CN103131755A

CN103131755A - 利用srap标记快速检测青花菜杂交种纯度

Info

Publication number: CN103131755A
Application number: CN 201110377003
Authority: CN
Inventors: 姚雪琴; 谢祝捷; 李光庆
Original assignee: Shanghai Keyuan Seed Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Keyuan Seed Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及一种利用SRAP标记快速鉴定杂交青花菜种子纯度的新方法。其特征在于：以SRAP分子标记为基础，将杂交种种子进行常规的室内外发芽试验，待发芽后，取子叶单株提取DNA，利用SRAP引物ME1/EM10和ME6/EM2进行PCR扩增检测青花菜杂交种纯度。本发明具有快速、简便、稳定、可靠、低成本、不受环境条件影响等优点，对青花菜杂交种子纯度进行鉴定只需要5-6小时就可以完成一个批次的鉴定，节省了大量人力、地力，鉴定结果快速准确。在青花菜种子纯度鉴定上具有很大的应用价值。

Description

利用SRAP标记快速检测青花菜杂交种纯度

技术领域

本发明属于农业生物技术工程，特别涉及一种利用SRAP分子标记快速检测青花菜杂交种纯度的技术。

背景技术

青花菜(Brassica oleracea var.italica)俗称西兰花、绿菜花等，属十字花科芸薹属甘蓝种，是甘蓝与花椰菜等演变中的一个变种，为一、二年生草本植物，原产于意大利。青花菜柔嫩爽口，风味鲜美，营养丰富，是中西餐配菜的重要原料和营养保健蔬菜，是宾馆、饭店及家庭餐桌上的高档菜肴，也是加工速冻、脱水及保鲜蔬菜出口的重要品种之一。目前世界各国青花菜栽培面积逐年增加，有超过花椰菜的趋势。由于其产品出口创汇价值高，内销市场也日益扩大，近年来，我国青花菜的种植面积不断增加。大量医学与营养学研究表明，青花菜中富含4-甲基亚磺酰丁基硫苷(glucoraphanin，又称葡萄糖莱菔子苷)，适宜条件下，该硫苷经过植物中的黑芥子酶或者人体胃肠内微生物水解后所产生的萝卜硫素(sulforaphane，简称SF，1-异硫氨酸-4-甲磺酰基丁烷)具有极强的抗癌以及抗氧化能力。此外，青花菜中还含有丰富的维生素，矿物质以及蛋白质，越来越受到广大消费者的青睐。

青花菜具有明显的杂种优势，其杂种一代已广泛用于生产，但是在杂交制种过程中，由于隔离不严或亲本自交结实等原因，常混有母本自交系种子或由其它不明来源花粉所造成种子的生物性混杂，而大批量制种时，由于机械混杂等原因，也会造成种子混杂，。因此，杂交种在销售前，必须经过纯度检测。目前，大田形态鉴定法是普遍采用的检测方法，此方法虽然比较直观可靠，但费时、费工，成本也较高，因此建立快速、准确和经济的分子标记鉴定青花菜杂交种纯度的方法具有重要意义。

SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)，即相关序列扩增多态性，是一种基于PCR技术的新型分子标记，该标记通过独特的双引物设计对基因的ORFs(Open reading frames)的特定区域进行扩增，上游引物长17bp，对外显子区域进行特异扩增。下游引物长18bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点。目前已成功地应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、重要性状的标记以及相关基因的克隆等方面，且已有利用SRAP标记对花生、西瓜等种子纯度鉴定的报道，而应用于青花菜杂交种纯度鉴定尚未见报道。

发明内容

本发明提出一种利用SRAP分子标记快速检测青花菜杂交种纯度的方法。其特征在于：所述的快速检测青花菜杂交种纯度是通过SRAP分子方法实现的，通过PCR体系和程序优化，进行筛选引物，获得在亲本间产生多态性的引物组合，同时利用有效的两对引物组合对青花菜杂交种PCR扩增检测，保证了检测结果的稳定性和准确性。

本发明的有益效果是：用SRAP分子标记检测青花菜杂交种纯度，除了方法操作简单、周期短、不受环境控制，检测结果准确率高，同时建立了一套快速有效的室内种子纯度鉴定体系，为新品种保护和快速推广提供技术支撑。

附图说明

图1.青花菜DNA提取电泳检测图谱

图2.SRAP引物组合ME1/EM10对沪绿5号青花菜种子纯度的检测结果

注：M为marker，1为父本，2为母本，3-24为沪绿5号杂交种样本

图3.SRAP引物组合ME6/EM2对沪绿5号青花菜种子纯度的检测结果

注：M为marker，1为父本，2为母本，3-24为沪绿5号杂交种样本。

具体实施方式

该检测青花菜杂交种纯度方法是通过SRAP分子标记的方法实现。从理论上讲，SRAP标记是基于分子水平上的基因型鉴定，鉴定结果准确、可靠。但SRA P标记的本质是PCR反应，在PCR扩增过程中，应充分考虑PCR反应的条件与假阳性，本专利在优化了PCR扩增体系和程序的基础上筛选出在亲本间产生多态性引物组合，并进行了多次重复，保证试验的稳定性和真实性。并且在鉴定过程中，包括从样品采集、DNA提取到编号对应等均做到准确一致且无交叉污染，以保证试验的准确性和可靠性。

实施例：利用SRAP标记快速检测沪绿五号青花菜杂交种的纯度

1材料与方法

1.1材料

植物材料：青花菜杂交一代品种“沪绿5号”及其父母本由上海市农科院园艺研究所提供。

生化试剂：Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs、DNA Marker等均购自上海生物工程有限公司。SRAP引物由上海生工合成。

1.2方法

1.2.1育苗

2010年7月将待测纯度的F₁代置于培养皿中育苗，并设定培养箱条件为25℃下光处理12h，20℃下暗处理12h，培养3d；将父本、母本及F₁子代于温室育苗。

1.2.2取样

取待试材料幼嫩子叶，其中F₁代进行单株取样，父母本及F₁代为5株混合取样，采用打孔取样法取其幼嫩的真叶。

1.2.3DNA提取

采用改良CTAB-氯仿-异戊醇法提取材料子叶中的基因组DNA：

1、将样本置研钵中，用液氮研磨成粉末，磨样时防止样本间混合。

2、将粉末放入2mL离心管中，加入1000μ预热至65℃的CTAB缓冲液。

3、65℃水浴60min，每10min上下颠倒混匀。

4、加入800μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，静置5min。

5、12000rpm离心10min。

6、取上清液至新2mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，4℃静置60min。

7、12000rpm离心10min，弃上清，控干水分。

8、加入500μL含RNase的超纯水，37℃水浴60min。

9、加入100μL5M NaCl，混匀，静置10min

10、加入400μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，静置5min。

11、12000rpm离心10min。

12、将上清夜转至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，4℃静置60min。

13、12000rpm离心10min。

14、弃上清，用70％乙醇清洗沉淀2次，倒掉乙醇，风干。

15、加入100-150μL灭菌的1×TE缓冲液溶解DNA，65℃水浴1h，然后-20℃保存备用。

1.2.4DNA检测

所提取的总DNA用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测质量，用紫外分光光度计测定浓度并稀释至10ng/μL，于-20℃保存备用。

1.2.5SRAP-PCR扩增

SRAP引物序列和标记分析方法参照Li和Quiros(2001)的方法，SRAP扩增反应体系总体积为20μL体系中包含：10×Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 2.0μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 3.0μL，上、下游引物各3.0μL，双蒸馏水6.4μL。

SRAP-PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1.5min，进行5个循环；然后进入35个循环，94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸10min，4℃保存。

1.2.6PCR产物的电泳检测

琼脂糖电泳检测：PCR扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶中120V电泳1.0h左右，EB染色，GelDoc TM EQ170-8060凝胶成像仪进行观察并拍照分析。以Marker DL-2000为分子量标准。

1.2.7田间种植鉴定分析

2010年7月于上海市农科院闵行区试验田播种F₁代200株，观察并统计其农艺性状，主要依据株型、叶形、叶色、球形及球色等区分杂交F₁代与其父母本的区别。

2结果与分析

2.1、DNA检测结果

如图1电泳检测所示，基因组DNA主带清晰完整，无弥散带，RNA去除干净，点样孔清晰无发亮现象，杂质去除干净，DNA纯度较高，符合SRAP技术要求。

2.2沪绿5号杂交种及其亲本的多态性分析

本试验用120对SRAP引物组合对“沪绿5号”杂交种及其亲本基因组DNA进行了扩增，结果58对引物组合能够扩增出多态性片段，占总引物数的48.33％，其中14个引物无任何条带，21个结果不清晰，32个引物在父母本及子代中条带相同，33个偏父型，22个偏母本型，2个互补型，1个其他型。经过多次重复证实引物组合ME1/EM10、ME6/EM2扩增条带呈多态性，表现为稳定的共显性，即杂种表现为父母本互补的带型，且条带清晰、重复性好，可作为F₁代种子纯度鉴定。

2.3沪绿5号青花菜杂交种的纯度鉴定

利用双亲互补型引物ME1/EM10与ME6/EM2对200株沪绿5号杂交子代进行SRAP多态性分析，所得纯度分别为，ME1/EM10(图2)为96％，其中6株偏父本型，2株偏母本型，ME6/EM2(图3)为96.5％，其中5株为偏父本型，2株为偏母本型，而田间种植纯度鉴定为98％，其相似率分别为97.9％，98.4％。

本研究应用SRAP技术对沪绿5号杂交种纯度鉴定的结果低于田间种植鉴定结果，表明SRAP标记相对于田间种植鉴定来说，能够更好的检测出杂株。同时，SRAP纯度鉴定结果与田间种植鉴定结果有较好的相似率，所以可以采用SRAP标记鉴定来替代田间种植鉴定，从而克服田间种植鉴定周期长、易受环境条件影响等缺点。

Claims

1.一种利用SRAP标记快速检测青花菜杂交种纯度的方法，其特征在于：所述的快速检测青花菜杂交种纯度是通过SRAP分子方法实现的，通过PCR体系和程序优化，进行筛选引物，获得在亲本间产生多态性的引物组合，利用有效的引物组合对青花菜杂交种PCR扩增检测。

2.根据权利要求1所述的SRAP标记快速检测青花菜杂交种纯度的方法，其特征在于：与田间形态学检测比较，本方法操作简单、周期短、不受环境控制、检测结果稳定和可靠；与其它分子标记相比，SRAP标记在青花菜上多态性好，引物利用率高。

3.根据权利要求1或2所述的SRAP标记快速检测青花菜杂交种纯度的方法，其特征在于：所用的PCR扩增体系、程序和引物组合只适合在青花菜种子纯度检测中使用。