)。2000，年张昕等人在新疆哈密瓜上分离到11个菌株，通过一系列鉴定方法发现有9株为丁香假单胞菌黄瓜致病变种(张昕等，2001)。2004-2005年，李亚利等在甘肃省瓜类植株上采集到叶片和果实，该叶片和果实具有类似于西瓜果斑病的症状，通过分子生物学方法鉴定病原菌为黄瓜细菌性角斑病菌，并证明了黄瓜细菌性角斑病菌还可以侵染辣椒、番茄等茄科植物(李亚利等，2006)

Padlock探针是一条长的寡聚核苷酸链，长度为100bp左右，探针两端(磷酸化的5端和羟基化的3端)能与目的片段进行特异性的结合。探针两端称为T1端和T2端，探针两端有很强的特异性，只有与目标片段完全匹配时，其在连接酶的作用下，探针两端与靶标片段互补形成环状。为了使这项技术用于病原菌的诊断，Marianna Szemes等人对如何保证高特异性和在实际检测中没有目的靶标的情况下如何消除自身连接反应进行了优化。将T1端和T2端设计成不对称的两端，并且T2端(3’端)明显短于T1端(5’端)(Marianna Szemes等2005)。

Padlock探针除了T1端和T2端外，还包括一段特异性序列和通用序列，特异性序列我们称为zipcode，通用序列称为P1端和P2端。将目标检测物提取DNA后，将待检测的DNA与设计好的探针进行连接，在连接酶的作用下探针T1端和T2端与靶标DNA完全序列互补时，探针T1端和T2端在靶DNA上相邻连接形成稳定的环状(Larsson C，2004)。探针不能与DNA完全匹配时则以线状存在。然后用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切Ⅲ对错配和没有成环状的探针进行消化去除，消化后用通用引物对消化后的产物进行普通PCR扩增。产物进行凝胶电泳通过电泳条带的有无能初步判定检测结果。为进一步确定实验的可靠性，将扩增后的产物进行杂交。先将zipcode的反向互补序列用地高辛标记，产物固定于尼龙膜上，然后将标记好的zipcode的反向互补序列与尼龙膜上的产物进行杂交，通过膜上的杂交信号能更好的判定目标检测物中是否存在特定的病原检测物。

Marianna Szemes等，运用Padlock探针结合Microarray技术对十种重要的植物病原菌进行了检测并对这种技术成功的进行了优化，结果表明这是一种灵敏度跟特异性很好，效率很高的高通量检测技术。

田艳丽(2008)对6种重要植物病原菌进行了高通量检测，其中包括四种我国对外检疫病原菌。并且成功的将其运用于实际样品检测，其中在瓜类细菌性果斑病菌上设计的Padlock探针能将其成功与燕麦褐条病菌区分开，并且这两种病原菌所选的特异性序列只有一个碱基的差异。这是其它分子检测手段很难达到的(田艳丽，2008)。

王辉等Padlock探针技术用于5种支原体的检测，将ITS间隔区作为靶标区域。并同时进行了5种支原体的高通量检测。结果表明多重检测结果与单一的探针检测结果相一致。有高敏感性和特异性(王辉等2010)。

目前主要用普通PCR对丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系进行检测，而普通PCR容易出现假阳性等问题，发明Padlock探针的目的在于避免常规的PCR等检测方法易受检测样品中杂质干扰、以及假阳性的现象。

Padlock探针有很强的特异性，能够检测单碱基突变，弥补了普通PCR的不足。设计探针的前期是找到一条特异性的序列，得到特异性序列后并不能简单的得到一条特异性探针。特异性探针的设计是一个大量筛选和反复验证的过程。Padlock探针是一条长的寡聚核苷酸链，长度为100bp左右，探针两端(磷酸化的5端和羟基化的3端)能与目的片段进行特异性的结合。探针两端称为T1端和T2端，探针两端需要有很强的特异性，所以T1端和T2端的位置、长度、GC含量等都要经过反复考量，无数次的试验后最后才有可能得到一条特异性强和灵敏度高的探针。

Padlock探针具有很强的特异性，只有与目标片段完全匹配时它才能形成环状，Padlock探针能够检测单碱基突变，探针不能与DNA完全匹配时则以线状存在。然后用Exonuclease I和Exonuclease III错配和没有成环状的探针进行消化去除，消化后用通用引物对消化后的产物进行普通PCR扩增。将Padlock探针结合Microarray技术能够实现丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系高通量检测。此方法避免了常规的PCR等检测方法易受检测样品中杂质干扰、以及假阳性的现象。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针，探针序列为SEQ ID NO.1所示。利用本发明提供探针，可避免常规的PCR等检测方法易受检测样品中杂质干扰、以及假阳性的现象。可对丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系进行检测，并且特异性强、灵敏度高。

本发明的另一个目的在于提供丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针的应用，包括利用该探针制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒，或将其与Macroaary结合进行高通量检测。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明的发明思路为：将丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系与其他细菌的序列用软件进行序列比对，选取核苷酸特异部分为Padlock探针为T2端，靠近T2端的作为T1端。然后与GenBank登录的所有细菌序列比较以确保待检测细菌Padlock探针的特异性。特异性探针的设计是一个大量筛选和反复验证的过程，T1端和T2端为不对称的两端，并且T2端(3端)明显短于T1端(5端)，T1端和T2端的位置、长度、GC含量等都要经过反复考量，试验。探针的总长度为100bp左右，所以T1端和T2端的长度和位置都是可变的，设计过程中先确定一个位点，分别从两边设计T1端和T2端，若先确定T1端后，T2端从10-25个碱基数依次试验特异性，若先确定T2端的数量，则依次找寻最佳T1端位置和数量，直到找到最佳位点设计特异的T1端和T2端。本发明寻找了许多看家基因，分别在不同看家基因的的不同位点上设计T1端和T2端，设计了大量的探针，不停筛选试验。不同特异性探针的T1端和T2端的长度都不是固定的。所以要设计T1端和T2端最佳的位置和长度。

一种丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针，序列如下：

CTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGT ACCGCTATCGT

丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针的应用，包括利用所述的Padlock探针制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒，或将Padlock探针结合Macroaary杂交后进行检测等。

Padlock探针制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒，试剂盒的应用过程包括：

PLP连接反应体系(10ul)：0.2μL Taq DNA连接酶(40U/μL)，1μL 10×Taq DNA连接酶Buffer，1μL Padlock探针(2μmol/L)，6.8μL灭菌去离子水，1μL待测模板DNA。

连接反应为：首先预变性95℃，5min；然后进行扩增循环：95℃变性30s；65℃退火5min，共30个循环；最后95℃灭活5min。

PLP酶切反应体系：在连接后的产物管中加入0.5U Exonuclease I和0.5UExonuclease III(Takara Biotechnology Dalian China)，以及1μL 10×Exonuclease IBuffer[500mM Tris-HCl(pH8.0),50mM MgCl₂,10mM DTT]和11μL 10×Exonuclease IIIBuffer[670mM Tris-HCl(pH8.0),67mM MgCl₂,10mM DTT]。

酶切反应程序为：37℃反应1个小时，然后将反应后的产物95℃灭活30min。

PLP扩增反应体系(25μL)：2.5μL 10×Taq聚合酶Buffer[500mM KCl，Tris-HCl(pH8.3)]，1.5μL MgCl₂(25mM)，2.0μL dNTP(2.5mM each)，2.5U Taq DNA聚合酶(TakaraBiotechnology Dalian China)，2.5U Uracil-DNAGlycosylase(New England Biolabs,Ipswich,MA),1μL10×Uracil-DNAGlycosylase Buffer[200mM Tris-HCl,10mM EDTA,10mMDTT(pH8.0)](New England Biolabs,Ipswich,MA)，2μM引物P1-f19(5’-CGAGATGTACCGCTATCGT-3’)和2μM引物P2-r20(5’-TCATGCTGCTAACGGTCGAG-3’)各1μL，3μL上述酶切产物作为扩增模板，无菌水补足到25μL。

反应程序为：50℃激活酶活性2min，95℃变性10min；然后进入循环扩增：95℃热激15s；60℃退火1min，35个循环。

取4μL扩增产物于2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统上观察结果并拍照。

Padlock探针结合Macroaary进行杂交检测，包括以下步骤：Zipcode反向互补序列用地高辛标记后与固定在尼龙膜上的PCR扩增产物进行杂交。丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系的扩增产物杂交后会显色。而非目的菌株杂交后无颜色反应。

所述的zipcode反向互补序列为：CATCGAGTCCAACTGATCTA。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明设计了适用于丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系检测的Padlock探针。

(2)本发明利用Padlock探针结合Macroaary技术，实现了对丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的检测，该探针可显著区分与丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系核苷酸序列极相似的丁香假单胞菌黄瓜致病变种甜瓜株系，同时与其他类别的菌株也能显著区分，且检测限达到了100fg/μL。检测方法可靠、灵敏度高、特异性强。

(3)采用Padlock探针作为分子检测工具，有效地避免传统PCR检测方法的假阳性现象。传统的基于PCR扩增的分子检测通常只能检测单种病原物，荧光定量PCR的出现在一定程度上解决了这一问题，通过在反应体系中添加不同荧光染料，可以同时检测1种以上的病原物。但是由于荧光染料的种类限制和彼此之间的干扰，采用这种方法对多种病原物进行检测的时候效果往往不好。采用Padlock探针作为分子检测工具，结合Macroaary技术弥补了实时荧光定量PCR检测因受到引物设计问题、荧光染料的种类和荧光定量PCR仪光源是单一光源等问题而不能同时检测非常多的病原物的不足。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均已公开。

实施例1：

丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针，将丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系和所有参试菌株(部分菌株表1所示)序列通过软件进行序列比对，选取核苷酸特异部分为Padlock探针为T2端，靠近T2端的作为T1端。然后与GenBank登录的所有细菌序列比较以确保待检测细菌Padlock探针的特异性，最终获得探针序列如下：

CTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGT ACCGCTATCGT

双下划线：分别为T1和T2；下划线：通用序列P1和P2；粗体：用于后续杂交反应的特异识别序列Zipcode。

表1供试菌株及Padlock探针检测结果

+表示阳性结果；‐表示阴性结果

实施例2：

Padlock探针在制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒中的应用，应用过程包括

(1)按照常规方式提取待测菌株的DNA

(2)PLP连接反应体系(10μL)

0.2μL Taq DNA连接酶(40U/μL)，1μL 10×Taq DNA连接酶Buffer，1μL Padlock探针(2μmol/L)，6.8μL灭菌去离子水，1μL待测模板DNA。

连接反应程序：首先预变性95℃，5min；然后进行扩增循环：95℃变性30s；65℃退火5min，共30个循环；最后95℃灭活5min。

(3)PLP酶切反应

在连接后的产物管中加入0.5U Exonuclease I和0.5U Exonuclease III(TakaraBiotechnology Dalian China)，以及1μL10×Exonuclease I Buffer[500mM Tris-HCl(pH8.0),50mM MgCl₂,10mM DTT]和1μL 10×Exonuclease III Buffer[670mM Tris-HCl(pH8.0),67mM MgCl₂,10mM DTT]

酶切反应程序为：37℃反应1个小时，然后将反应后的产物95℃灭活30min。

(4)PLP扩增反应体系(25μL)：2.5μL 10×Taq聚合酶Buffer[500mM KCl，Tris-HCl(pH 8.3)]，1.5μL 25mM MgCl₂，2.0μL dNTP(2.5mM each)，2.5U Taq DNA聚合酶(TakaraBiotechnology Dalian China)，2.5U Uracil-DNAGlycosylase(New England Biolabs,Ipswich,MA),1μL10×Uracil-DNAGlycosylase Buffer[200mM Tris-HCl,10mM EDTA,10mMDTT(pH8.0)](New England Biolabs,Ipswich,MA)，2μM引物P1-f19(5’-CGAGATGTACCGCTATCGT-3’)和2μM引物P2-r20(5’-TCATGCTGCTAACGGTCGAG-3’)各1μL，3μL上述酶切产物作为扩增模板，无菌水补足到25μl。反应程序为：50℃激活酶活性2min，95℃变性10min；然后进入循环扩增：95℃热激15s；60℃退火1min，35个循环。

(5)观察实验结果：吸取3μL扩增产物混合2μL 6×Loading Buffer在2％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，使用DL 2000DNAMarker，利用凝胶成像系统观察分析电泳结果并成像。能获得一条111bp的特异性条带的即为丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系。

实施例3：

Padlock探针与Macroaary结合进行多重检测，包括以下步骤：

(1)探针制备取zipcode反向互补序列20μL，加入Roche DIG杂交试剂盒中的1号4μL，充分混匀，放置于37℃温育22-24h。70℃水浴中终止反应10min，保存于-20℃冰箱。

所述的zipcode反向互补序列为：CATCGAGTCCAACTGATCTA

(2)点样中和及紫外交联将实施例2中步骤(2)的PCR产物于沸水浴中10min中后迅速放置于冰盒中，取2μL点于尼龙膜上。在干净的玻璃上放置一张比膜稍大的滤纸并用中和液浸湿，将点样后的尼龙膜置于上面静置4min。然后放于自然空气干燥30min，置于紫外交联仪上交联5min。将固定好的杂交膜置于10×SSC溶液中浸润平衡5min。

(3)预杂交将10ml预杂交液倒入杂交管中，按55℃杂交温度预热15min。将浸润平衡好的尼龙膜放入预热的杂交管中，55℃预杂交1h。

(4)杂交取出杂交膜置于另一杂交管中，加入5ml含有已标记好的探针的新鲜杂交液，55℃杂交过夜。

(5)洗膜用100ml的洗脱液A(10mL 20×SSC,5mL 5％SDS,85mL灭菌水)于68℃杂交炉中洗涤30min，然后用洗脱液B(1mL 20×SSC,5mL 5％SDS,94mL灭菌水)于68℃杂交炉中洗膜两次每次15min。然后用Washing Buffer(50mL马来酸加入150μL吐温20)于室温下轻摇洗脱5min。

(6)显色将尼龙膜转置于1×Blocking Buffer r(2mL 1％blocking solution,18mL马来酸)静置30min，接着放于Antibody solution(3μL anti-DIG-AP-conjugate,2mL1％blocking solution,18mL马来酸)中静置30min，Washing Buffer轻摇洗脱2次每次15min，在20mL Detection buffer中平衡5min，最后置于10ml现配的Color substrate(20mLDetection buffer,400μL四唑硝基蓝stock solution)中避光显色1-7h。尼龙膜出现明显清晰的条带后，用灭菌水浸泡5min停止反应，观察拍照。

目的菌株(丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系)杂交后会显色。而非目的菌株杂交后无颜色反应。

实施例4：

Padlock探针的特异性检测：

利用实施例2所述的方法，对包括表1中的菌株及其他菌株DNA进行Padlock探针检测。

结果显示：

所有的丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系反应结果均为阳性，都能得到一条111bp的特异性条带。而其余参试菌株(包括所有丁香假单胞菌黄瓜致病变种甜瓜株系)及空白对照均无扩增产物产生。说明此探针对丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系具有极好的特异性。

同样的，利用实施例3所述方法，将扩增后的产物取2ul点在尼龙膜上进行斑点杂交技术，目的菌株杂交后显色，并且结果与PLP凝胶电泳实验结果相一致。而非目的菌株杂交后无颜色反应。结果表明此方法能够将丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系与非丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系完全区分开。

实施例5：

Padlock探针的的灵敏度检测

将DNA浓度为1ng/μL的目的菌株DNA按10倍梯度稀释，依次为1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL共七个梯度。连接体系中加入100fg目的DNA基因组，都能扩增出111bp的目的片段。所以黄瓜株系探针的检测灵敏度为100fg/μL。Padlock探针结合Macroaary杂交检测靶标基因组DNA的灵敏度也为100fg/μL。

实施例6：

人工模拟带菌种子的检测

利用实施例3的方法，Padlock探针结合Macroarray技术进行了病原菌的高通量检测，步骤包括

1)取约200颗健康的黄瓜种子浸泡于OD为1的丁香假单胞菌黄瓜治病变种黄瓜株系菌悬液中4h,然后将带菌种子自然风干。

2)将风干后的带菌种子和健康种子按照100/1000、50/1000、10/1000、1/1000和0/1000混合。浸泡于50ml无菌水中，震荡4h后，取浸提液提取DNA作为模板进行实验。

3)利用实施例3的方法进行检测，结果显示，能将1粒带菌种子从1000粒健康的种子检测出来，模拟种子带菌检测率达到0.1％(1/1000)。

实施例7：

市售黄瓜种子检测

从市售的黄瓜种子中检测丁香假单胞黄瓜致病变种甜黄瓜株系

用上述的丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针及检测方法检测市售的黄瓜种子，包括：

(1)运用探针对39份不同来源的市售黄瓜种子进行检测，每份种子取50g，分别将待测种子加100mL无菌水浸泡4h，取浸泡液10000r/min离心10min，弃上清，重复2次，加入5mL无菌水悬浮沉淀并提取DNA作为模板进行市售黄瓜种子检测，并设置阴性对照和阳性对照。

(2)参照实施例3所述方法利用Padlock探针结合Macroaary技术检测样品。

结果表明从市售的39份黄瓜种子中未检测到种子带菌。

人工接种实验及市售黄瓜种子检测实验表明该检测体系可成为黄瓜种子带菌检测的有效手段。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南省农业生物资源利用研究所

<120> 丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针及应用

<130> 丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcgtcgccg aacgggcgcg gtacggatcg gtgctcgacc gttagcagca tgaccgagat 60

gtaccgctat cgttagatca gttggactcg atgttgctcg ggatcattga t 111

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgagatgtac cgctatcgt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcatgctgct aacggtcgag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catcgagtcc aactgatcta 20

Claims (3)

1.丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的探针在制备丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒中的应用。

3.权利要求1所述的探针与Macroaary结合在制备丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系高通量检测试剂盒中的应用。