CN103981281B - 一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法：利用特异性引物(如SEQ？ID？NO.1～6所示)，通过PCR实验检测单个洋葱球核质基因型，筛选获得不育株和保持株洋葱球，实现两系配套。本发明根据Ms等位基因侧翼序列(F1890和S1887)与洋葱细胞质雄性不育特异序列mt472，设计多套引物，通过科学实验开发了基于多重PCR的分子标记检测系统及检测试剂盒。该检测系统能够通过一次PCR实验区分洋葱6种核质育性类型，然后利用此检测系统，从开放授粉群体内直接选育不育系和保持系，实现两系的一次性配套。该多重PCR检测系统的开发为洋葱核质互作雄性不育核质基因型的准确、快速鉴定具有重要意义。

Description

一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法
技术领域
本发明涉及一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法，属于生物技术领域。
背景技术
洋葱(AlliumcepaL.)为葱科葱属(APGIII分类系统)，二年生蔬菜作物，有5000多年的栽培历史，是一种世界性蔬菜，至少有139个国家栽培洋葱。据2012年FAO统计，世界洋葱种植面积420万公顷，产量8290万吨，在蔬菜作物中，其产量居世界第三位。我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，占世界总种植面积和产量的30％左右。洋葱耐储运，不但能够调剂蔬菜供应，还是一种重要的出口创汇蔬菜。从营养和保健的角度讲，洋葱不仅是人体类黄酮的重要食物来源之一，还具有广泛的生物活性和重要的药用价值，在防止心血管疾病、抗肿瘤、抗自由基、抗氧化、抗过敏、消炎、抗病毒等方面有着重要的作用。
核质互作的雄性不育由细胞核恢复基因与细胞质不育因子共同决定，广泛存在于高等植物中，其细胞质决定因子具有母性遗传的特征。在洋葱上，其雄性不育根据细胞质类型可分为S型和T型。目前S型雄性不育应用最为广泛，其不育性是由单个核基因和细胞质基因共同控制，并且不育性状可被显性核基因(Ms_)恢复。
我国洋葱栽培历史较短，品种资源较为匮乏，栽培品种多为常规品种，随着农业产业结构调整，对洋葱优良品种的需求日益增加。由于洋葱品种选育周期长，为普通蔬菜作物白菜、萝卜的2～4倍，生产上主要以品种引进和常规种为主，缺少具有自主知识产权的杂交一代品种。因此，需要花费大量的外汇从国外进口杂交种，使其出口创汇的生产成本居高不下。创建新型的洋葱骨干亲本系培育系统，是研制具有我国自主知识产权的洋葱杂交种，改变我国在洋葱育种领域落后局面的重中之重。这种新型的培育体系其关键技术在于：(1)广泛收集品种资源；(2)加快分子标记辅助选择体系以及雄性不育亲本配套体系研究；(3)骨干亲本系的选育与繁育；(4)筛选出符合育种目标的优良杂交种。其源头工作为育种材料的选育及分子标记的开发，这充分体现了现代分子生物学与常规育种的有机相结合。
洋葱育性相关基因分子标记的开发包括两个内容，即细胞核恢复基因和细胞质不育因子分子标记的开发。目前这两方面的研究均取得了较大的进展，特别是山东省农业科学院蔬菜花卉研究所-葱姜蒜研究中心(以下简称：本研究中心)在洋葱细胞核恢复座位分子标记(DNF566、RNS357、WH-SSR-1、AcSKP1)的研究。这些标记与洋葱育性恢复Ms座位交换值为0，与目前报道的一个最近的分子标记(jnurf05)之间的交换值为0.049％，而jnurf05标记与Ms座位之间的交换值也约为0.05％，因此，从育种的角度分析本研究中心所获得的这些分子标记所在座位即为Ms座位(图1)。而关于细胞质不育因子的研究，本研究中心已经获得一个稳定可靠的SCAR标记。目前关于洋葱育性相关基因分子标记的研究，均停留在核质单独研究上，通过分步实验达到鉴定核质育性，进而确定洋葱单株的育性。尚未见核质共检测系统的报道，更未见此系统应用于不育系和保持系的筛选及配套的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明开发了一种洋葱育性相关基因的核质共检测系统及检测用试剂盒，提供了一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法。根据本研究中心已获得的Ms等位基因侧翼序列与洋葱细胞质雄性不育特异序列，设计多套引物，通过科学实验开发了基于多重PCR(Multiplex-PCR)的核质分子标记共检测系统。该检测系统能够通过一次PCR实验区分洋葱6种核质育性类型【S(MsMs)、S(Msms)、S(msms)、N(MsMs)、N(Msms)、N(msms)】。利用此检测系统，从开放授粉群体内(open-pollinatedpopulation，OP群体或常规种)直接选育不育系和保持系，实现两系的一次性配套。该检测系统的开发为洋葱核质互作雄性不育核质基因型的准确、快速鉴定，加速洋葱骨干亲本系的培育以及洋葱杂交新品种的选育进程，建立新型的洋葱杂交育种亲本选配体系具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法，步骤如下：
(1)筛选符合育种目标的OP群体单个洋葱球；
(2)提取待检测洋葱样本的总DNA；
(3)通过PCR实验检测单个洋葱球核质基因型，筛选获得两类(不育株和保持株)洋葱球；
所述PCR实验检测过程中，所用的特异性引物如下：
NF898U:5'GCAATACACAGCTTCTAGCTGAATT3'，如SEQIDNO.1所示；
NF898D:5'AACACACACACAGAGTGAGAAATTTTATATA3'，如SEQIDNO.2所示；
NS628U:5'TCTGTGTGTGTGTGTAATTTCTCTG3'，如SEQIDNO.3所示；
NS628D:5'CGGAAGATTAATATTTTGCGTATACAT3'，如SEQIDNO.4所示；
mt345U:5'TTGTTCTCAAGCAGATTCCGC3'，如SEQIDNO.5所示；
mt345D:5'CAGTAGGACCAAACCGAGAGTGA3'，如SEQIDNO.6所示；
若PCR实验检测结果不存在898bp的片段，存在628bp和345bp的片段，则该待检测洋葱样本的基因型为S(msms)，该待检测洋葱样本为不育株；
若PCR实验检测结果不存在898bp和345bp的片段，存在628bp的片段，则该待检测洋葱样本的基因型为N(msms)，该待检测洋葱样本为保持株；
注：若扩增产物中存在345bp片段，则为S型细胞质，反之则为N型细胞质；若扩增产物中存在898bp片段，则为显性Ms等位基因，若扩增产物中存在628bp片段，则为隐性ms等位基因；
(4)将上述筛选得到的两类洋葱球定植于网室内；网室内葱球开花后混合授粉，从不育株(多株或单株)获得不育系，从可育株(多株或单株)获得保持系，达到一次性两系配套。
所述步骤(2)中，提取待检测洋葱样本的总DNA采用CTAB或TPS法[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,andManiatis,T.,inMolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,Vol.1,2,3(1989)；ThomsonD,HenryR(1995)Single-stepprotocolforpreparationofplanttissueforanalysisbyPCR.BioTechniques19:394–397,400]。
所述步骤(3)中，PCR实验检测的反应体系为：25μL体系，具体为：2.5μL10×PCRBuffer(Mg2+free)，MgCl24mmol/L，dNTP0.6mmol/L，DNA模板1μL(50ng)，引物NF898U、NF898D、NS628U、NS628D各0.9μL(0.36μmol/L)，mt345U和mt345D各0.2μmol/L，rTaqDNApolymerase(5U/μL)0.6μL，双蒸水补足体系至25μL。
所述步骤(3)中，PCR实验检测时，可采用特定的PCR检测试剂盒，其反应体系为：25μL体系，具体为：2.5μL10×PCRBuffer(Mg2+free)，MgCl24mmol/L，dNTP0.6mmol/L，引物NF898U、NF898D、NS628U、NS628D各0.9μL(0.36μmol/L)，mt345U和mt345D各0.2μmol/L，HotStartTaqDNApolymerase(5U/μL)0.6μL，双蒸水6.3μL；上述反应组分提前预混，4℃保存，检测时取24μL加入DNA模板1μL(50ng)。
所述步骤(3)中，PCR实验检测的反应程序为：94℃预变性5min，[94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min]，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
所述步骤(3)中，PCR实验检测过程中，用特异性引物扩增后，检测是否有扩增产物的方法为：将经过PCR扩增得到的产物于140V电压(恒压)，1.2％的琼脂糖凝胶，电泳35分钟，溴化乙锭染色10分钟，凝胶成像系统拍照分析。
所述步骤(4)中，洋葱球定植于网室内，定植方式为：一个网室只能定植同一OP群体来源的葱球。
所述步骤(4)中，网室为防虫网，其作用为防止网室外的授粉昆虫进入网室内，阻止外源花粉对网室内洋葱材料的干扰。
所述步骤(4)中，混合授粉为：网室内授粉昆虫对网室内的材料进行自由传粉。
上述操作步骤及条件如无特别说明，均按本领域常规操作步骤及操作条件进行。
用于选育洋葱雄性不育系和保持系的特异性引物，如下：
NF898U:5'GCAATACACAGCTTCTAGCTGAATT3'，如SEQIDNO.1所示；
NF898D:5'AACACACACACAGAGTGAGAAATTTTATATA3'，如SEQIDNO.2所示；
NS628U:5'TCTGTGTGTGTGTGTAATTTCTCTG3'，如SEQIDNO.3所示；
NS628D:5'CGGAAGATTAATATTTTGCGTATACAT3'，如SEQIDNO.4所示；
mt345U:5'TTGTTCTCAAGCAGATTCCGC3'，如SEQIDNO.5所示；
mt345D:5'CAGTAGGACCAAACCGAGAGTGA3'，如SEQIDNO.6所示。
用于选育洋葱雄性不育系和保持系的检测试剂盒，其反应体系为：25μL体系，具体为：2.5μL10×PCRBuffer(Mg2+free)，MgCl24mmol/L，dNTP0.6mmol/L，引物NF898U、NF898D、NS628U、NS628D各0.9μL(0.36μmol/L)，mt345U和mt345D各0.2μmol/L，HotStartTaqDNApolymerase(5U/μL)0.6μL，双蒸水6.3μL；上述反应组分提前预混，4℃保存，检测时取24μL加入DNA模板1μL(50ng)。
本发明通过科学实验开发了一个基于多重PCR(Multiplex-PCR)的分子标记检测系统，多重PCR标记名称为洋葱核质共检测标记NCCM-1(NucleusandCytoplasmCo-detectionMarker-1)，该检测系统能够通过一次PCR实验区分6种核质育性类型的洋葱单株【S(MsMs)、S(Msms)、S(msms)、N(MsMs)、N(Msms)、N(msms)】。利用此系统，可从开放授粉群体内(open-pollinatedpopulation，OP群体或常规种)直接选育不育系和保持系，从而实现两系的一次性配套。
本发明的利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)标记稳定：本发明通过科学的实验设计和测试，开发了一个能够同时鉴定洋葱6种核质类型的检测标记NCCM-1。该标记已在48份不同遗传背景材料中得到验证，所有材料的标记类型与表型完全一致。
(2)操作简单：利用此标记从符合育种目标的葱球中通过1次PCR实验即可同时获得不育株和保持株，克服了以往的标记要通过2次或者3次实验，分别鉴定细胞核和细胞质类型的局限性(图2)。
(3)直接实现不育系与保持系的配套：利用该检测系统对符合育种目标的OP群体材料进行筛选直接获得不育株及保持株，混合授粉后实现配套。其特点为OP群体内的材料，经过人为筛选，农艺性状趋于一致而成为一个常规品种。在此基础上，筛选得到的不育株及保持株，农艺性状同样较为一致，这非常有利于不育系与保持系的配套；另外，直接混合授粉方案又克服了洋葱在选育不育系和保持系时必须通过单株测交才能鉴定单株基因型而带来的严重自交衰退现象。这是一次将分子标记用于筛选不育系和保持系以及实现两系配套的成功实践。
附图说明
图1：洋葱Ms座位的遗传连锁分析，Ms为洋葱雄性不育恢复基因座位；DNF566、RNS357、WH-SSR-1、AcSKP1为本研究中心开发的分子标记；jnurf05来源于Park(2013)[ParkJ,BangH,ChoD,YoonM-K,PatilB,KimS(2013)Constructionofhigh-resolutionlinkagemapoftheMslocus,arestorer-of-fertilitygeneinonion(AlliumcepaL.).Euphytica192:267–278]；0.049％为本研究中标记AcSKP1与jnurf05之间的重组值；0.05％为Ms座位与jnurf05之间的重组值。
图2：本发明检测系统与其他已存在的检测系统的比较，其中1stPCR为一次PCR实验，2nd为两次PCR实验，3rdPCR为三次PCR实验；S型和N型分别为不育细胞质和正常细胞质。
图3：核等位基因标记引物与细胞质不育基因标记引物兼容性测试，M为分子量标准DL2000；NF898、NF886为显性Ms等位基因标记名称；NS567、NS621、NS628、NS617为隐性ms基因标记名称；mt345为不育细胞质标记名称；a、b、c、f为引物二聚体；e和h为被抑制的mt345扩增带；d和g分别为被抑制的NS621和NS617扩增带所出现的位置。
图4：NCCM-1标记在6种核质育性类型材料中的验证，M为分子量标准DL2000；118为洋葱雄性不育系S(msms)；118×12-12为雄性不育系和育性恢复系12-12的杂交材料基因型为S(msms)；12-12基因型S(MsMs)；218基因型N(msms)；OPR-1为来源于OPR群体的N(Msms)材料；153为基因型为N(MsMs)；–隐性对照，无DNA模板，双蒸水做模板。
图5：NCCM-1在不同遗传背景材料中的通用性验证，M为分子量标准DL2000。
图6：PCR检测试剂盒稳定性测试，M为分子量标准DL2000；0d，1d，3d，5d，7d，14d，21d为PCR预混液的放置时间；箭头所示为PCR扩增衰减带。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系
(一)材料与方法
1.植物材料
选用洋葱核质互作雄性不育恢复系12-12和不育系118为染色体步移材料。恢复系12-12与不育系118杂交后获得F1，F1自交后获得F2。6种类型的洋葱材料：S(MsMs)材料为恢复系12-12；N(msms)材料为保持系218；N(MsMs)材料为153；S(msms)材料为雄性不育系118；S(Msms)材料为恢复系12-12和雄性不育系118的杂交材料F1；N(Msms)材料为OPR群体中分离出的材料OPR-1。这些均为用于测试开发的多重PCR分子标记NCCM-1的模式材料。
在多重PCR分子标记NCCM-1的通用性测试中，48份遗传背景不同的材料为：S(msms)分别为雄性不育系110、502、503、101、117-5、117-11-1、117-10-1和117-10-2；N(msms)分别为保持系210、602、603、202、217-5、217-11-1、217-10-1和217-10-2；N(MsMs)分别为151、152、153、155、156、157、158和159；S(MsMs)分别为141、142、143、145、146、147、148和149；S(Msms)均为F1杂交种分别是天正201、TABAO、ATON、EARTH、ADVANCE、AMA70、TASAN和MOMIJINo.3；N(Msms)材料均为从OP(OPG、OPB、OPR)群体分离出的材料分别是OPG-1、OPG-2、OPB-1、OPB-2、OPR-1、OPR-2、OPR-3和OPR-4。
4个OP群体分别为OPY、OPG、OPB和OPR。OPY为中熟黄皮，OPG中晚熟金黄皮，OPB为中晚熟棕皮，OPR为中晚熟红皮。
2.总DNA的提取及检测
染色体步移材料DNA的提取采用改良CTAB法[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,andManiatis,T.,inMolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,Vol.1,2,3(1989)]，琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测。验证材料的DNA提取方法采用改良TPS法[ThomsonD,HenryR(1995)Single-stepprotocolforpreparationofplanttissueforanalysisbyPCR.BioTechniques19:394–397,400]。
3.引物设计
根据染色体步移获得的Ms位点侧翼序列F1890(SEQIDNO.7)和S1887(SEQIDNO.8)分别设计显性和隐性等位基因特异引物，然后与洋葱细胞质不育序列mt472(SEQIDNO.9)的特异性引物组配，利用恢复系12-12与不育系118杂交后获得F1对引物其进行兼容性测试评估，获得核质共检测标记组配引物。
4.PCR扩增及检测
PCR扩增在美国伯乐的TC-XP-D型基因扩增仪上进行。其中核基因型检测系统为：10×PCRbuffer(Mg2+free)2.5μl、MgCl24mmol/L、dNTP0.6mmol/L、DNA模板1μl(约50ng)、引物各0.4μmol/L、rTaqDNA聚合酶3U、用灭菌双蒸水补齐至25μl；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，65.4℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。
核质共检测系统为：25μL体系，其中2.5μL10×PCRBuffer(Mg2+free)，MgCl24mmol/L，dNTP0.6mmol/L，DNA模板1μL(约50ng)，引物NF898U、NF898D、NS628U、NS628D各0.9μL(0.36μmol/L)，mtU345和mtD345各0.2μmol/L，rTaqDNApolymerase(5U/μL)0.6μL，双蒸水补足体系至25μL；PCR检测反应程序：94℃预变性5min，[94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min]，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
PCR实验检测时，可采用特定的PCR检测试剂盒，反应体系为：25μL体系，2.5μL10×PCRBuffer(Mg2+free)，MgCl24mmol/L，dNTP0.6mmol/L，引物NF898U、NF898D、NS628U、NS628D各0.9μL(0.36μmol/L)，mt345U和mt345D各0.2μmol/L，HotStartTaqDNApolymerase(5U/μL)0.6μL，双蒸水6.3μL；上述反应组分提前预混，4℃保存，检测时取24μL加入DNA模板1μL(50ng)。
PCR产物于140V电压(恒压)，1.2％的琼脂糖凝胶，电泳35分钟，溴化乙锭染色10分钟，凝胶成像系统拍照分析。
5.单株验证
通过田间观察判断各株的育性和Ms位点的基因型；反应体系、程序以及检测方法参照4；根据核标记的类型与育性评估的一致程度，计算交换值。
6.不育系与保持系的一次性配套方法
首先，从每个OP群体中选择符合育种目标的洋葱球，然后利用洋葱核质检测标记NCCM-1系统，对符合育种目标的葱球进行核质分型，获得期望的不育株和保持株群体。根据电泳图片选择的保持株和不育株葱球定植于网室内，进行混合授粉繁育，一次性获得保持系和不育系。同时，对其后代育性分离进行检测，并与分子标记检测结果进行匹配。其中，保持株的电泳图片特征为存在628bp的电泳带，无898bp和345bp的电泳带；不育株的电泳特征为存在628bp和345bp的电泳带，无898bp电泳带。其他类型的材料用于6种类型模式材料的电泳分析。
(二)结果与分析
1.引物设计与兼容性测试
利用本研究中心已获得的Ms等位基因侧翼序列F1890和S1887序列以及洋葱细胞质雄性不育特异序列mt472，分别设计等位基因特异性引物(表1)，核等位基因特异性引物与细胞质标记引物分别组配，确定最优引物。
表1本研究中所用引物列表
由图3可以看出，选择NF898作位显性Ms等位基因标记，其原因为b处引物二聚体扩增强度超过a处；选择NS628作为隐性ms基因标记，原因为NS621、NS617与mt345形成强烈的引物二聚体，导致目的扩增极弱(e和h)或无扩增(d和g)，NS567虽然存在目的带的扩增，但是与NS628相比，引物二聚体f扩增较强，因此，NS628作为隐性ms等位基因筛选标记。由于，核组配标记NF898和NS628处于洋葱AcSKP1基因内部，故将其命名为AcSKP1标记。综上所述，后续实验采用NF898、NS628和mt345组配引物，命名为洋葱核质共检测标记NCCM-1(NucleusandCytoplasmCo-detectionMarker-1)。
2.PCR检测试剂盒稳定性测试
将PCR检测用预混液分别放置于4℃和室温两种环境下，以延时0-21天进行测试。其稳定性结果由图6可以看出，在4℃条件下，0-21天内扩增结果无显著变化；而在常温下其898bp的扩增带随着时间的延长其扩增结果逐渐变弱。因此，该PCR预混液在4℃条件下，至少可以稳定保存21天。
3.NCCM-1标记在6种核质育性类型材料中的验证
将开发的NCCM-1分子标记在6种核质育性类型的材料【S(msms)、S(Msms)、S(MsMs)、N(msms)、N(Msms)、N(MsMs)】中测试，检测结果表明，NCCM-1标记检测的育种材料的基因型与其自身的基因型完全一致(图4)。所有不育细胞质(S型细胞质)，都有345bp片段的带，所有可育细胞质(N型细胞质)均无此带；所有的纯合隐性个体均有628bp片段，无898bp的带；所有纯合显性个体均有898bp片段，无628bp片段；所有杂合体均包含2条带(898bp和628bp)的扩增。随后为了验证所开发的核质共检测标记的通用性，我们利用48份遗传背景不同的材料(见植物材料)进行验证，检测结果与基因型完全相符(图5)。材料N(Msms)均来源于OP群体，与不育系测交后，其子代的表型存在可育与不育两种类型，分离比为1：1，自交后代完全可育。
4.核标记AcSKP1与Ms座位和jnurf05标记的连锁分析
F2群体(118×12-12)包含1011个单株，其中不育株为237株，可育株为774株，符合3：1的孟德尔分离比例(χ2＝1.31，p＝0.252)。AcSKP1标记检测结果表明，所有不育株均存在628bp片段无898bp片段；而所有的可育株均存在898bp的片段，从带型上分析又包含两种扩增模式，其中第1种模式为存在898bp片段无628片段，第2种模式为898bp和628bp两条带都有扩增。核标记AcSKP1检测结果与育性类型完全一致，故AcSKP1与Ms座位完全连锁(图1)。同时利用AcSKP1和jnurf05标记对F2群体进行评估发现，这两个标记之间存在1个重组单株，其重组值为0.049％(图1)。
5.核质共检测标记NCCM-1在保持系及不育系筛选及配套中的应用
在4个OP群体中，利用分子标记检测系统NCCM-1对符合育种目标的葱球进行分子检测，结果表OPG和OPB既存在不育株又存在保持株；OPY群体不存在N型细胞质，故不存在保持株；OPR全为N型细胞质，因此不存在不育株。根据检测结果从OPG和OPB各选择10个不育株和10个保持株,分别在各自的隔离空间内达到不育系与保持系的配套。其中，保持株具有两种不同类型的功能，第一个功能是为不育株提供花粉进而繁育不育系，另一功能为保持株内混合授粉，繁育保持系。OPR不存在基因型为不育株的葱球，可利用已有的不育系110通过回交使两系配套，OPY不存在基因型为保持株的葱球，因而此群体不能简单配套。
在每个OP群体，混合授粉的后代育性分离结果表明，不育株上采种的后代的表型全不育，可育株上采种的后代的表型全可育。这进一步证明了标记检测结果与洋葱育性基因型完全一致。
因此，利用核质共检测标记NCCM-1仅通过一次筛选实验即可筛选获得洋葱保持株和不育株，并于当代同时繁育不育系和保持系，达到一次性两系配套的目的。本标记及方法的利用具有节省时间、节省工作量、节省实验成本的特征，能够极大地提高选择效率，加速洋葱骨干亲本系的培育以及洋葱杂交新品种的选育进程；为建立新型的洋葱杂交育种亲本选配体系，填补我国在洋葱杂交育种领域上的空白奠定了基础。

Claims (5)

1.一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)筛选符合育种目标的OP群体单个洋葱球；
(2)提取待检测洋葱样本的总DNA；
(3)通过PCR实验检测单个洋葱球核质基因型，筛选获得不育株和保持株的洋葱球；
所述PCR实验检测过程中，所用的特异性引物如下：
NF898U:5'GCAATACACAGCTTCTAGCTGAATT3'，如SEQIDNO.1所示；
NF898D:5'AACACACACACAGAGTGAGAAATTTTATATA3'，如SEQIDNO.2所示；
NS628U:5'TCTGTGTGTGTGTGTAATTTCTCTG3'，如SEQIDNO.3所示；
NS628D:5'CGGAAGATTAATATTTTGCGTATACAT3'，如SEQIDNO.4所示；
mt345U:5'TTGTTCTCAAGCAGATTCCGC3'，如SEQIDNO.5所示；
mt345D:5'CAGTAGGACCAAACCGAGAGTGA3'，如SEQIDNO.6所示；
若PCR实验检测结果为：不存在898bp的片段，存在628bp和345bp的片段，则该待检测洋葱样本的基因型为S(msms)，该待检测洋葱样本为不育株；
若PCR实验检测结果为：不存在898bp和345bp的片段，存在628bp的片段，则该待检测洋葱样本的基因型为N(msms)，该待检测洋葱样本为保持株；
(4)将上述筛选得到的洋葱球定植于网室内；网室内葱球开花后混合授粉，从不育株获得不育系，从保持株获得保持系。
2.根据权利要求1所述的利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR实验检测的反应体系为：25μL体系，该25μL体系为不含Mg2+的1×PCRBuffer，MgCl24mmol/L，dNTP0.6mmol/L，DNA模板50ng，引物NF898U、NF898D、NS628U、NS628D均为0.36μmol/L，mt345U和mt345D各0.2μmol/L，rTaqDNApolymerase3U以及双蒸水。
3.根据权利要求1所述的利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR实验检测的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR实验检测过程中，用特异性引物扩增后，检测是否有扩增产物的方法为：将经过PCR扩增得到的产物于140V电压，恒压，1.2％的琼脂糖凝胶，电泳35分钟，溴化乙锭染色10分钟，凝胶成像系统拍照分析。
5.用于选育洋葱雄性不育系和保持系的特异性引物，其特征在于：如下：
NF898U:5'GCAATACACAGCTTCTAGCTGAATT3'，如SEQIDNO.1所示；
NF898D:5'AACACACACACAGAGTGAGAAATTTTATATA3'，如SEQIDNO.2所示；
NS628U:5'TCTGTGTGTGTGTGTAATTTCTCTG3'，如SEQIDNO.3所示；
NS628D:5'CGGAAGATTAATATTTTGCGTATACAT3'，如SEQIDNO.4所示；
mt345U:5'TTGTTCTCAAGCAGATTCCGC3'，如SEQIDNO.5所示；
mt345D:5'CAGTAGGACCAAACCGAGAGTGA3'，如SEQIDNO.6所示。
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CN112219716A (zh) * 2020-10-09 2021-01-15 连云港市农业科学院 一种洋葱田间配制杂交组合的简易方法

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KR101027924B1 (ko) * 2008-08-29 2011-04-12 전남대학교산학협력단 신규한 양파 웅성불임 세포질 특이적 키메라 유전자와 이를이용하여 개발된 상기 양파 계통 식물체 선발용 ｄｎａ 표지 인자
CN101492738B (zh) * 2009-03-09 2011-09-21 山东省农业科学院蔬菜研究所 一种洋葱细胞质雄性不育scar标记及其应用
KR101338472B1 (ko) * 2010-12-28 2013-12-11 전남대학교산학협력단 양파의 웅성불임 다형성 마커
CN102925431B (zh) * 2011-08-08 2013-12-11 山东省农业科学院蔬菜研究所 与洋葱雄性不育恢复基因Ms紧密连锁的SCAR标记及其应用
CN102952797B (zh) * 2011-08-24 2014-05-28 山东省农业科学院蔬菜研究所 与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记及其应用
CN103184293B (zh) * 2013-04-11 2014-05-21 山东省农业科学院蔬菜研究所 一种鉴定洋葱雄性不育基因的共显性scar标记及应用

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