CN103060322B - 尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记（SEQ.ID.No.1）和由该标记转化得到的SCAR标记（SEQ.ID.No.2）以及这些分子标记在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。本发明的分子标记具有尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株特异性、一致性和稳定性并能够区分该专化型菌株与其它专化型致病菌差异，可以鉴别出尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原物，在尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株的鉴定中具有重要作用，为建立尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原菌的特异、快速、高灵敏度、稳定可靠的分子检测技术体系奠定了基础。应用本发明可克服常规鉴定、鉴别尖孢镰刀菌苦瓜专化型病菌工作量大、周期长的缺点，实现了病原物的快速、准确鉴定和检测。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记及其应用，具体是尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记和由该标记转化得到的SCAR标记以及这些分子标记在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。
背景技术
由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum Schl.f.sp.Momordicae Sun & Huang,FOM)引起的苦瓜枯萎病是一种危害严重的真菌性病害，该病害已遍及亚洲苦瓜主产区如菲律宾、日本、印度等国家，在我国广西、广东、湖南、福建、浙江、江西和台湾等省（区）发生严重，造成苦瓜产量的巨大损失。尖孢镰刀菌苦瓜专化型与引起葫芦科瓜类作物枯萎病的其他6个已知尖孢镰刀菌专化型病原菌在表型上非常接近而难以辨别，主要依赖于对特殊寄主的致病性或较窄的寄主范围来区分和鉴定，这一传统接种鉴定方法周期较长，耗时费力。
分子标记技术已被广泛用于植物病原真菌种内、种间和属间亲缘关系的研究，为鉴定和检测病原菌提供了基础。利用随机扩增多态性DNA（RandomAmplified Polymorphic DNA,RAPD)指纹图谱丰富的信息量，寻找专一性DNA序列标签(Sequence Tagged Sites,STS)制作特异探针或转换成更加稳定的序列特异扩增区域标记(Sequence Characterized Amplified Region,SCAR)，可以简化传统的鉴定技术，被成功地应用在多种植物病原真菌的病原鉴定和诊断中,如香蕉枯萎病生理小种、尖孢镰刀菌菠菜专化型、黄瓜专化型和丝瓜专化型等(廖林凤等,2009;Jiang,2006;Wang等,2001;Bart等,2007)。这充分说明了利用分子标记技术将有可能成为鉴别和检测葫芦科瓜类作物枯萎病致病菌的尖孢镰刀菌各专化型的有力武器。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供特异专一的尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记RAPD标记和SCAR标记及其在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58-519，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
上述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58-519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。
尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58-519，具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。
扩增SCAS58-519标记的引物对具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。
上述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58-519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。
尖孢镰刀菌苦瓜专化型PCR快速检测方法，PCR反应体系中含有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列的引物对Primer1和Primer2。
该检测方法PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：
反应体系共25μL：12.5μL2×Es Taq MasterMix，内含2×Es Taq PCR Buffer、3mM MgCl2，Es Taq Polymerase和400μM dNTP Mix；1.0μL浓度10μmol·L-1的Primer1，1.0μL浓度10μmol·L-1的Primer2；2.0μL浓度15ng/μL的模板DNA，8.5μLddH2O；
扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。
发明人在开展苦瓜枯萎病菌的鉴定及其RAPD遗传多样性分析研究的基础上，成功获得了具有尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株特异性、一致性和稳定性并能够区分该专化型菌株与其它专化型致病菌差异的RAPD标记S58-519和SCAR标记SCAS58-519，该标记可以鉴别出尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原物，在尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株的鉴定中具有重要作用，为建立尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原菌的特异、快速、高灵敏度、稳定可靠的分子检测技术体系奠定了基础。应用本发明可克服常规鉴定、鉴别尖孢镰刀菌苦瓜专化型病菌工作量大、周期长的缺点，实现了病原物的快速、准确鉴定和检测。
附图说明
图1是本发明的随机引物S58对24个不同葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株的RAPD-PCR扩增图谱；其中，M：DNA Ladder；1-24：表1中的1-24号菌株；CK：空白对照；图中箭头指示条带是S58-519。
图2是本发明的SCAS58-519标记对48个不同葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株的SCAR-PCR扩增图谱；其中，M：DNA ladder；1-11和2548：尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株；12-14：表2中1-3号菌株；15-16：表1中1-2号菌株；17-18：表2中34号菌株；19-20：表1中6-7号菌株；21：表1中5号菌株；22-24：表1中8-10号菌株；CK：空白对照；图中箭头指示条带是SCAS58-519条带。
图3是SCAS58-519标记对人工接种15d后苦瓜幼苗植株的不同部位组织总DNA的检测扩 增图谱；其中，M：DNA ladder；1-10：分别为接种幼苗的根部，根茎基部，子叶下部茎组织，子叶茎节部，子叶节上部茎，真叶节部，真叶叶柄，真叶，上部茎，上部叶；CK：空白对照。
图4是SCAS58-519标记对苦瓜田间枯萎病发病植株的不同部位组织总DNA的检测扩增图谱；其中，M：DNA ladder；1-12：分别为植株根部，根茎基部，子叶下部茎组织，子叶茎节部，子叶节上部茎，真叶节部，真叶叶柄，真叶，植株中部茎，植株中部叶，上部茎，上部叶；CK：空白对照。
图5是SCAS58-519标记对采集自不同地区的苦瓜枯萎病发病植株的根系组织总DNA的检测扩增图谱；其中，M：DNA ladder；1-8：样品来源地是广东清远市；9-16：样品来源地是广东湛江市；17-24：样品来源地是湖南衡阳市；25-30：样品来源地是广西南宁市五塘镇；31-48：样品来源地是广西农科院蔬菜所试验基地；CK：空白对照。
具体实施方式
发明人通过开展不同葫芦科枯萎病菌专化型菌株的RAPD标记遗传多样性研究试验，筛选、克隆和测序尖孢镰刀菌苦瓜专化型病菌的特异条带，对专一的RAPD标记设计特异引物，将该RAPD标记转换为SCAR标记，对SCAR标记的特异性进行验证，从而建立了尖孢镰刀菌苦瓜专化型分子标记快速鉴别技术体系。
1．实验材料
（1）尖孢镰刀菌菌株
24个不同葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株（见表1），用于RAPD标记的遗传多样性研究以及SCAR标记的特异性检测。
表1 葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株
| 编号 | 菌株名称 | 地理来源 | 菌株学名 |
| 1 | CGMCC32830 | Unknow | Fusarium oxysporium f.sp cucumerinum |
| 2 | ACCC30220 | Beijing | Fusarium oxysporiumf. sp.cucumerinum |
| 3 | ACCC31354 | Hainan | Fusarium oxysporium f. spniveum |
| 4 | FONZH133 | Zhengzhou,Henan | Fusarium oxysporiumf. spniveum |
| 5 | FomXJ151 | Xinjiang | Fusariumoxysporum f. spmelonis |
| 6 | FJAT173 | Fuzhou,Fujian | Fusariumoxysporum f. splagenariae |
| 7 | FJAT175 | Fuzhou,Fujian | Fusarium oxysporum f.sp.lagenariae |
| 8 | FLUGD1 | Guangzhou,Guangdong | Fusarium oxysporum f. spluffae |
| 9 | FLUGD2 | Guangzhou,Guangdong | Fusarium oxysporumf. spluffae |
| 10 | FBENX102 | Nanning,Guangxi | Fusarium oxysporum f. spbenincasae |
| 11 | FBENN5 | Nanning，Guangxi | Fusarium oxysporum f. spbenincasae |
| 12 | FJAT3011 | Fuzhou,Fujian | Fusarium oxysporum f.spMomordicae |
| 13 | FJAT3015 | Fuzhou,Fujian | Fusarium oxysporum f. spMomordicae |
| 14 | FOMGD1 | Guangzhou,Guangdong | Fusariumoxysporum f.spMomordicae |
| 15 | FOMGD2 | Guangzhou,Guangdong | Fusariumoxysporumf.spMomordicae |
| 16 | FOMHY1 | Hengyang,Hunan | Fusarium oxysporumf.spMomordicae |
| 17 | FOMHY2 | Hengyang,Hunan | Fusariumoxysporumf. spMomordicae |
| 18 | FOMWT1 | Nanning,Guangxi | Fusariumoxysporumf.spMomordicae |
| 19 | FOMWT2 | Nanning,Guangxi | Fusariumoxysporumf.spMomordicae |
| 20 | FOMAS8 | Nanning,Guangxi | Fusariumoxysporumf.spMomordicae |
| 21 | FOMAS9 | Nanning，Guangxi | Fusarium oxysporumf.spMomordicae |
| 22 | FOMAS10 | Nanning,Guangxi | Fusariumoxysporumf. spMomordicae |
| 23 | FOMAS11 | Nanning,Guangxi | Fusariumoxysporumf.spMomordicae |
| 24 | FOMAS12 | Nanning,Guangxi | Fusariumoxysporum f.spMomordicae |
（2）镰刀菌属的其他菌株
3个尖孢镰刀菌的镰刀菌属近缘菌株（见表2），用于SCAR标记的特异性检测。
表2 镰刀菌属近缘菌株
| 编号 | 菌株名称 | 地理来源 | 菌株学名 |
| 1 | CGMCC32889 | Unknow | Fusarium solani |
| 2 | ACCC36241 | Jinan | Fusarium solani |
| 3 | CGMCC34759 | Unknow | Fusarium moniliforme |
| 4 | ACCC30024 | Unknow | Fusariumoxysporium f..spniveum |
| 5 | FON8 | Nanning | Fusariumoxysporium f. spniveum |
（3）检测样品
人工接种的品种为感病品种“桂农科二号”苦瓜；田间发病的植株样品采集自不同地区的苦瓜种植基地。
人工接种采用浸根法：育苗前先用0.1%升汞液进行种子消毒，经灭菌水冲洗后播种至灭菌基质中，待苗长至两叶一心时，将苗轻轻拔出洗净根部，将其放入浓度为1×106cfu·mL-1的病原菌孢子悬浮液中浸根30min，然后移至装有灭菌基质的营养钵，移到温度为26～28℃的温室中，以清水作对照；接种15d后采集发病植株用于检测。
2．RAPD标记的建立
RAPD-PCR反应体系共25μL：12.5μL2×Es Taq MasterMix(含有2×Es Taq PCRBuffer，3mM MgCl2，Es Taq酶和400μM dNTP Mix)，2.0μL随机引物(10μmol·L-1)，30ng模板DNA，8.5μL ddH2O。
扩增反应在TProfessional PCR仪(德国Biometra公司)上进行，反应程序如下：94℃预变性10min；94℃变性1min，36.9/41℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。取5μLPCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测， 在凝胶成像系统上观察并拍照。
总共选用了320条RAPD随机引物进行尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株特异条带的扩增筛选。经分析RAPD-PCR指纹图谱特征，发现其中随机引物S58在尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株（表1中12－24号菌株）中扩增出一条多态性条带，片段大小约为500bp，而其他尖孢镰刀菌专化型菌株缺失该条带，结果见图1。重复实验证明这一条带具有尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株的专一代表性、特异性和稳定性，能够区分该专化型菌株与其它专化型致病菌，可作为转换为SCAR标记的选择标记。
3．SCAR标记的建立
采用天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收纯化体系对RAPD引物扩增的目标条带进行回收纯化。RAPD-PCR产物与载体的链接采用TaKaRa宝生物工程有限公司(中国大连)的pMD18-T vector系统。参照《分子克隆实验指南》的方法进行重组质粒的转化、筛选和检测。阳性克隆用于质粒提取，委托上海生工生物技术有限公司进行RAPD标记测序（见序列表SEQ.ID.No.1，定名为S58-519）及SCAR引物的合成。
根据测序结果，设计的SCAR引物对：
F:5'–TGAGAGCCAACGCAGCATAGC–3'（见序列表SEQ.ID.No.3），
R:5'–CGGCACCTTCAACCATACCTAAACT–3'（见序列表SEQ.ID.No.4）。
SCAR扩增反应体系共25μL：12.5μL2×Es Taq MasterMix（北京康为世纪生物科技有限公司，含有2×Es Taq PCR Buffer，3mM MgCl2，Es Taq Polymerase和400μM dNTPMix)，1.0μL Primer1(10μmol·L-1)，1.0μL Primer2(10μmol·L-1)，2.0μL模板DNA（15ng/μL），8.5μL ddH2O。
扩增反应在TProfessional PCR仪(德国Biometra公司)上进行，反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。
用引物对F/R进行SCAR-PCR扩增，扩增部分结果如图2所示：扩增结果条带清晰稳定，对该扩增条带进行测序，测序结果表明其与RAPD标记S58-519序列中的第1-256位碱基完全对应（见序列表SEQ.ID.No.2），将其命名为SCAS58-519。说明RAPD标记S58-519成功转化为特异、专一的SCAR标记SCAS58-519。
4．SCAR标记的应用
本发明获得的SCAS58-519标记在实验过程中经过对不同葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌专化型菌株（见图3）、人工接种植株样品（见图4）及采集田间发病植株样品（见图 5）按上述SCAR-PCR快速检测体系进行验证，充分证实了该标记的特异性和专一性，可以直接用作尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株鉴别的标记。
具体验证结果见图3至图5。
（1）图3是用引物F/R对接种了尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株15天后的苦瓜植株根、茎、叶的DNA进行扩增，结果表明在接种15天后苦瓜的根、茎、叶样品中多数植株部位可以扩增得到的特异PCR产物（SCAS58-519标记），泳道6（真叶节部）的条带亮度较弱，仍为扩增得到的特异PCR产物。而真叶叶柄（泳道7）、真叶（泳道8）、上部叶（泳道10）及清水对照未扩增出特异PCR产物。图3结果说明了所建立的检测体系能够检测人工接种感病的苦瓜植株。真叶叶柄、真叶、上部叶未扩增出特异PCR产物的原因可能与病原菌在植株体内转移和分布存在差异有关。
（2）图4是用引物F/R对苦瓜田间枯萎病发病植株的不同部位组织DNA的检测扩增图谱。结果表明，引物F/R可以从发病植株的绝大多数部位检测得到256bp条带（SCAS58-519标记），泳道7（真叶叶柄）的条带亮度较弱，仍为扩增得到的特异PCR产物。而植株真叶（泳道10）、上部叶（泳道12）和清水对照未扩增出特异PCR产物。图4结果说明了所建立的检测体系能够检测田间感病显症的苦瓜植株。
（3）图5是用引物F/R对采集自不同地区的苦瓜枯萎病显症植株的根系组织DNA进行PCR扩增。结果表明48个样品均检测为阳性，条带大小为256bp（SCAS58-519标记）。
Claims (7)
1.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58-519，其特征在于是序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
2.根据权利要求1所述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58-519在尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株鉴定及苦瓜枯萎病发病组织检测中的应用。
3.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58-519，其特征在于是序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58-519，其特征在于扩增该标记的引物对是序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。
5.根据权利要求4所述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58-519在尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株鉴定及苦瓜枯萎病发病组织检测中的应用。
6.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型PCR快速检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列的引物对Primer1和Primer2。
7.根据权利要求6所述的尖孢镰刀菌苦瓜专化型PCR快速检测方法，其特征在于该检测
方法PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：
反应体系共25μL：12.5μL2×Es Taq MasterMix，内含2×Es Taq PCR Buffer、3mMMgCl2，Es Taq Polymerase和400μM dNTP Mix；1.0μL浓度10μmol·L-1的Primer1，1.0μL浓度10μmol·L-1的Primer2；2.0μL浓度15ng/μL的模板DNA，8.5μL ddH2O；
扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。
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Granted publication date: 20140723 Termination date: 20210128 |