CN106048010A - 基于rpa技术检测向日葵茎溃疡病菌的方法、rpa引物及试剂盒 - Google Patents

基于rpa技术检测向日葵茎溃疡病菌的方法、rpa引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的引物对在检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌，或制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品中的应用；以及基于RPA技术的检测向日葵茎溃疡病菌的方法。经实验证明，本发明的RPA引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广，且基于该引物建立的向日葵茎溃疡病菌的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检疫具有指导意义。

Description

基于RPA技术检测向日葵茎溃疡病菌的方法、RPA引物及试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测向日葵茎溃疡病菌的方法、引物及试剂盒。
背景技术
向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi)即向日葵拟茎点霉褐色茎腐病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola-Cvetkovic et al.)，在真菌系统中分类地位：无性态属于半知菌亚门(Deuteromycotina)腔孢纲(Coelomyceres)球壳孢目(Sphaeropsidales)拟茎点霉属(Phomopsis)；有性态属于子囊菌亚门(Ascomyxotin-a)核菌纲(Pyrenomycetes)球科目(Sphaeroaes)间座壳科(Diaporthaceae)间座科属(Disporthe)。是向日葵上一种毁灭性真菌病害，主要危害向日葵茎、叶、荚和种子，可造成茎部溃疡，植株枯萎，茎秆弱，易倒伏。病株花盘小，种子轻。该病菌已列入我国进境植物检疫性有害生物。近年来，我国从向日葵茎溃疡病疫区国家进口向日葵种子的数量逐年增加，专家分析认为，该病菌传入我国的风险极大。
1975年美国最先报道了向日葵茎溃疡病的危害性，1981-1986年匈牙利、罗马尼亚、法国相继报道了该病的发生情况。近几年来，意大利、保加利亚，原捷克斯洛伐克，美国，加拿大和阿根廷等国都报道过该病的大发生。原苏联于1985年，在乌克兰外喀尔巴阡州乌日哥罗德区在向日葵杂交种索耳道尔上首次发现此病，1988-1989年在摩尔达瓦大部分地区，乌克兰的外喀尔巴阡州，敖德萨州和基洛夫格勒州也发现了该病，此病在大多数向日葵种植国家流行，给向日葵生产造成极大危害。
国内外对此病菌的研究较少，2001年，Veronique等人用AFLP分析了该病菌的系统发育；2004年，Mariarosaria等人用PCR，RFLP和Southern杂交技术，检验了该菌的遗传生物型和流行病学差异之间的关系；2007年，Mara等人研究了该病菌的病原形态、生物学特性及品种抗病性。
RPA(Recombinase polymerase amplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮组下使模板DNA解链，引物于模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA技术的检测向日葵茎溃疡病菌的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广的RPA引物和含有该RPA引物的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
本发明第一方面提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供了所述的引物对在检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌，或制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品中的应用；
在一优选例中，所述检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌包括：检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，以及检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
在一优选例中，所述制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品包括：制备检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌的产品，以及制备检测或辅助检测待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌的产品。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物对。
在一优选例中，还包括RPA恒温扩增试剂；
在一优选例中，所述RPA恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits所包含的试剂。
在一优选例中，还包括植物基因组DNA提取试剂；
在一优选例中，植物基因组DNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。
本发明第四方面提供了一种试剂盒在检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌，或制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品中的应用；
在一优选例中，所述检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌包括：检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，以及检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
在一优选例中，所述制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品包括：制备检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌的产品，以及制备检测或辅助检测待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌的产品。
本发明第五方面提供了一种检测或辅助向日葵茎溃疡病菌的方法，包括使用所述的引物对或所述试剂盒的步骤。
在一优选例中，所述检测或辅助向日葵茎溃疡病菌包括：检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌；以及检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌。
在一优选例中，所述的方法包括如下步骤：
1)RPA扩增
以待测植株或待测病原菌含有的DNA为模板与所述的引物对或所述试剂盒进行RPA扩增，
2)根据RPA扩增的结果判断待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
在一优选例中，所述RPA扩增的结果判断的标准为：
若所述RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为234bp的片段，则所述待测植株感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
若所述RPA扩增产物不含有大小为234bp的片段，则所述待测植株未感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌不为或候选不为向日葵茎溃疡病菌。
在一优选例中，在步骤1)之前还包括在待测植株或待测病原菌中提取DNA的步骤。
在一优选例中，所述在待测植株或待测病原菌中提取DNA是采用购买于天根生物科技有限公司且货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒进行。
在一优选例中，所述RPA扩增的反应体系如下：
含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管
再水化缓冲液 29.5μL
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/L
模板DNA 50ng，
醋酸镁溶液 2.5μL，浓度为280mmol/L
去离子水 12.5μL
在一优选例中，所述RPA扩增的反应条件如下：所述RPA扩增的温度为37℃，时间为40min。
本发明提到的待测植株，可为植物的根﹑茎﹑叶等部分的成长的植物体；而待测病原菌则是一种纯菌种或至少二种以上的菌种的混合。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明针对向日葵茎溃疡病菌设计特异性RPA引物，建立了向日葵茎溃疡病菌RPA检测方法，可对向日葵茎溃疡病菌进行定性检测。
(2)本发明针对向日葵茎溃疡病菌仅设计了一对引物即可完成扩增，省去了复杂的引物设计过程；本发明的引物扩增只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需40min，检测时间短；不像LAMP产物的弥散带，RPA扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带，其结果易于判断。
(3)本发明的RPA扩增引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。
(4)本发明建立的向日葵茎溃疡病菌RPA检测方法，灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检验检疫具有指导意义。
附图说明
图1是基于RPA引物的向日葵茎溃疡病菌的RPA检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有三条泳道：其中M为marker DL2000，1为向日葵茎溃疡病菌的RPA扩增产物，2为阴性对照。
图2是采用本发明的RPA引物对多种向日葵病菌进行RPA检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有十条泳道：其中M为marker DL2000，1为向日葵茎溃疡病菌的RPA扩增产物，2为向日葵黑茎病菌的RPA扩增产物，3为向日葵白锈病菌的RPA扩增产物，4为向日葵黑白轮枝菌的RPA扩增产物，5为向日葵大丽轮枝菌的RPA扩增产物，6为向日葵霜霉病菌的RPA扩增产物，7为向日葵菌核病菌的RPA扩增产物，8为向日葵褐斑病菌的RPA扩增产物，9为向日葵锈病菌的RPA扩增产物，10为阴性对照。
图3是采用本发明的RPA引物对梯度稀释的向日葵茎溃疡病菌进行RPA检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有七条泳道：其中M为marker DL2000，1-6分别为稀释度依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5向日葵茎溃疡病菌DNA的RPA扩增产物。
图4是采用PCR引物对梯度稀释的向日葵茎溃疡病菌进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有七条泳道：其中M为marker DL2000，1-6分别为稀释度依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的向日葵茎溃疡病菌DNA的PCR扩增产物。
具体实施方式：
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种RPA引物及其应用。
RPA引物的筛选方法为：针对向日葵茎溃疡病菌的cal基因(Genbank登录号KC343357.1)的保守序列，设计检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的RPA引物，设计了多条RPA引物后进行了大量筛选，综合其特异性、灵敏度和所使用的各引物与RPA扩增试剂盒的适配性，最终筛选出特异性好、灵敏度高且适用范围广的一对RPA引物。
此RPA引物具体序列如下：
上游引物DH-Rf：5′-GTACCCCGAGCGACCGATCATTAAATCTATCA CG-3′(SEQ ID NO：1)；
下游引物DH-Rr：5′-CACCGCCCGATATGCAGTGTACGAGAATCTAA ACG-3′(SEQ ID NO：2)。
上述RPA引物由上海生工生物技术有限公司合成。
利用上述RPA引物针对向日葵茎溃疡病菌的cal基因进行RPA扩增，得到的RPA扩增产物大小为234bp。
上述RPA引物可应用于检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌上，例如检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，或检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；还可以用来制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品，例如制备检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌的产品，或制备检测或辅助检测待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌的产品。
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
(1)上游引物DH-Rf和下游引物DH-Rr(来自实施例1)；
(2)含冻干酶粉管；
(3)再水化缓冲液；
(4)醋酸镁溶液。
上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)均来源于RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits(Twist DX公司，产品目录号为TABAS03KIT)。
进一步优选包括植物基因组DNA提取试剂盒(购自天根生物科技有限公司，货号为DP305-02)
实验证明，上述植物基因组DNA提取试剂盒与RPA扩增试剂盒TwistA mp Basickits、上游引物DH-Rf和下游引物DH-Rr的联合使用，效果更加优越，具体表现在特异性强，灵敏度与普通PCR相当，而且不需要昂贵的热循环仪器，恒温反应即可，反应时间仅需30分钟，结果容易判断。
上述试剂盒可应用于检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌上，例如检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，或检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；还可以用来制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品，例如制备检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌的产品，或制备检测或辅助检测待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌的产品。
实施例3
本实施例提供了一种检测或辅助向日葵茎溃疡病菌的方法，例如检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，或检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌，该方法使用了实施例1的RPA引物和实施例2的试剂盒。
上述方法包括如下步骤：
(1)RPA扩增
以待测植株或待测病原菌的DNA为模板，采用DH-Rf和DH-Rr引物进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，同时设置空白对照(模板为超纯水)。
RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、去离子水12.5μL、上、下游引物(实施例1的DH-Rf和DH-Rr)各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，模板DNA 50ng，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。
RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。
(2)RPA扩增产物的电泳检测
RPA反应结束后，向上述RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA扩增产物进行测序。
所述RPA扩增的结果判断的标准为：
若所述RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为234bp的片段，则所述待测植株感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
若所述RPA扩增产物不含有大小为234bp的片段，则所述待测植株未感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌不为或候选不为向日葵茎溃疡病菌。
如果待测植株或待测病原菌还未提取DNA，上述方法步骤(1)RPA扩增之前还可以包括使用植物基因组DNA提取试剂盒(购自天根生物科技有限公司，货号为DP305-02)按照试剂盒说明书对待测植株或待测病原菌中的DNA进行提取的步骤。
实施例4
本实施例对实施例3建立的检测或辅助向日葵茎溃疡病菌的方法进行了有效性验证。
步骤一：基因组DNA的提取
将向日葵茎溃疡病菌(保存于中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局)经5-7天纯培养后，挑取菌丝冷冻干燥后，用液氮充分研磨，然后采用植物基因组DNA提取试剂盒(购自天根生物科技有限公司，货号为DP305-02)提取基因组DNA，提取方法按照试剂盒说明书进行。
步骤二：RPA扩增
以步骤一获得的基因组DNA为模板，采用实施例1的DH-Rf和DH-Rr引物进行RPA扩增，同时设置空白对照(DNA模板为超纯水)。
RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，去离子水12.5μL，上、下游引物(实施例1的DH-Rf和DH-Rr)各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，模板DNA 50ng，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。
RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。
步骤三：RPA扩增产物的电泳检测
RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取上清液5μL于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA扩增产物进行测序
结果如图1所示：向日葵茎溃疡病菌的RPA扩增产物含有1个条带，大小为234bp，而阴性对照无条带，说明本发明的基于RPA引物及RPA试剂盒建立的检测或辅助向日葵茎溃疡病菌的方法可以有效检测向日葵茎溃疡病菌。
实施例5
本实施例对实施例1的RPA引物进行了特异性验证，所用的供试材料如下：向日葵茎溃疡病菌、向日葵黑茎病菌、向日葵白锈病菌、向日葵黑白轮枝菌、向日葵大丽轮枝菌、向日葵霜霉病菌、向日葵菌核病菌、向日葵褐斑病菌、向日葵锈病菌共9种菌株，编号依次为1，2，3，…，8，9，均保存于中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局。
表2、供试菌株
序号 病原菌 拉丁名 寄主
1 向日葵茎溃疡病菌 Diaporthe helianthi Helianthus annuus
2 向日葵黑茎病菌 Plenodomus lindquistii Helianthus annuus
3 向日葵白锈病菌 Albugo tragopogonis Helianthus annuus
4 向日葵黑白轮枝菌 Verticillium albo-atrum Helianthus annuus
5 向日葵大丽轮枝菌 Verticillium dahliae Helianthus annuus
6 向日葵霜霉病菌 Plasmopara halstedii Helianthus annuus
7 向日葵菌核病菌 Sclerotinia Sclerotiorum Helianthus annuus
8 向日葵褐斑病菌 Septoria helianthi Helianthus annuus
9 向日葵锈病菌 Puccina helianthi Helianthus annuus
特异性验证方法如下：
对不可培养的菌株(表2中编号为3、6、9)可直接采集感病植株，液氮充分研磨；对可培养的菌株(表2中编号为1、2、4、5、7、8)经5-7天纯培养后，挑取菌丝冷冻干燥后，用液氮充分研磨，然后采用植物基因组DNA提取试剂盒(购自天根生物科技有限公司，货号为DP305-02)参照试剂盒说明书操作提取研磨处理后的感病植株(表2中编号为3、6、9)或纯菌株(表2中编号为1、2、4、5、7、8)的基因组DNA。
以提取的基因组DNA为模板，进行RPA扩增和RPA扩增产物的电泳检测，RPA扩增和RPA扩增产物的电泳检测的方法同实施例4的步骤二和步骤三。
结果分析：
结果如图2所示，从图中可以看出：仅有向日葵茎溃疡病菌的RPA扩增产物含有1个大小为234bp的条带，其它8种参照菌株均无条带，由此证明本发明实施例1的RPA引物具有高特异性；进一步的，本发明基于RPA引物及RPA试剂盒建立的检测或辅助向日葵茎溃疡病菌的方法能够准确的对向日葵茎溃疡病菌进行检测。
实施例6
本实施例对实施例1的RPA引物进行了灵敏度的验证，其方法如下：
步骤一：DNA的提取
参照实施例5的方法对向日葵茎溃疡病菌(保存于中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局)提取基因组DNA，并将提取的基因组DNA进行梯度稀释，分别得到稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5(对应浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL和0.001ng/μL)的向日葵茎溃疡病菌的DNA。
步骤二：扩增
(1)RPA扩增
分别以上述步骤一得到的稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的向日葵茎溃疡病菌的DNA为模板，模板量均取1μL，进行RPA扩增和RPA扩增产物的电泳检测，RPA扩增和RPA扩增产物的电泳检测的方法同实施例4的步骤二和步骤三。
(2)PCR扩增
分别以上述步骤一得到的稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的向日葵茎溃疡病菌的DNA为模板，模板量均取1μL，采用引物PHDF1和PHDF2进行PCR扩增，得到预期326bp的扩增产物。
引物序列如下：
PHDF1：5′-TCGCCGCTGGATTTCA-3′；
PHDF2：5′-CCTGGGAACAGGGAGCAGC-3′。
PCR扩增的体系和反应条件参考文献“应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究，新疆农业科学，2102,49(3)：470-476”中的方法。
步骤三：电泳检测
(1)RPA扩增反应结束后，分别向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。RPA电泳结果如图3所示。
(2)PCR扩增反应结束后，取5μL的PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。PCR电泳结果如图4所示。
从图3和图4中可以看出，本发明的RPA方法与普通PCR的灵敏度相当，均为10-3稀释度。

Claims (10)

1.一种引物对，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的引物对在检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌，或制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品中的应用；
任选的，所述检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌包括：检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，以及检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
任选的，所述制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品包括：制备检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌的产品，以及制备检测或辅助检测待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌的产品。
3.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括RPA恒温扩增试剂；
任选的，所述RPA恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasic kits所包含的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括植物基因组DNA提取试剂；
任选的，植物基因组DNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。
6.权利要求3至5任一项所述的试剂盒在检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌，或制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品中的应用；
任选的，所述检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌包括：检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，以及检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
任选的，所述制备检测或辅助检测向日葵茎溃疡病菌的产品包括：制备检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌的产品，以及制备检测或辅助检测待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌的产品。
7.一种检测或辅助向日葵茎溃疡病菌的方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述的引物对或权利要求3-5中任一项所述试剂盒的步骤。
任选的，所述检测或辅助向日葵茎溃疡病菌包括：检测或辅助检测待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌；以及检测或辅助检测待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)RPA扩增
以待测植株或待测病原菌含有的DNA为模板与权利要求1所述的引物对或权利要求3-4中任一项所述试剂盒进行RPA扩增，
2)根据RPA扩增的结果判断待测植株是否感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌是否为或候选为向日葵茎溃疡病菌；
任选的，所述RPA扩增的结果判断的标准为：
若所述RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为234bp的片段，则所述待测植株感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌为或候选为向日葵茎溃疡病菌；若所述RPA扩增产物不含有大小为234bp的片段，则所述待测植株未感染向日葵茎溃疡病菌，或待测病原菌不为或候选不为向日葵茎溃疡病菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在步骤1)之前还包括在待测植株或待测病原菌中提取DNA的步骤；
任选的，所述在待测植株或待测病原菌中提取DNA是采用购买于天根生物科技有限公司且货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述RPA扩增的反应体系如下：
任选的，所述RPA扩增的反应条件如下：所述RPA扩增的温度为37℃，时间为40min。
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