CN105647920A - 基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel分子标记 - Google Patents
基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel分子标记 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3的InDel标记,该分子标记的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明还涉及一种扩增基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel标记的引物对,该引物对序列如下:正向引物序列:5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’;反向引物序列:5’-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。本发明的分子标记完全基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3。本发明开发出基于黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel标记,该标记完全基于抗性基因Ty-3,与Ty-3基因完全连锁,为共显性分子标记。将该标记用于黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的分子标记辅助选择,可大幅提高选择的准确性,缩短育种年限,从而加速育种进程。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术工程领域,特别涉及一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel分子标记及扩增该分子标记的引物、利用分子标记的检测方法及其应用。
背景技术
番茄(SolanumlycopersicumL.)属于茄科(Solanaceae),为一年生草本茄科植物。番茄起源于南美西部地区,是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物之一,深受广大消费者的喜爱。随着番茄栽培面积的逐年扩大,栽培方式的多样化,番茄病虫害问题日趋严重,近年来,番茄黄化曲叶病毒病在世界各地保护地番茄种植上普遍发生,给番茄生产带来巨大经济损失。因此培育抗黄化曲叶病毒新品种对番茄的生产意义重大。
番茄抗TYLCV植株材料先后在Solanumpimpinellifolium、Solanumperuvianum、Solanumchilense、Solanumhabrochaite、Solanumcheesmaniae等野生材料中发现。抗源材料不同,其抗性遗传规律也不同。目前已发现的抗性基因主要有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4、Ty-5,其中Ty-1、Ty-2、Ty-3作为番茄抗TYLCV的主效抗性基因在生产中得以应用(Liedl,etal.,2013)。国内番茄抗黄化曲叶病毒病育种起步较晚,与国外先进国家有较大的差距。由于番茄黄化曲叶病毒变异较大,这使番茄抗番茄黄化曲叶病常规育种进展很慢。
与传统的遗传育种相比,分子标记有很多优点,尤其是以PCR为基础的DNA分子标记技术大大加快了育种的进程和效率。目前,已有诸如REX-1(deCastroetal.,2007)、TG0302(Garciaetal.,2007)、P6-25(Jiveark.,2008)和UF_TY3-P23(Verlaan,etal.,2013)等多个与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因紧密的连锁标记被陆续开发出来,并逐步在育种实践中加以应用。但这些标记均与抗病基因间存在一定的遗传距离,故筛选时会出现一定比例的假阳性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3的InDel标记。
本发明的另一目的在于提供该分子标记在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测以及标记辅助育种中的应用。
为了实现本发明目的,本发明提供了一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3的InDel标记,该分子标记的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
本发明还提供了一种扩增基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel标记的引物对,该引物对序列如下:
正向引物序列:5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’;
反向引物序列:5’-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。
本发明还提供了一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel标记的检测方法,该方法以抗感番茄黄化卷叶病毒的番茄基因组DNA为模板经PCR扩增,得到能同时鉴定父本、母本及其杂合体基因型的特异谱带,该特异谱带为携带抗性基因的植株谱带和不携带抗性基因的植株谱带,所述携带抗性基因Ty-3的植株谱带为核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的分子标记。
所述不携带抗性基因Ty-3的植株谱带的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
上述方法中,PCR反应体系(20μL)为:包括正、反向引物各0.8μM,1.2mMdNTPs,2.5mMMgCl2,2μL10×buffer,0.5unitsTaq聚合酶,DNA模板30-50ng,ddH2O补至20μL。
上述方法中,PCR扩增的程序均为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火45s,72℃延伸45s,35个循环;72℃延伸10min;保存温度4℃。
本发明还提供了上述分子标记和检测方法在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测或标记辅助育种中的应用。
有益效果:
1)本发明的分子标记完全基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3。该标记引物的特异性强、稳定性高,并且标记的筛选方法操作简便快捷,对检测设备和引物模板质量要求不高,具有试验试剂用量少,速度快,成本低,适合大批次、高通量、自动化的优点。非常适合现代农业分子育种的实现。
2)本发明的番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3特异分子标记引物应用于育种工作中,将大大降低番茄黄化曲叶病毒病流行对番茄生产造成的经济损失,同时减少农药使用量,有益于降低生产成本,具有很大的应用潜力和较高的经济价值。
3)本发明开发出基于黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel标记,该标记完全基于抗性基因Ty-3,与Ty-3基因完全连锁,为共显性分子标记。将该标记用于黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的分子标记辅助选择,可大幅提高选择的准确性,缩短育种年限,从而加速育种进程。
附图说明
本发明有如下附图:
图1为InDel标记(Ty-3-InDel)在感病材料和抗病材料中的部分DNA序列
(P2与P1间存在250bp的缺失);
图2为InDel标记Ty-3-InDel在亲本间及F1中的PCR产物检测结果(1:100bpladder;2-3:感病亲本P2;4-5:抗病亲本P1;6-7:F1单株);
图3为InDel标记Ty-3-InDel在F2群体中的检测
(M:D2000;1-48:F2代单株);
图4为InDel标记Ty-3-InDel在回交群体中的应用
(M:D2000;1-48:BC1代单株)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的保护范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1基于Ty-3基因的InDel标记的开发及验证
1.供试材料
本试验所用的抗病自交系P1和感病自交系P2经已知分子标记P6-25检测证实,P1为抗病纯合体(Ty-3/Ty-3),而P2为感病纯合体(ty-3/ty-3)。P1为母本,P2为父本配制杂交组合,得到F1后,再自交得到F2分离群体。
2.接种鉴定
抗性鉴定采用烟粉虱接种鉴定法,具体参照杨晓慧(2012)的方法。于幼苗2-3片真叶期,将其放置于放有带毒烟粉虱的生长室内,两周后杀死带毒的烟粉虱,之后将苗子移栽到日光温室或大田中,观察病情结果。
3.InDel分子标记的开发及验证
A、InDel标记的开发
Verlaan等(2013)报道Ty-3基因即为Solyc06g051190。登陆SGN(SolGenomicsNetwork)网站(http://solgenomics.net/),获得Solyc06g051190序列,利用在线引物设计软件Primer3plus,分段设计引物(表1)。本试验中所用到的番茄材料P1和P2的基因组DNA从2-3周幼苗的叶片中用CTAB法提取(Fultonetal.,1995)。根据设计的引物,对样品P2和P1的DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系:扩增反应的总体积为50μL,5.0μL模板DNA,5.0μL10×PCRBuffer(含Mg2+),4.0μLHighPuredNTPs(2.5mM),10μM的上下游引物各1.0μL,0.3μLEasyTaqDNAPolymerase(5U·μl-1),无菌纯水33.7μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min;保存温度4℃。取PCR扩增产物约10μL,在1%琼脂糖凝胶电泳上检测PCR扩增结果,Bio-RAD自动凝胶成像系统观察照相,记录电泳结果。琼脂糖凝胶电泳检测成功后,PCR产物使用胶回收试剂盒(ZymocleanTMGelDNARecoveryKit)回收并进行TA克隆测序。
对P1和P2两份材料PCR产物测序并进行核酸序列分析,发现感病材料P2中出现长度为250bp核酸片段的缺失,针对该段序列缺失,利用在线引物设计软件Primer3plus设计该InDel标记的引物(Ty-3-InDel)序列(图1,表2)。Ty-3-InDel在理论上感病材料中可扩增出260bp特异性片段,而抗病材料可扩增出510bp特异性片段。
表1以基因Solyc06g051190为模板设计的引物
表2基于Ty-3的InDel标记的引物
B、InDel标记的扩增及检测
本试验中所用到的番茄材料P1、P2及其F1的基因组DNA从2-3周幼苗的叶片中用CTAB法提取(Fultonetal.,1995)。InDel标记的PCR反应体系(20μL):DNA模板(40ng﹒μL-1)5.0μL,10×PCRBuffer(含Mg2+)2.0μL,HighPuredNTPs(2.5mM)2.0μL,上下游引物(10μM)各1.0μL,EasyTaqDNAPolymerase(5U·μl-1)0.3μL,ddH2O8.7μL。PCR反应程序:94℃预变5min;94℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸45s,35个循环;72℃延伸10min;保存温度4℃。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行分离鉴定,然后在凝胶成像仪上观察照相,并记录电泳结果。
InDel标记引物(Ty-3-InDel)在抗病亲本P1、感病亲本P2进行PCR扩增,证实其在双亲间能够扩增出多态性(在P1中扩增出510bp的特异条带,在P2中扩增出260bp的特异条带,在F1中同时扩增出510bp和260bp两条特异条带),该标记可靠性高、稳定性最好、且不需要酶切。该引物的扩增结果如图2所示,具体引物序列如下:
SeqIDNo.3:5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’;
SeqIDNo.4:5-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。
回收上述引物在P1和P2中扩增的谱带并测序,在抗病材料P1中的核酸序列如SEQIDNo.1所示,在感病材料P2中的核酸序列如SEQIDNo.2所示。
利用上述InDel标记引物(Ty-3-InDel)在抗性亲本P1和感病亲本P2构建的F2群体中进行进一步检测,结果显示(图3)在48个单株中,标记Ty-3-InDel处基因型为纯合阳性(只有510bp的特异谱带)的单株8株,编号分别是7、17、21、28、30、34、36和40号单株;该标记处基因型为杂合阳性(同时存在510bp和260bp的特异谱带)的单株26株,编号分别为1、3、4、6、8、9、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、25、26、31、32、38、39、41、44、46和47号单株;该标记处基因型为纯合阴性(只有260bp的特异谱带)的单株14株,编号分别为2、5、10、15、24、27、29、33、35、37、42、43、45和48号单株;检测为阳性的单株,接种鉴定结果均为抗病,检测为阴性的单株,接种鉴定结果均为感病。
实施例2利用InDel标记引物对Ty-3基因进行分子标记辅助选择
利用实施例1中所开发的基于Ty-3的InDel标记引物(Ty-3-InDel)对课题组准备转育Ty-3基因的BC1代群体材料48株(高可溶性固形物的感病亲本P31为母本,含Ty-3基因的自交系P55为父本,其F1代与P31进行回交获得BC1)进行分子标记辅助选择。结果表明(图4):在48个单株中,标记Ty-3-InDel检测到基因型为杂合阳性(同时存在510bp和260bp的特异谱带)单株19株,编号分别是1、2、3、5、9、13、14、16、18、21、29、30、33、37、39、40、42、43和47号单株;标记Ty-3-InDel检测到基因型为阴性(仅存在260bp的特异谱带)单株29株,编号分别是4、6、7、8、10、11、12、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、31、32、34、35、36、38、41、44、45、46和48号单株;检测为阳性的单株,接种鉴定结果均为抗病,检测为阴性的单株,接种鉴定结果均为感病;选择阳性单株进一步与P31回交、分子标记辅助选择,可提高Ty-3基因的转育效率。也证明了本实验发明的分子标记与抗性基因Ty-3共分离。
上述实施方案为本发明最佳的实施方案,但本发明的实施方案并不受上述实施方案的限制,其他的任何不违背本发明原理的条件下,可以通过改变参数的形式所产生的实施例,都包含于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3的InDel分子标记,该分子标记的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.扩增权利要求1所述的分子标记的引物。
3.如权利要求2所述的引物,该引物序列如下:
正向引物序列:5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’;
反向引物序列:5’-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。
4.使用权利要求1所述分子标记的检测方法,其特征在于,
该方法以抗感番茄黄化曲叶病毒病的番茄基因组DNA为模板经PCR扩增,得到能同时鉴定父本、母本及其杂合体的基因型的特异谱带,该特异谱带为携带抗性基因的植株谱带和不携带抗性基因的植株谱带,所述携带抗性基因的植株谱带为权利要求1所述的分子标记。
5.如权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述PCR反应体系(20μL)如下:包括正、反向引物各0.8μM,1.2mMdNTPs,2.5mMMgCl2,2μl10×buffer,0.5unitsTaq聚合酶,DNA模板30-50ng,ddH2O补至20μL。
6.如权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述PCR扩增的程序均为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火45s,72℃延伸45s,35个循环;72℃延伸10min;保存温度4℃。
7.如权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述不携带抗性基因Ty-3的植株谱带的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
8.权利要求1所述分子标记在番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-3检测或标记辅助育种中的应用。
9.权利要求3所述的引物在番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-3检测或标记辅助育种中的应用。
10.权利要求4-6任意一项所述鉴定方法在番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-3检测或标记辅助育种中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |