CN104017881B - 检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对 - Google Patents

检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对。本发明所提供的用于检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对，具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。实验证明，利用该引物对通过PCR的方法可检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C，且该方法准确率高、特异性强、灵敏度高。

Description

检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对。
背景技术
杂草是农作物生产的大害，自1942年出现近代杂草防治技术以来，化学除草剂有了很大的发展。草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。
但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入玉米，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护玉米免受药害，最终达到增产增收的目的。尽管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被发现，并在宿主荧光假单胞菌G2及大肠杆菌中都能高效表达，表现高耐草甘膦的特性(YichenSun,MinLinandYipingWang.NovelAroAwithhightolerancetoGlyposate,encodedbyageneofPseudomonasputida4G-1isolatedfromanextremelypollutedenvironmentinChina.Apliedandenvironmentalmicrobiology.2005,71(8):4771-4776)，但其在植物，特别是重要的粮食作物中由于表达量较低而没有被利用，因此急需对其在植物中的应用进行研究，如进行密码子优化，以加速其应用到农业生产中。
本发明的发明人所在团队在前期工作中，将耐草甘膦基因G2-aroA经过密码子优化后转入玉米中，获得转基因玉米，并经实验证实与密码子优化前相比，密码子优化后的转基因玉米整体表现出G2-aroA蛋白的表达量明显提高，且对草甘膦的耐受性也明显提高(中国专利，申请号201210107071.2，授权公告号CN102676553B)。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对。
在本发明中，所述转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C具体为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCCNo.9154的玉米株系。
本发明所提供的用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对，具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。
在本发明中，所述引物对中两个单链DNA分子既可以单独包装，也可以等摩尔混合包装。
其中，所述序列1由26个核苷酸组成；序列2由26个核苷酸组成。
所述引物对在制备用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明再一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒。
本发明所提供的用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒，具体可包含有如上所述的引物对。
所述试剂盒还可含有由序列表中序列4和序列5所示的两条单链DNA分子组成的内参引物对(针对玉米中内参基因ADH设计的引物对)。
所述试剂盒中还可含有PCR反应所需的常规试剂，如DNA聚合酶、dNTP等。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法，为如下(a1)或(a2)：
(a1)包括如下步骤：将所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装；
(a2)包括如下步骤：将所述引物对的两条单链DNA分子，以及所述内参引物对的两条单链DNA分子分别单独包装。
所述引物对，或所述试剂盒，在检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的方法。
本发明所提供的检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的方法，具体可包括如下步骤：
(1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
(2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C：若所述PCR产物中含有大小为256bp的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C；若所述PCR产物中不含有大小为256bp的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C。
进一步，所述大小为256bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示DNA片段。
在所述方法中，以所述引物对进行PCR扩增的退火温度具体可为62℃。
更加具体的，以所述引物对组中的所述引物对进行PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃40s，62℃30s，72℃40s，35-40个循环；72℃10min。
另外，以所述引物对进行PCR扩增时，所述引物对中上下游引物为等摩尔使用(如上下游引物用量均为250nm)。
更加具体的，以所述引物对进行PCR扩增的反应体系为：2×EasyTaqPCRSuperMix10μl，上下游引物各0.5μl(用量均为250nm)，模板DNA1μl(100ng)，ddH2O8μl。
本发明的还一个目的是提供转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C外源插入片段的侧翼序列。
本发明所提供的转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C外源插入片段的侧翼序列，具体为5’侧翼序列；所述5’侧翼序列的核苷酸序列具体为序列表中序列3。
本发明根据转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的侧翼序列设计得到由序列表中序列1和序列2所示的引物对。实验证明，利用该引物对通过PCR的方法可检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C，且该方法准确率高、特异性强、灵敏度高。
附图说明
图1为检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒的特异性检测结果。其中，M为DNA分子量标准D2000marker；4、5、6、9、10、13、14、16：转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823CCGMCCNo.9154；1、2、3、7、8、11、12、15、17：实施例1获得的9个其他转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米株系(非G1105E-823C株系)；WT：转化受体玉米品种综31。
图2为检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒的灵敏度检测结果。其中，M为DNA分子量标准D2000marker；1-5：浓度分别为50000、5000、500、50、5个拷贝的基因组DNA；CK-：以水代替模板DNA的阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的获得及性状鉴定
一、转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的获得
按照本发明的发明人所在团队前期申请的中国专利(申请号201210107071.2，授权公告号CN102676553B)的实施例2(公告文本的第36段至第88段)进行操作，获得若干个转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米株系，将其中一个株系记为G1105E-823C。
二、转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的性状鉴定
对步骤一获得的若干个转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米株系进行草甘膦抗性鉴定。具体操作如下：
1、试验设计：5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35cm。
2、试验处理：按照约6倍推荐使用草甘膦浓度——1200ml/亩的用量喷施农达(Roundup，含41％的草甘膦，田间推荐使用剂量为150-250ml/亩)。
3、试验处理时期：5-6叶期。7天后开始观察实验结果。每个株系观察至少20株。
结果显示，转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C生长正常，而其他株系有不同草甘膦危害。
本发明的发明人进一步将G1105E-823C株系于大田种植，对除草甘膦抗性外的其他农艺性状进行考察，结果发现G1105E-823C株系在其他农艺性状上，如生育期、株高、产量、籽粒的营养成分等，均与转基因受体——玉米品种综31基本一致，无统计学差异。
综上，可见G1105E-823C株系不仅表现出了极强的草甘膦抗性，而且也很好的保持了受体亲本的优良农艺性状。本发明的发明人将该G1105E-823C株系于2014年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，参椐的生物材料(株)为G1105E-823C，科学描述为转G2-aroA基因耐除草剂玉米，其保藏编号为CGMCCNo.9154。
实施例2、检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒的制备
一、转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的侧翼序列的克隆
采用Genomewalking的方法分离得到了转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C中外源插入基因的5'端侧翼序列。具体参照Genomewalking试剂盒(TaKaRaCode：D316)说明书进行操作。
所得到的5'端侧翼序列，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。该5'端侧翼序列由玉米基因组序列片段和转化载体上T-DNARB序列片段两部分组成。具体的，序列3的第1-212位为玉米基因组序列片段，第213-256位为转化载体上T-DNARB序列片段。
二、检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒的制备
根据步骤一获得的转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的5'端侧翼序列，设计筛选特异性的引物对，用于制备试剂盒。
试剂盒由如下特异引物对、内参引物对，以及PCR所需常规试剂组成。
1、特异引物对
针对5'端侧翼序列(序列3)设计的引物对：
S1：5'-ATTAGTAGGGACCAGGGAGAACACCA-3'(序列1，为序列3的第1-26位)；
Sp4：5'-CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3'(序列2，为序列3的第231-256位的反向互补序列)。
理论上，采用该特异引物对对转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的基因组DNA进行PCR扩增会得到大小为256bp的目的条带，即得到序列3所示DNA片段。
2、内参引物对
针对玉米中的内参基因ADH(alcoholdehydrogenase)设计的内参引物对：
ADH-F：5'-TCTTGCCGTAAGTGTTGAAAC-3'(序列4)；
ADH-R：5'-TGGGACAGATGGATGAGCTAC-3'(序列5)。
理论上，采用该内参引物对各种玉米品种进行PCR扩增，均会得到大小约为400bp的目的条带。
实施例3、检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒的特异性检测
供试样本：转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823CCGMCCNo.9154、实施例1获得的9个其他转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米株系，以及转化受体玉米品种综31。
用实施例2得到的特异性引物对以及内参引物对分别对各供试样本进行检测，以验证特异引物对的特异性。每个样品采用相同的检测方法，包具体如下：
分别从各供试样本中提取基因组DNA，作为模板，采用实施例2得到的特异性引物对以及内参引物对分别进行PCR扩增。两个个引物对所采用的反应体系和反应程序一致。
反应体系(20μl)：2×EasyTaqPCRSuperMix10μl，上下游引物各0.5μl(用量均为250nm)，模板DNA1μl(100ng)，ddH2O8μl。其中，2×EasyTaqPCRSuperMix为北京全式金生物技术有限公司产品，其产品目录号为AS111-13。
反应程序：94℃5min；94℃40s，62℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min。
反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
实验同时设置以水代替模板DNA的阴性对照。
结果如图1所示，所有的供试样品采用内参引物对均扩增出了大小约为400bp的内参基因ADH的目的片段，而采用特异性引物对进行PCR扩增，只有转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823CCGMCCNo.9154扩增得到了大小为256bp的目的条带，而其他的9个转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米株系，以及转化受体玉米品种综31均未得到目的条带。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为256bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明256bp的目的条带确实如序列表中序列3所示。以上结果表明实施例2得到的特异引物对具有较强的特异性。
实施例4、检测转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒的灵敏度检测
提取转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823CCGMCCNo.9154的基因组DNA，然后进行10倍倍比稀释，得到每μl样品中基因组DNA的拷贝数分别为25000、2500、250、25、2.5的系列样品，作为灵敏度检测的模板使用。
分别以如上系列拷贝数的基因组DNA样品作为模板，采用实施例2得到的特异性引物对分别进行PCR扩增。
反应体系(20μl)：2×EasyTaqPCRSuperMix10μl，上下游引物各0.5μl(用量均为250nm)，模板DNA2μl，ddH2O7μl。其中，2×EasyTaqPCRSuperMix为北京全式金生物技术有限公司产品，其产品目录号为AS111-13。
反应程序：94℃5min；94℃40s，62℃30s，72℃40s，40个循环；72℃10min。
实验同时设置以水代替模板DNA的阴性对照。
结果如图2所示，5个拷贝数的基因组DNA样品即可扩增出大小为256bp的目的条带。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为256bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明256bp的目的条带确实如序列表中序列3所示。以上结果表明实施例2得到的特异引物对具有较强的灵敏度。

Claims (11)

1.用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的引物对，由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。
2.权利要求1所述的引物对在制备用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒中的应用。
3.用于检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的试剂盒，包含有权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有由序列表中序列4和序列5所示的两条单链DNA分子组成的内参引物对。
5.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装。
6.权利要求4所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的引物对的两条单链DNA分子，以及所述内参引物对的两条单链DNA分子分别单独包装。
7.权利要求1所述引物对或权利要求3或4所述试剂盒在检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C中的应用。
8.检测或辅助检测待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C的方法，包括如下步骤：
(1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
(2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测玉米是否为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C：若所述PCR产物中含有大小为256bp的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C；若所述PCR产物中不含有大小为256bp的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述大小为256bp的DNA片段为序列表中序列3所示DNA片段。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：以权利要求1所述引物对进行PCR扩增的退火温度为62℃。
11.转G2-aroA基因耐除草剂玉米G1105E-823C外源插入片段的侧翼序列，为5’侧翼序列，其特征在于：所述5’侧翼序列的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
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