CN106119360A - 一种鉴定香蕉枯萎病抗性的scar分子标记及其鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物分子生物学技术领域,具体涉及一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记及其鉴定方法。利用SRAP分子标记技术,筛选出香蕉枯萎病感病品种特有的条带,根据该条带的序列,设计特异性引物,进行特异性扩增,转化成SCAR分子标记。用于鉴定香牙蕉品种的香蕉枯萎病抗感病性,为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术,进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学技术领域,具体涉及一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记及其鉴定方法。
背景技术
香蕉是位于水稻、小麦、玉米之后的世界第四粮食作物,也是仅次于柑桔的第二大宗水果,更是世界水果贸易量最大宗的鲜果。香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害,也是重要的检疫性病害。1967年以来,我国在台湾首次发现香蕉枯萎病4号小种之后,扩散到澳大利亚、非洲和部分亚洲国家,引起国内外普遍关注。在国内广东、广西、福建、海南、云南等主要香蕉产区也陆续发现枯萎病,并成为香蕉产业发展的主要障碍(游春平等,2008,华中农业大学学报,27(3):363-366)。香蕉枯萎病是一种土传病害,通过化学防治和农业防治都不能有效地防控此病。种植香蕉抗枯萎病品种是有效的途径,同时也不会增加栽培成本。因此,香蕉抗枯萎病新品种选育是当前香蕉产业中重要的环节。
目前生产上应用的栽培蕉多数为三倍体(2n=3x=33),具有单性结果,多倍性、高度不育、没有种子等特性,这为香蕉的常规杂交育种带来了极大的困难,抗病育种就更困难了。目前香蕉新品种选育途径主要是田间变异、组织培养变异利用、化学诱变等,但由于变异率较低,其中有用的变异率更低,筛选需要的人力物力大,选育周期长,效率低,这就造成了香蕉品种更新慢,病虫害高发的现状。
随着当今生物技术的迅速发展,包括分子标记辅助育种技术、基因工程育种技术、基因组测序技术等在许多植物育种中得到了广泛的应用,并取得了显著成效。香蕉的生物技术研究起步相对较晚,进展缓慢,在香蕉抗枯萎病分子生物技术方面,也只有少量研究,研究者从不同的香蕉抗枯萎病(4号小种)材料中,获得了多个抗病基因类似物(RGAS),并进行了分析(孟祥春,2007,分子植物育种,S1:57-60;徐金刚,2008,生物技术通报,S1:200-209;陈雅平,2007,植物生理与分子生物学学报,06:567-573)。谢江辉(2008)等公开了两对引物,主要应用于“威廉斯”香蕉的芽变植株的抗病性鉴定。香蕉的枯萎病抗病机理较为复杂,抗病相关的基因很多,目前能够直接有效的用于香蕉育种中分子手段还比较少,因此急需加快香蕉的抗病生物育种技术开发。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的之一在于提供种一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记;
本发明的目的之二是提供了所述SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病的方法;
本发明的目的之三是提供了所述鉴定的范围。
本发明是通过以下技术方案来实现的:
一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记,该标记来源于SRAP分子标记me6-em1扩增的一条829bp的特异条带,其序列序列为:
tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc。
所述鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记,条带长度为324bp,从原特异条带的第216bp至第539bp。
所述SCAR标记可以准确鉴定香牙蕉品种对香蕉枯萎病的抗性。
用所述SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病的方法:
(1)、提取香蕉叶片DNA;
(2)、用SCAR标记的特异引物SC1/SC2进行PCR扩增检测;
(3)、检测:结果表现为324bp特异条带的有无;有特异条带扩增即对香蕉枯萎抗性为感病,未有条带扩增,即对香蕉枯萎抗性为抗病。
其中,所述用SCAR标记的特异引物SC1/SC2序列为:
正向引物SC1:5’-CTCGCCGACACCTTACTTGA-3’
反向引物SC2:5’-AGGAGAGTCCAGCTCCAGTT-3’。
较佳地,所述扩增方法为:
PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环35次;72℃延伸7min。
PCR体系:25μl的反应体积含有10×buffer(含Mg2+)2.5ul,0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul,上下引物(10umol/L)分别1ul,DNA(50ng/L)1ul及1.5U TaqDNA聚合酶。
较佳地,所检测方法为:采用1.2%的琼脂糖凝胶,110v电压电泳25分钟,紫外灯下观察。
本发明利用SRAP分子标记技术,筛选出香蕉枯萎病感病品种特有的条带,根据该条带的序列,设计特异性引物,进行特异性扩增,转化成SCAR分子标记。用于鉴定香牙蕉品种的香蕉枯萎病抗感病性,为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术,进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选。其中,SCAR(sequence characterized amplified regions特定序列扩增)标记通常是由RAPD、SRAP、SSR标记转化而来。一般表现为扩增片断的有无,是一种显性标记,当扩增区域内部发生少数碱基的插入、缺失、重复等变异时,表现为共显性遗传的特点。具有方便、快捷、可靠,可以快速检测大量个体,结果稳定性好,重现性高等优点。
本发明与传统的盆栽接种鉴定、水培接种鉴定、病地种植鉴定相比具有以下优点:可以在香蕉的任何生长期进行鉴定、周期短、操作简单、稳定性,重复性好、鉴定的是香蕉基因的变异,遗传稳定性好、不受环境影响。
附图说明
图1:引物me6-em1对16个香牙蕉样品的PCR扩增。M:2000bp marker:1-8,13号样品(抗病品种):东蕉1号、G6-2、BXM51、农科1号、抗枯1号、南天黄、南天青、粤科1号、科2;9-12,14-16号样品(感病品种):WS2、L1N2、L3-3、G20-5、巴西蕉、G30、NK4-1。
图2:引物SC1-SC2扩增条件优化。M:2000bp marker:1-10号样品分别为:巴西、NK、G30、L3-3、WS2、南天青、东蕉1号、农科一号、粤科1号、抗枯1号。
图3:引物SC1-SC2对抗感病香蕉品种的扩增。M:2000bp marker:1-24号样品分别为:索马里香蕉、天宝矮蕉、威廉斯、龙州中把、粗把香牙蕉、G6-2、粤科1号、农科1号、抗枯5号、漳选8-1、广东2号、东莞高把香蕉、齐尾、红河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、东莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷兰香蕉、北大矮、那龙中把香蕉、南天黄、BXM51、科2。
图4:序列比对结果。
具体的实施方式
通过以下实例进一步对本发明进行了说明与定义而并非限制。通过实例,科研人员可以对本发明有更清楚的了解,可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改,以获得不同的研究效果。下述实例中的实验方法,如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂,使用均参照产品使用说明书使用。
一、香蕉叶片的DNA提取
选取香蕉枯萎病抗性不同的香牙蕉(基因型为AAA)品种(表1),分别进行DNA提取。
DNA提取方法采用改良CTAB法,具体操作如下:
1、香蕉的DNA提取,采用香蕉的叶片,选取没有病虫害的新抽出的嫩叶,用水冲洗干净,晾干后取0.2克,用液氮进行研磨,研磨的过程中加入少量交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),将叶片快速研磨至粉末状。
2、在研磨好的样品中加入800μl的预热好的4*CTAB,混匀,65℃水浴30min,期间轻摇样品3次,12000rpm离心10min。
3、加入600μl氯仿-异戊醇(24:1),混匀,12000rpm离心6min。
4、吸取上清,重复步骤3,进行第二次抽提。
5、吸取上清,加入等体积的异丙醇(-20℃预冷),室温静置5min,12000rpm离心10min。
6、弃上清,用75%预冷的乙醇漂洗2次。
7、真空抽干,加入50μlTE缓冲液,常温溶解,-20℃冰箱保存备用。
通过以上改良CTAB法提取香蕉叶片DNA,采用BioDropμLite(超微量蛋白核酸分析仪)检测其浓度和纯度,DNA浓度可达到80-150ng.μL-1,OD260/OD280=1.8-2.0,质量较好,符合试验要求。
表1香蕉抗感病品种资源表
注:“田间香蕉枯萎病抗性表现”为本单位在田间多年种植后田间观察的结果。
二、香蕉枯萎病感病品种特异条带SRAP标记的扩增
采用SRAP引物me6-em1对16个香蕉品种的扩增,将所得到的扩增产物进行凝胶电泳检,在凝胶成像仪中观察并照相,WS2(条带弱)、巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3、L1N2和G20-5七个品种产生800bp左右的特异条带(图1),在紫外灯下分别切下这七个品种的特异条带,利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收,纯化。
采用的SRAP引物序列为:me6:5′-TGAGTCCAAACCGGGAC-3′
em1:5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′
PCR扩增反应在Bio-le PCR扩增仪上进行:PCR反应体系为25μl,含有10×buffer(含Mg2+)2.5ul,0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul,上下引物(10umol/L)分别1ul,DNA(50ng/L)1ul及1.5U TaqDNA聚合酶。反应程序为94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环35次;72℃延伸7min。。扩增反应结束后,加入4ul 6×loading buffer,取8~10μL扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,电极缓冲液为0.5×TBE。
三、香蕉枯萎病感病品种特异条带的回收测序
将800bp左右的特异条带在紫外灯下切下,采用Tiangel Midi purification kit试剂盒进行产物回收。对回收产物进行测序。将回收产物送样至赛墨飞世尔科技(中国)有限公司广州分公司进行测序。测序后得到四个品种:巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3(WS2、G20-5、L1N2这个品种由于回收浓度低测序未成功)的该片段的核苷酸序列:
巴西蕉的序列(829bp):
tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc
G30的序列(829bp):
tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc
NK4-1的序列(829bp):
tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc
L3-3的序列(829bp):
tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc
四、香蕉枯萎病感病品种特异条带的序列分析
将回收测序获得的巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3的序列在聚类分析软件MAGE6.0中进行排列比对,从图4看,巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3的序列是一致的。
五、香蕉枯萎病感病SCAR引物的设计及其扩增条件筛选
利用引物在线设计工具NCBI/primer-BLAST,进行引物设计,共设计了4对引物(引物序列见表2),利用巴西、NK、G30、L3-3、WS2、南天青、东蕉1号、农科一号、粤科1号、抗枯1号这十个品种进行引物筛选。
表2SCAR引物序列表
经过PCR程序及PCR体系的优化,其中引物SC1-SC2,扩增条带长度为324bp,从原特异条带的第216bp至第539bp。这对引物扩增后目的条带清晰(图2),其中感病品种:巴西、NK、G30、L3-3、WS2扩增出了324bp的目标条带,抗病品种:南天青、东蕉1号、农科一号、粤科1号、抗枯1号无目标条带,且无其他杂带,符合试验要求。
其最优的PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸7min,循环35次;72℃延伸10min。
其最优的PCR体系:20μl的反应体积含有10×buffer(含Mg2+)2ul,0.2mmol/LdNTPs(2.5nM)2ul,上下引物(10umol/L)分别1ul,DNA(50ng/L)1ul及1U TaqDNA聚合酶
在1.2%的琼脂糖凝胶上,110v电压电泳25分钟后在凝胶成像仪照相。
六、香蕉枯萎病抗病SCAR标记的准确性检测
采用选定的SCAR引物SC1-SC2,扩大群体来验证标记的准确性,供试的香牙蕉品种:索马里香蕉、天宝矮蕉、威廉斯、龙州中把、粗把香牙蕉、G6-2、粤科1号、农科1号、抗枯5号、漳选8-1、广东2号、东莞高把香蕉、齐尾、红河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、东莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷兰香蕉、北大矮、那龙中把香蕉、南天黄、BXM51、科2(品种对香蕉枯萎病的抗性见表1)等24个品种。从图3看检测结果:索马里香蕉、天宝矮蕉、威廉斯、龙州中把、粗把香牙蕉、漳选8-1、广东2号、东莞高把香蕉、齐尾、红河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、东莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷兰香蕉、北大矮、那龙中把等17个香蕉品种有324bp的目的条带,而G6-2、粤科1号、农科1号、抗枯5号、南天黄、BXM51、科2等7个香蕉品种没有扩增出目的条带,该结果与品种田间种植对香蕉枯萎病的抗性是一致的。
可见,发明人设计的SCAR引物SC1-SC2可以鉴定不同香牙蕉品种对香蕉枯萎病的抗性。
上述实施例,只是本发明的较佳实施例,并非用来限制本发明实施范围,故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰,均应包括在本发明权利要求范围之内。
Claims (7)
1.一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记,其特征在于,该标记来源于SRAP分子标记me6-em1扩增的一条829bp的特异条带,其序列为:
tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc。
2.如权利要求1所述鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记,其特征在于,条带长度为324bp,从原特异条带的第216bp至第539bp。
3.如权利要求1所述鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记,其特征在于,所述香蕉为香牙蕉。
4.用权利要求1-3中任意一项所述SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病的方法,其特征在于,
(1)、提取香蕉叶片DNA;
(2)、用SCAR标记的特异引物SC1/SC2进行PCR扩增检测;(3)、检测:结果表现为324bp特异条带的有无;有特异条带扩增即对香蕉枯萎病抗性为感病,未有条带扩增,即对香蕉枯萎病抗性为抗病。
5.如权利要求4所述用SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病抗性的方法,其特征在于,所述用SCAR标记的特异引物SC1/SC2序列为:
正向引物SC1:5’-CTCGCCGACACCTTACTTGA-3’
反向引物SC2:5’-AGGAGAGTCCAGCTCCAGTT-3’。
6.如权利要求4所述用SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病抗性的方法,其特征在于,所述扩增方法为:
PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环35次;72℃延伸7min。
PCR体系:25μl的反应体积含有10×缓冲液2.5ul,0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul,上下引物(10umol/L)分别1ul,DNA(50ng/L)1ul及1.5U TaqDNA聚合酶。
7.如权利要求4所述用SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病抗性的方法,其特征在于,所检测方法为:采用1.2%的琼脂糖凝胶,110v电压电泳25分钟,紫外灯下观察。
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