CN111304357A - 尖孢镰刀菌苦瓜专化型lamp可视化检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测引物组，包括引物FoM‑F3‑1和引物FoM‑B3‑1、引物FoM‑FIP‑1和引物FoM‑BIP‑1。据此，发明研制了相应试剂盒并建立了相应检测方法。应用本发明无需电泳和紫外观察等步骤，只需水浴锅或恒温箱反应60min，即可通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，灵敏度可达5.6pg/μL。本发明为解决尖孢镰刀菌苦瓜专化型早期的快速检测，提供了一种LAMP可视化检测方法，其灵敏度高、特异性好，能准确鉴定植株、种子等上的尖孢镰刀菌苦瓜专化型，而且高效、快速、便捷、低成本、易操作，适合基层快速诊断，对苦瓜枯萎病的早期诊断和有效防控的具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于LAMP检测技术领域，尤其涉及一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法及其试剂盒。
背景技术
尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momordicae nov.f.)，属半知菌亚门真菌，是苦瓜枯萎病的病原菌。病菌以厚垣孢子或菌丝体在土壤、肥料中越冬，成为翌年主要初侵染源，病部产生的大、小分生孢子通过灌溉水或雨水飞溅，从植株地上部的伤口侵入，并进行再侵染。连作地或施用未充分腐熟的土杂肥，地势低洼、植株根系发育不良，天气湿闷发病重。由于常年连作，苦瓜枯萎病已成为苦瓜生产中主要病害，并有迅速蔓延的趋势。目前，对于苦瓜枯萎病尚未发现很好的特效药，主要以预防为主，在发病前或发病初期使用异菌脲、甲基硫菌灵、五氯硝基苯、多菌灵、恶霉灵、百菌清等化学药剂进行防治，发病中后期药剂对枯萎病基本无明显效果，导致严重的经济效益损失。因此，早期快速检测尖孢镰刀菌苦瓜专化型的方法尤为重要，可为苦瓜枯萎病的防治赢得宝贵时间。
环介导等温扩增技术(LAMP，Loop-mediated isothermal amplification)，是2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等病毒、细菌、寄生虫疾病的检测中，通过早期快速诊断对防止病症快速蔓延起到了积极作用。LAMP技术具有高特异性、高灵敏度的优点，而且操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
目前，尖孢镰刀菌的检测通常采用传统的形态特征鉴定方法、普通PCR检测法、real-time PCR检测法等。陈振东等公开了尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记和由该标记转化得到的SCAR标记以及这些分子标记在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用；李欣等建立了尖孢镰刀菌的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法；刘迪秋等发明了一种三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的Real-time PCR检测引物及检测方法；车团结等发明了一种用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组；曹月霞尖建立了孢镰刀菌西瓜专化型分子检测技术。然而，这些检测方法均要使用昂贵的仪器设备，如PCR仪、荧光定量PCR仪等，而且其程序繁琐，不适于一些资源有限的实验室和生产上的基层工作者。
尖孢镰刀菌种内存在显著的遗传分化，如营养体亲和群(VCG)、生理小种或专化型。因此，利用LAMP技术鉴别不同专化型的尖孢镰刀菌时，需要寻找并发现不同专化型的特异性片段序列，并针对其设计特异性、灵敏度优良的特异性引物，才能实现准确识别和鉴定不同专化型尖孢镰刀菌，这对种内分离物之间的基因组序列同源性相当高的尖孢镰刀菌种而言要求非常高。因此，目前利用LAMP技术进行尖孢镰刀菌检测的研究报道很少，邓晟发明了基于Lamp技术对尖孢镰刀菌莲专化型病原菌的检测方法；杨雷亮等发明了一种同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的LAMP方法。然而，尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP检测技术尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、准确性好且高效快捷、经济实用的尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法及其试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测引物组，包括引物FoM-F3-1和引物FoM-B3-1、引物FoM-FIP-1和引物FoM-BIP-1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
该试剂盒中含有权利要求1所述的引物组。
该试剂盒含有以下试剂：反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、引物组、荧光目视检测试剂、尖孢镰刀菌苦瓜专化型基因组DNA和去离子水。
一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法，利用引物组进行环介导恒温扩增反应；引物组包括引物FoM-F3-1和引物FoM-B3-1、引物FoM-FIP-1和引物FoM-BIP-1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
扩增反应的反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，引物FoM-FIP-1/FoM-BIP-1/FoM-F3-1/FoM-B3-1各1μL，荧光目测检测试剂1μL，模板DNA 2μL,补水至25μL，并以尖孢镰刀菌苦瓜专化型基因组DNA作为阳性对照，以去离子水作为阴性对照；
扩增反应的反应程序为：64℃恒温60min,在80℃下恒温5min或在95℃下恒温2min，使酶灭活以终止反应。
针对尖孢镰刀菌分型多同源性高、尖孢镰刀菌苦瓜专化型缺乏便捷有效检测手段的问题，发明人从尖孢镰刀菌苦瓜专化型的特异性片段入手，设计并筛选出其LAMP特异性引物，包括引物FoM-F3-1和引物FoM-B3-1、引物FoM-FIP-1和引物FoM-BIP-1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。据此，发明研制了相应试剂盒并建立了相应检测方法。应用本发明检测尖孢镰刀菌苦瓜专化型，无需电泳和紫外观察等步骤，只需水浴锅或恒温箱反应60min，即可通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，显色结果绿色为阳性，淡橙色为阴性，灵敏度可达5.6pg/μL。因此，本发明为解决尖孢镰刀菌苦瓜专化型早期的快速检测，提供了一种LAMP可视化检测方法，其灵敏度高、特异性好，能准确鉴定植株、种子等上的尖孢镰刀菌苦瓜专化型，而且高效、快速、便捷、低成本、易操作，适合基层快速诊断，对苦瓜枯萎病的早期诊断和有效防控的具有重要意义。
附图说明
图1是特异性引物FOMM-SPF/FOMM-SPR PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图，图中：M为Marker(DL2000)；1为清水CK；2、3、5、7为尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株；4为哈茨木霉菌；6为炭疽菌；8为尖孢镰刀菌古巴专化型；9、14为尖孢镰刀菌冬瓜专化型；10-11为腐皮镰刀菌；12为尖孢镰刀菌黄瓜专化型；13、15-17为尖孢镰刀菌西瓜专化型；18为尖孢镰刀菌甜瓜专化型。
图2是FoM-1、FoM-3引物(含环引物)初步筛选验证曲线图。
图3是FoM-3引物(含环引物)特异性曲线图。
图4是FoM-3引物(含一条LF环引物)特异性曲线图。
图5是FoM-3引物(不含环引物)特异性曲线图。
图6是FoM-1引物(不含环引物)特异性曲线图。
图7是尖孢镰刀菌苦瓜专化型特异性曲线图。
图8是尖孢镰刀菌苦瓜专化型特异性检测紫外光显示结果图，图中：1为尖孢镰刀菌苦瓜专化型阳性对照；2-5为尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株；6为尖孢镰刀菌甜瓜专化型；7为尖孢镰刀菌黄瓜专化型；8-9为尖孢镰刀菌冬瓜专化型；10为尖孢镰刀菌古巴专化型；11为腐皮镰孢菌；12为清水阴性对照。
图9是尖孢镰刀菌苦瓜专化型特异性检测自然光显示结果图，图中：1为尖孢镰刀菌苦瓜专化型阳性对照；2-5为尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株；6为尖孢镰刀菌甜瓜专化型；7为尖孢镰刀菌黄瓜专化型；8-9为尖孢镰刀菌冬瓜专化型；10为尖孢镰刀菌古巴专化型；11为腐皮镰孢菌；12为清水阴性对照。
图10是LAMP灵敏度曲线图。
图11是LAMP灵敏度检测紫外光显示结果图，图中：1-7DNA浓度分别为56ng/μL、5.6ng/μL、560pg/μL、56pg/μL、5.6pg/μL、560fg/μL、56fg/μL；8为清水对照。
图12是LAMP灵敏度检测自然光显示结果图，图中：1-7DNA浓度分别为56ng/μL、5.6ng/μL、560pg/μL、56pg/μL、5.6pg/μL、560fg/μL、56fg/μL；8为清水对照。
具体实施方式
实施例1尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP特异性引物设计及筛选
选取特异性引物FOMM-SPF(5'AAGGATAACGAGGCTAGCT 3'，SEQ.ID.No.12)/FOMM-SPR(5'GTATAGAGCATCTAGACACGAATGC 3'，SEQ.ID.No.13)进行PCR扩增，获得大小为293bp的特异性片段(图1)，切胶回收特征条带，经测序该片段序列为序列表SEQ.ID.No.14。
1.LAMP特异性引物设计
利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer(http://primerexplorer.jp/e/index.html)，根据尖孢镰刀菌苦瓜专化型特异性片段序列，设计出2套特异性引物FoM-1、FoM-3，序列如下：
FoM-F3-1：CGAGGCTAGCTAGCGTGA(SEQ.ID.No.1)
FoM-B3-1：CTCTAGAGGCGAGGGAGAG(SEQ.ID.No.2)
FoM-FIP-1：AGCTGATGGCTCGACGAGCTGAGGATGCTCTTTGCCAACC(SEQ.ID.No.3)
FoM-BIP-1：CCTGTTTTTGTAGCACCACCGCTGCTCGGCAGAGAACATCT(SEQ.ID.No.4)
FoM-LB-1：AGATTGTTGAGGCTCATAAGCGT(SEQ.ID.No.5)
FoM-F3-3：TCAGCTCTGCCTCTTCGT(SEQ.ID.No.6)
FoM-B3-3：GCGTCAACAATCTTGCGATAG(SEQ.ID.No.7)
FoM-FIP-3：CGGCAGAGAACATCTAGACACGCCCCCTGTTTTTGTAGCACCA(SEQ.ID.No.8)
FoM-BIP-3：ACCCTCTCCCTCGCCTCTAGGCTACAGAACCAGGGGAATT(SEQ.ID.No.9)
FoM-LF-3：TGAGCCTCAACAATCTTGCGG(SEQ.ID.No.10)
FoM-LB-3：CTCGTCGAGCCATCTGCTC(SEQ.ID.No.11)
2.FoM-1、FoM-3引物(含环引物)初步筛选验证
选用尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株2份(FOM4505、FOM4507)与尖孢镰刀菌非苦瓜专化型菌株3份(西贡蕉FOP1、西3、冬枯-2)进行初步筛选，清水做对照。具体菌株信息详见表1。
图2结果显示，64℃反应60min，含有环引物的FoM-1、FoM-3引物都能检测出FOM4505、FOM4507尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株，但FoM-1引物也将非苦瓜专化型菌株冬枯-2检出，因此需进行去除环引物等进一步验证。
3.FoM-3引物特异性实验
选用尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株8份(FOM4501、FOM4503、FOM4513、FOM4515、FOM4517、FOM4529、FOM4533、FOM4534)与尖孢镰刀菌非苦瓜专化型菌株10份(CGMCC3.4604、西1、西2、西3、ACCC30024、西贡蕉FOP1、冬枯-2、南冬枯106、甜1、ACCC30220)进行引物特异性分析，清水做对照。具体菌株信息详见表1。
①FoM-3引物(含环引物)
图3结果显示，64℃反应60min，FoM-3引物(含环引物)能将FOM4501、FOM4503、FOM4513、FOM4515、FOM4517、FOM4529、FOM4533、FOM4534等尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株检测出；另外西1、冬枯-2、ACCC30220等3个非尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株亦被检测出，其他7个非尖孢镰刀菌苦瓜专化型未检测出。
②FoM-3引物(含一条LF环引物，少量样本)
图4结果显示，64℃反应60min，FoM-3引物(含一条LF环引物)能将FOM4501尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株检测出；但西1、冬枯-2等2个非尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株仍被检测出，需进一步进行去掉环引物实验。
③FoM-3引物(不含环引物，少量样本)
图5结果显示，64℃反应60分钟，FoM-3引物(不含环引物)能将FOM4553、FOM4528、FOM4567、FOM4571等尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株检测出；但西1、冬枯-2等2个非尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株仍被检测出，其他8个非尖孢镰刀菌苦瓜专化型未检测出。故舍弃FoM-3引物。
4.FoM-1引物(不含环引物)特异性实验
选用尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株6份(FOM4501、FOM4503、FOM4513、FOM4515、FOM4517、FOM4505)与尖孢镰刀菌非苦瓜专化型菌株10份(CGMCC3.4604、西1、西2、西3、ACCC30024、西贡蕉FOP1、冬枯-2、南冬枯106、甜1、ACCC30220)进行引物特异性分析，清水做对照。具体菌株信息详见表1。
图6结果显示，64℃反应60min，FoM-1引物(不含环引物)能将FOM4501、FOM4503、FOM4513、FOM4515、FOM4517、FOM4505等尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株检测出；CGMC3.4.604、西1、西2、西3、西贡蕉FOP1、ACCC30024、冬枯-2、南冬枯106、甜1、ACCC30220等10个非尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株未被检测出，特异性良好，说明FoM-1引物(不含环引物)为尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP特异性引物。
实施例2尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP特异性检测
选取尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株44份(由广西农业科学院蔬菜研究所VRI,GXAAS提供)，尖孢镰刀菌甜瓜专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型等非尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株10份(部分从中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC、中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC购买，部分由广西农业科学院蔬菜研究所提供)，详见表1，利用本发明尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法进行检测，以尖孢镰刀菌苦瓜专化型基因组DNA作为阳性对照，以清水(去离子水)作为阴性对照。
表1检测菌株信息
1.检测步骤
(1)PDA平板活化待检测菌株；
(2)收集PDA平板上的菌落并离心，提取DNA；
DNA提取：在液化氮或冰浴中将真菌组织研磨粉碎；取不多于50mg磨碎的真菌组织，放入1.5或2.0ml微量离心管中；加400μl LE Buffer，并混合均匀；于65℃环境中温浴15～30min(温育过程中可间或振荡离心管2～3次)，然后移出；加入130μl DA Buffer，混合均匀后于冰浴中放置5min；于14,000x g离心3min；将上清液转移到一个新的1.5ml离心管；加750μl或滤液体积1.5倍的E Binding Buffer，并混合均匀；将混合液体转移至Spincolumn，于6,000x g离心1min，并弃去接液管中液体，由于混合液体体积大于750μl，分2次离心过柱；向Spin column中加入500μl的G Binding Buffer。于10,000xg离心30s，并弃去接液管中液体；Spin column中加入600μl的Wash Buffer，于10,000xg离心30s，并弃去接液管中液体；重复在Spin column中加入600μl的Wash Buffer，于10,000xg离心30s，并弃去接液管中液体；再次将Spin column于10,000xg离心1min，并将Spin column转移至一个新的1.5ml离心管；向Spin column中加入100μl至200μl Elution Buffer，并于室温温育1min；于12,000x g离心1min，并弃去Spin column；DNA提取完成，于-20℃保存。
(3)制备LAMP扩增试剂；
(31)2×反应缓冲液为：Tris－HCl(pH8.8)40mM、KCl 20mM、MgSO4 16mM、(NH4)2SO4 20mM、Tween20 0.2％、Betaine 1.6M、dNTPs 2.8mM每种。
(32)取-20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立刻置于冰上保存。
(33)预混溶液的配制(在冰上进行)：取试验所需的反应量，2×反应缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，引物(FoM-FIP-1/FoM-BIP-1/FoM-F3-1/FoM-B3-1)各1μL，荧光目测检测试剂1μL(荣研生物科技(中国)有限公司生产，型号SLP221)，分装入另行准备的预混溶液配制用灭菌试管中，轻击试管，使其混合或用旋涡混合器经1s×3次搅拌进行充分混合后，放入简易微量离心机中离心数秒。配制好的预混溶液立即使用。
(34)预混溶液和样本溶液的混合(在冰上进行)：向反应试管中分别加入上述样本反应及对照反应所需的预混溶液各23μL，添加样本溶液2μL，使总量达25μL。对照反应中，阴性对照反应使用去离子水(DW)2μL，阳性对照反应使用阳性对照DNA(PC DNA)2μL。用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心。混合时请注意不要产生气泡。
(4)LAMP扩增：2×反应缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，引物(FoM-FIP-1/FoM-BIP-1/FoM-F3-1/FoM-B3-1)各1μL，荧光目测检测试剂1μL(荣研生物科技(中国)有限公司生产，型号SLP221)，模板DNA 2μL，补水至25μL，并以尖孢镰刀菌苦瓜专化型基因组DNA作为阳性对照，以清水作为阴性对照；
(5)将已配制好、分装完毕的反应试管置于水浴锅或恒温器(温度精度在±0.5℃以内，带有保温机罩)中，在64℃下恒温60min，在80℃下恒温5min或在95℃下恒温2min，使酶灭活以终止反应；
(6)实时浊度检测：使用
等温扩增实时浊度仪LA-320c进行实时检测；
(7)荧光目视检测：直接通过肉眼观察反应管中显色情况获得，显色结果绿色为阳性，淡橙色为阴性。
2.检测结果
通过观察紫外光及自然光下的显示结果，阳性对照和44份尖孢镰刀菌苦瓜专化型样本显色结果为绿色，阴性对照和10份非尖孢镰刀菌苦瓜专化型显色结果为淡橙色(图8、9)，与特异性曲线(图7)结果一致，说明该方法能准确检测出尖孢镰刀菌苦瓜专化型，具有很强的特异性。
实施例3尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法的灵敏度检测
1.灵敏度检测
(1)PDA平板活化尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株；
(2)收集PDA平板上的菌落并离心，按上述方法提取DNA；
(3)按上述方法制备LAMP扩增试剂；
(4)将DNA浓度稀释成56ng/μL、5.6ng/μL、560pg/μL、56pg/μL、5.6pg/μL、560fg/μL、56fg/μL，7个梯度；
(5)LAMP扩增：2×反应缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，引物(FoM-FIP-1/FoM-BIP-1/FoM-F3-1/FoM-B3-1)各1μL，荧光目测检测试剂1μL(荣研生物科技(中国)有限公司生产，型号SLP221)，模板DNA 2μL，补水至25μL；
(6)将已配制好、分装完毕的反应试管置于水浴锅或恒温器(温度精度在±0.5℃以内，带有保温机罩)中，在64℃下恒温60min，在80℃下恒温5min或在95℃下恒温2min，使酶灭活以终止反应；
(7)实时浊度检测：使用
等温扩增实时浊度仪LA-320c进行实时检测；
(8)荧光目视检测：显色结果绿色为阳性，淡橙色为阴性。
2.检测结果
如图11和图12所示，DNA浓度为56ng/μL、5.6ng/μL、560pg/μL、56pg/μL、5.6pg/μL显示结果均为绿色，560fg/μL、56fg/μL显示结果为淡橙色，表明本发明的检测方法具有很高的检测灵敏度，最低检测极限为5.6pg/μL。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法及其试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaggctagc tagcgtga 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctagaggc gagggagag 19
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctgatggc tcgacgagct gaggatgctc tttgccaacc 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgtttttg tagcaccacc gctgctcggc agagaacatc t 41
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agattgttga ggctcataag cgt 23
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcagctctgc ctcttcgt 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgtcaacaa tcttgcgata g 21
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggcagagaa catctagaca cgccccctgt ttttgtagca cca 43
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accctctccc tcgcctctag gctacagaac caggggaatt 40
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgagcctcaa caatcttgcg g 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcgtcgagc catctgctc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaggataacg aggctagct 19
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtatagagca tctagacacg aatgc 25
<210> 14
<211> 293
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaggataacg aggctagcta gcgtgagagg atgctctttg ccaaccaccc tttcattccc 60
ctcaagagct cgtcgagcca tcagctctgc ctcttcgtgt ttcccctgtt tttgtagcac 120
caccgcaaga ttgttgaggc tcataagcgt gtctagatgt tctctgccga gcaccctctc 180
cctcgcctct agagctcgtc gagccatctg ctcggcttcc tcaaaattcc cctggttctg 240
tagcactatc gcaagattgt tgacgcttgc attcgtgtct agatgctcta tac 293
Claims (5)
1.尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测引物组，其特征在于包括引物FoM-F3-1和引物FoM-B3-1、引物FoM-FIP-1和引物FoM-BIP-1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
2.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中含有权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、引物组、荧光目视检测试剂、尖孢镰刀菌苦瓜专化型基因组DNA和去离子水。
4.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法，其特征在于利用引物组进行环介导恒温扩增反应；所述引物组包括引物FoM-F3-1和引物FoM-B3-1、引物FoM-FIP-1和引物FoM-BIP-1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法，其特征在于：所述扩增反应的反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，引物FoM-FIP-1/FoM-BIP-1/FoM-F3-1/FoM-B3-1各1μL，荧光目测检测试剂1μL，模板DNA 2μL,补水至25μL，并以尖孢镰刀菌苦瓜专化型基因组DNA作为阳性对照，以去离子水作为阴性对照；
扩增反应的反应程序为：64℃恒温60min,在80℃下恒温5min或在95℃下恒温2min，使酶灭活以终止反应。
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