CN113025740A - 一种用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一个可并行检测工业大麻属样本17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的引物组合物、试剂盒和方法，其中，17个常染色体STR基因座包括D02‑CANN1、C11‑CANN1、4910、B01‑CANN1、E07‑CANN1、9269、B05‑CANN1、H06‑CANN2、5159、nH09、ANUCS 501、CS1、ANUCS 305、3735、ANUCS 302、1528和9043，2个性别鉴定位点为DM029和DM016；引物组合物包括SEQ ID NO.1～38所述序列。本发明所提供的含有荧光标记的可并行检测工业大麻属样本17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的引物组合物、试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性好、稳定性强及准确性高等特点，为我国工业大麻的法医学研究中性别鉴定、个体识别、来源地推断、STR数据库的建立提供了一个全新的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及分子鉴定技术领域，尤其涉及一种用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、试剂盒和方法。
背景技术
工业大麻是属于工业大麻科(Cannabinaceae)工业大麻属(Cannabis)的一年生雌雄异株的草本植物，主要分布于欧洲、非洲和亚洲的尼泊尔、印度、中国等地区，是地球上最古老的栽培作物之一。工业大麻纤维是良好的纺织和造纸原料，植株内含有的工业大麻素被广泛应用于医药卫生领域，种子中富含人体易吸收的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸以及微量元素等多种营养成分，已成为许多国家重要的经济作物。
细胞学研究表明，工业大麻为含有20条染色体(其中18条为常染色体,2条为性染色体)的二倍体植物，雌株染色体型为XX，雄株染色体型为XY。
随着分子生物学技术的快速发展，在DNA水平上对工业大麻进行鉴定逐渐成为一种研究热点和新的技术手段。目前，对于工业大麻DNA遗传标记的研究主要集中在RAPD、AFLP、SCAR、DNA条形码和STR等方面。研究资料表明： RAPD、AFLP和SCAR遗传标记可以对工业大麻进行种属及性别鉴定；DNA条形码可以准确的鉴别工业大麻及其混伪品，但上述遗传标记均不能对工业大麻进行个体化识别及地域来源推断。
短串联重复序列STR是由2～6bp的核心序列串联组成的寡核苷酸序列，因其具有高灵敏度、高鉴别能力、高种属特异性、结果的高度准确性以及易于标准化等优点，被广泛应用于司法鉴定领域的个体识别、亲缘鉴定和群体调查，并成为司法鉴定中应用最广泛的遗传标记。基于此，一些法庭科学家尝试将STR遗传标记应用到工业大麻的鉴定研究中，并证明了STR遗传标记在鉴别工业大麻、区分工业大麻品种和工业大麻来源地推断等方面的潜力。目前，国内外发现和报道的工业大麻STR基因座共有28个。2003年，Hsieh等报道了第一个工业大麻STR基因座CS1，并在108个工业大麻样本中观察到该基因座的重复次数从3～40 次不等，杂合度约为87.04％，证明了CS1基因座具有高度多态性。之后更多的工业大麻多态性STR基因座被开发出来，如Alghanim等开发了C11-CANN1、 B01-CANN1和D02-CANN1等11个具有多态性的工业大麻STR基因座，Valverde 等开发了5159、4910和1528等6个四碱基重复的工业大麻STR基因座，这也是首次报道的四碱基重复工业大麻STR基因座。基于不断开发的工业大麻STR 基因座，工业大麻STR基因座复合扩增体系的研究也随之展开。2008年，Howard 等成功构建了具有10个STR基因座的复合扩增体系，并首次根据DNA分析方法科学工作组(Scientific Working Group for DNA Analysis Methods,SWGDAM) 验证指南，对该体系进行灵敏度、稳定性和物种特异性等验证研究，结果表明，该体系可用于工业大麻STR遗传数据库的建立。Houston等对前期研究报道的工业大麻STR进行筛选并结合Valverde等开发的6个四碱基重复STR，成功构建了13个基因座的STR复合扩增体系，这也是目前被研究及应用最多的体系。我国工业大麻STR基因座的研究才刚刚起步。2008年，马原等选取扩增条件相近、杂合度较高的3个基因座ANUCS 301、ANUCS 305和CS1进行工业大麻个体和群体遗传多态性的调查。
综上，对于工业大麻DNA的研究较少，涉及到个体识别及来源地推断的研究更是十分稀少。国外关于工业大麻STR复合扩增体系的研究处于初级阶段，在国内几乎没有对此进行研究。
发明内容
本发明为了填补国内工业大麻STR复合扩增体系研究的空白，为实现工业大麻性别鉴定、个体识别及来源地推断，为建立工业大麻STR数据库提供理论基础和检测方法，开发并建立了一个可并行检测工业大麻属样本17个常染色体 STR基因座和2个性别鉴定位点的引物组合物、试剂盒和方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物，包括工业大麻17个常染色体STR基因座的扩增引物和2个性别鉴定位点的扩增引物；其中，17个常染色体STR基因座包括D02-CANN1、C11-CANN1、4910、B01-CANN1、E07-CANN1、9269、B05-CANN1、H06-CANN2、5159、 nH09、ANUCS 501、CS1、ANUCS 305、3735、ANUCS 302、1528和9043，2 个性别鉴定位点为DM029和DM016。
进一步地，上述工业大麻17个常染色体STR基因座的扩增引物和2个性别鉴定位点的扩增引物的序列具体如下：
D02-CANN1：SEQ ID NO.1-2；C11-CANN1：SEQ ID NO.3-4；DM029： SEQ ID NO.5-6；DM016：SEQ ID NO.7-8；4910：SEQ ID NO.9-10；B01-CANN1： SEQ ID NO.11-12；E07-CANN1：SEQ ID NO.13-14；9269：SEQ ID NO.15-16； B05-CANN1：SEQ ID NO.17-18；H06-CANN2：SEQID NO.19-20；5159：SEQ ID NO.21-22；nH09：SEQ ID NO.23-24；ANUCS 501：SEQ ID NO.25-26；CS1： SEQ ID NO.27-28；ANUCS 305：SEQ ID NO.29-30；3735：SEQ ID NO.31-32； ANUCS302：SEQ ID NO.33-34；1528：SEQ ID NO.35-36；9043：SEQ ID NO. 37-38。
进一步地，每对扩增引物中至少一条引物采用荧光染料标记，该荧光染料选自FAM、HEX、TRMRA、ROX中的一种。
进一步地，D02-CANN1、C11-CANN1、DM029、DM016、4910、BO1-CANN1 的扩增引物采用FAM标记；E07-CANN1、9269、B05-CANN1、H06-CANN2、 5159、nH09的扩增引物采用HEX标记；ANUCS 501、CS1、ANUCS 305的扩增引物采用TRMRA标记；3735、ANUCS 302、1528、9043的扩增引物采用ROX 标记。
第二方面，本发明还提供了包括上述引物组合物的用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的试剂盒，其还包括4×PCR反应预混液Ⅶ和去离子水。
进一步地，上述4×PCR反应预混液Ⅶ由50mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mMMgCl2、0.2mM dNTPs、0.08mg/mL牛血清白蛋白(BSA)组成。
第三方面，本发明还提供了采用上述引物组合物或者试剂盒的用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的方法，具体用于工业大麻性别鉴定、个体识别和来源地推断；该方法包括如下步骤：
步骤一，采用SEQ ID NO.1-38所示序列的扩增引物对待测样品的基因组 DNA样本进行PCR复合扩增；
步骤二，取PCR扩增产物与适量的分子量内标、甲酰胺混匀；将混合物变性、冷却；
步骤三，采用遗传分析仪进行分型检测。
进一步地，上述PCR复合扩增的扩增体系的总体积为10μL，包括：4×PCR 反应预混液Ⅶ2.5μL，引物混合物(10μM)1μL，去离子水5.5μL，1ng/μL基因组DNA 1μL。
进一步地，上述扩增引物在扩增体系中的浓度分别如下：D02-CANN1： 0.03μM；C11-CANN1：0.03μM；DM029：0.05μM；DM016：0.03μM；4910： 0.04μM；B01-CANN1：0.06μM；E07-CANN1：0.05μM；9269：0.04μM； B05-CANN1：0.03μM；H06-CANN2：0.04μM；5159：0.04μM；nH09：0.04μM； ANUCS 501：0.05μM；CS1：0.05μM；ANUCS 305：0.05μM；3735：0.05μM； ANUCS 302：0.04μM；1528：0.05μM；9043：0.05μM。
进一步地，上述PCR复合扩增的程序为：95℃预变性2分钟；95℃变性5 秒，56℃退火1分钟，60℃延伸30秒，共28次循环；60℃终延伸5分钟；15℃保温。
进一步地，上述PCR复合扩增采用反应热循环仪；该反应热循环仪选自ABI 9700、ABI 9600、ABI2720、Bio-Rad iCycler和Bio-Rad C1000中的一种。
进一步地，分子量内标采用T500 Size Standard并采用LIZ荧光标记；荧光校正采用5-Dye Matrix Standards。
进一步地，步骤二中，PCR扩增产物、分子量内标和甲酰胺的体积比为 1:8.5:0.5。
进一步地，上述遗传分析仪选自3100系列、3130系列和3500系列遗传分析仪中的一种。
进一步地，步骤一还包括对待测样品的花、茎、叶和/或种子进行DNA提取制备基因组DNA样本。
进一步地，步骤二中变性的条件为95℃，3分钟；冷却的条件为冰上冷却3 分钟。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
1、本发明同时扩增工业大麻17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点，优于前期研究中最多含有15个基因座的复合扩增体系；且本发明首次尝试将性别鉴定位点加入到工业大麻STR复合扩增体系中。
2、本发明为工业大麻STR基因座的进一步研究、工业大麻STR数据库的建立、案件中工业大麻的检测鉴定提供了有效的方法。
3、本发明建立了一个灵敏度高、特异性好、稳定性强的法医学检测试剂盒，为工业大麻的性别鉴定、个体识别、来源地推断等提供有效的检测工具，其对满足工业大麻司法鉴定的需求具有重要意义。
附图说明
图1为本发明一实施例中复合扩增鉴定工业大麻多态性遗传标记的Ladder 分型图谱；
图2为本发明一实施例中用于工业大麻复合鉴定包含17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的复合扩增方法对雌性样本DNA的分型图谱；
图3为本发明一实施例中用于工业大麻复合鉴定包含17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的复合扩增方法对雄性样本DNA的分型图谱；
图4为本发明一实施例中用于工业大麻复合鉴定包含17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的复合扩增方法同一性研究的分型图谱；
图5为本发明一实施例中用于工业大麻复合鉴定包含17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的复合扩增方法灵敏度研究的结果图；
图6为本发明一实施例中用于工业大麻复合鉴定包含17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的复合扩增方法种属特异性研究的分型图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、试剂盒和方法，特别用于工业大麻性别鉴定、个体识别和来源地推断。该引物组合物包括工业大麻17个常染色体STR基因座的扩增引物和2个性别鉴定位点的扩增引物；其中，17个常染色体STR基因座包括D02-CANN1、C11-CANN1、4910、 B01-CANN1、E07-CANN1、9269、B05-CANN1、H06-CANN2、5159、nH09、ANUCS 501、CS1、ANUCS 305、3735、ANUCS 302、1528和9043，2个性别鉴定位点为DM029和DM016。
在本发明一优选的实施方式中，工业大麻17个常染色体STR基因座的扩增引物和2个性别鉴定位点的扩增引物的序列具体如下：
D02-CANN1：SEQ ID NO.1-2；C11-CANN1：SEQ ID NO.3-4；DM029： SEQ ID NO.5-6；DM016：SEQ ID NO.7-8；4910：SEQ ID NO.9-10；B01-CANN1： SEQ ID NO.11-12；E07-CANN1：SEQ ID NO.13-14；9269：SEQ ID NO.15-16； B05-CANN1：SEQ ID NO.17-18；H06-CANN2：SEQID NO.19-20；5159：SEQ ID NO.21-22；nH09：SEQ ID NO.23-24；ANUCS 501：SEQ ID NO.25-26；CS1： SEQ ID NO.27-28；ANUCS 305：SEQ ID NO.29-30；3735：SEQ ID NO.31-32； ANUCS302：SEQ ID NO.33-34；1528：SEQ ID NO.35-36；9043：SEQ ID NO. 37-38。
在本发明一优选的实施方式中，每对扩增引物中至少一条引物采用荧光染料标记，该荧光染料选自FAM、HEX、TRMRA、ROX中的一种。
在本发明一优选的实施方式中，D02-CANN1、C11-CANN1、DM029、DM016、 4910、BO1-CANN1的扩增引物采用FAM标记；E07-CANN1、9269、B05-CANN1、 H06-CANN2、5159、nH09的扩增引物采用HEX标记；ANUCS 501、CS1、ANUCS 305的扩增引物采用TRMRA标记；3735、ANUCS302、1528、9043的扩增引物采用ROX标记。
此外，试剂盒包括上述用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、4×PCR反应预混液Ⅶ和去离子水。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供一种用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的方法，包括如下步骤：
1.适用于法医学应用的工业大麻STR基因座的筛选；
依据文献报道和基因数据库，查找目前已开发的工业大麻STR基因座，但并不是所有的这些STR基因座都适用于工业大麻复合扩增体系的研究。筛选多态性STR基因座，剔除其中的二核苷酸重复的基因座。最终选择17个最优的常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点进行试剂盒开发，所述的基因座为 D02-CANN1、C11-CANN1、DM029、DM016、4910、B01-CANN1、E07-CANN1、 9269、B05-CANN1、H06-CANN2、5159、nH09、ANUCS 501、CS1、ANUCS 305、3735、ANUCS 302、1528和9043。其中性别鉴定位点DM029与X染色体相关，所有样本均出单一峰，性别鉴定位点DM016与Y染色体相关，所有雄性样本均出单一峰，雌性样本不出峰。
2.设计扩增引物组分；
建立包含五色荧光标记(FAM、HEX、TAMRA、ROX和LIZ)的复合扩增检测试剂盒，分子量内标采用LIZ荧光标记(T500)。
本实施例所述的遗传标记及其对应的扩增引物序列、标记荧光和反应终浓度如表1所示。
表1复合扩增所使用的引物序列、反应终浓度和标记荧光
3.多重PCR扩增体系的构建与优化；
对构建的复合扩增分型体系进行包括引物配比浓度、DNA模板量、退火温度、循环数等PCR反应条件的调整优化，得到均衡稳定的PCR产物分型结果，实现19个遗传标记的复合扩增。
本实施例所述的包含工业大麻17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的多重PCR扩增体系如表2所示，其中DNA需从工业大麻属样本，如花、茎、叶、种子中提取。
表2包含工业大麻17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的多重PCR扩增体系
反应体系在各种反应热循环仪(如ABI 9700、ABI 9600、ABI 2720、Bio-RadiCycler等)上采用以下的程序可以得到良好的结果：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，56℃退火1分钟，60℃延伸30秒，共28次循环；60℃终延伸5分钟； 15℃保温。
4.分析方法的建立与复合扩增产物的检测；
建立3100系列、3130系列或3500系列遗传分析仪光谱校正(Matrix)文件。毛细管电泳加样时，1μL PCR扩增产物与8.5μL甲酰胺、0.5μL分子量内标(T500 Size Standard)混合；混合物在95℃变性3分钟，随后置于冰上冷却3分钟；采用上述型号遗传分析仪对19个遗传标记进行分型检测。通过毛细管电泳获得各标记不同等位基因的电泳迁移参数，并以此为基础，分别根据GeneMapperID v3.2.1和
ID-X v1.5软件的格式要求编写相应的Bin文件和Panel文件，创建电泳分析方法。
其中，采用上述方法的Ladder分型图谱如图1所示，采用上述方法对雌性样本DNA的分型图谱如图2所示，对雄性样本DNA的分型图谱如图3所示。
实施例2
本实施例为采用实施例1提供的方法对工业大麻属样本DNA进行检测。
收集一例工业大麻属样本不同组织(花、茎、叶和种子)，进行DNA提取和定量。对上述DNA样本采用实施例1构建的试剂盒进行19个遗传标记的复合扩增。所有样本在遗传标记上均得到有效扩增产物。
实施例3
本实施例按照SWGDAM要求对实施例1提供的方法进行法医学验证(同一性、灵敏度、种属特异性以及法医学参数计算)，进而判断该方法的优越性，具体的操作如下：
(1)同一性研究：将同一植株花、叶和茎的基因组DNA定量到1ng/μL，使用实施例1提供的方法分别进行检测。
结果显示(如图4所示)，实施例1构建的方法具有良好的组织同一性：同一植株的花、叶和茎具有相同的基因分型。
(2)灵敏度研究：将工业大麻基因组DNA倍比稀释为2ng/μL、1ng/μL、 0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625ng/μL、0.03125ng/μL和0.015625 ng/μL，使用实施例1提供的方法对上述浓度的工业大麻基因组DNA分别进行检测，每个模板量样本重复检测3次。
结果显示(如图5所示)，实施例1构建的方法具有高灵敏度：在DNA模板量低至0.125ng时可以获得遗传标记的完整基因分型。
(3)种属特异性研究：将狗、猫、鼠、羊、猪、牛、兔、鸡、鸭、猴子、龙葵、虞美人、桑叶、罂粟、鼠尾草和葎草的基因组DNA定量到5ng/μL，使用实施例1提供的方法对上述非工业大麻源基因组DNA分别进行检测。
结果显示(如图6所示)，实施例1构建的方法具有种属特异性：除鼠尾草和葎草外其他物种的DNA均未检测到产物峰，尽管在鼠尾草和葎草样本中观察到一些产物峰，但大多数不在等位基因位置上，且与工业大麻正常的峰型也不相同，不会影响结果的判读。
(4)法医学参数计算：将126份工业大麻基因组DNA定量到1ng/μL，使用实施例1提供的方法分别进行检测。统计并计算17个常染色体STR基因座的杂合度、多态性信息含量、个体识别概率、非父排除概率、累积个体识别概率、累积非父排除概率，以及各样本性别信息。
结果显示(如表3所示)，实施例1构建的方法具有较好的系统效能：17 个常染色体STR基因座在126份工业大麻样本中的杂合度范围为0.2381～0.7937，多态性信息含量范围为0.2754～0.9419，个体识别概率范围为0.4624～0.9855，非父排除概率范围为0.0410～0.5873，累积个体识别概率为1-3.0×10-15，累积非父排除概率为1-7.4×10-3；工业大麻性别鉴定位点DM029和DM016在检测样本中均能满足性别鉴定的要求，在所有雄性样本中检测到DM029及DM016两个峰，在雌性样本中仅有DM029单一峰。
表3工业大麻17个常染色体STR基因座的法医学参数
由上述实施例可知，本发明所述的含有荧光标记的可并行检测工业大麻属样本17个常染色体STR基因座和2个性别鉴定位点的引物组合物、试剂盒和方法为我国工业大麻的法医学研究中性别鉴定、个体识别、来源地推断、STR数据库的建立提供了一个全新的检测手段。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 司法鉴定科学研究院
<120> 一种用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物、试剂盒和方法
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增D02-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttgggatg ttgttgttgt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增D02-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 2
agaaatccaa ggtcctgatg g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增C11-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggtggtga tgatgataat gg 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增C11-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaattggtt acgatggcg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增DM029的引物(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgacagac ttcctgattg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增DM029的引物(Artificial Sequence)
<400> 6
gtctaagagt gggaatgcta 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 扩增DM016的引物(Artificial Sequence)
<400> 7
gcccaagttg ctgctgag 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 扩增DM016的引物(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaccgttt agggagca 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增4910的引物(Artificial Sequence)
<400> 9
agattcccaa gatgagcaa 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增4910的引物(Artificial Sequence)
<400> 10
acaaactggt atcaagagcc 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增B01-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 11
atgacatacc agacagaaac tc 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增B01-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 12
catccatagc attatcccac t 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增E07-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 13
caaatgccac accaccttc 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增E07-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 14
gtggtagcca ggtataggta g 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增9269的引物(Artificial Sequence)
<400> 15
cccaaactac tgtttgtgcc 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增9269的引物(Artificial Sequence)
<400> 16
acttgcacgt gatgttagat cc 22
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增B05-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgatggtgg tgaaacggc 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增B05-CANN1的引物(Artificial Sequence)
<400> 18
ccccaatctc aatctcaacc c 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增H06-CANN2的引物(Artificial Sequence)
<400> 19
tggtttcagt ggtcctctc 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增H06-CANN2的引物(Artificial Sequence)
<400> 20
acgtgagtga tgacacgag 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增5159的引物(Artificial Sequence)
<400> 21
ccagagcttg tggatctcct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增5159的引物(Artificial Sequence)
<400> 22
agtacgaaag ggcactgagg 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增nH09的引物(Artificial Sequence)
<400> 23
ccaacatttt ctcagaaccc a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增nH09的引物(Artificial Sequence)
<400> 24
tcttgactgt agtaatccag c 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增ANUCS 501的引物(Artificial Sequence)
<400> 25
agcaataatg gagtgagtga ac 22
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 扩增ANUCS 501的引物(Artificial Sequence)
<400> 26
agagatcaag aaattgagat tcc 23
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增CS1的引物(Artificial Sequence)
<400> 27
aagcaactcc aattccagcc 20
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 扩增CS1的引物(Artificial Sequence)
<400> 28
taatgatgag acgagtgaga acg 23
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 扩增ANUCS 305的引物(Artificial Sequence)
<400> 29
agcccgaccg tgaaga 16
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 扩增ANUCS 305的引物(Artificial Sequence)
<400> 30
tgaagccgat gccctat 17
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增3735的引物(Artificial Sequence)
<400> 31
tgattctgtg tttgtgtgca at 22
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增3735的引物(Artificial Sequence)
<400> 32
catcgcaccc acaggttagt 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增ANUCS 302的引物(Artificial Sequence)
<400> 33
aacataaaca ccaacaactg c 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增ANUCS 302的引物(Artificial Sequence)
<400> 34
atggttgatg ttttgatggt 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增1528的引物(Artificial Sequence)
<400> 35
ggactttgtc tagtgccttt g 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增1528的引物(Artificial Sequence)
<400> 36
gagtacttgg ctgatgatgg 20
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增9043的引物(Artificial Sequence)
<400> 37
aggtctgcgt tgtgcattat t 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增9043的引物(Artificial Sequence)
<400> 38
agggctggtt tcagtttcg 19
Claims (14)
1.一种用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的引物组合物，其特征在于，包括工业大麻17个常染色体STR基因座的扩增引物和2个性别鉴定位点的扩增引物；其中，所述17个常染色体STR基因座包括D02-CANN1、C11-CANN1、4910、B01-CANN1、E07-CANN1、9269、B05-CANN1、H06-CANN2、5159、nH09、ANUCS 501、CS1、ANUCS 305、3735、ANUCS 302、1528和9043，所述2个性别鉴定位点为DM029和DM016。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述工业大麻17个常染色体STR基因座的扩增引物和2个性别鉴定位点的扩增引物的序列具体如下：
D02-CANN1：SEQ ID NO.1-2；C11-CANN1：SEQ ID NO.3-4；DM029：SEQ ID NO.5-6；DM016：SEQ ID NO.7-8；4910：SEQ ID NO.9-10；B01-CANN1：SEQ ID NO.11-12；E07-CANN1：SEQ ID NO.13-14；9269：SEQ ID NO.15-16；B05-CANN1：SEQ ID NO.17-18；H06-CANN2：SEQID NO.19-20；5159：SEQ ID NO.21-22；nH09：SEQ ID NO.23-24；ANUCS 501：SEQ ID NO.25-26；CS1：SEQ ID NO.27-28；ANUCS 305：SEQ ID NO.29-30；3735：SEQ ID NO.31-32；ANUCS302：SEQ ID NO.33-34；1528：SEQ ID NO.35-36；9043：SEQ ID NO.37-38。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，每对扩增引物中至少一条引物采用荧光染料标记，所述荧光染料选自FAM、HEX、TRMRA、ROX中的一种。
4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，D02-CANN1、C11-CANN1、DM029、DM016、4910、BO1-CANN1的扩增引物采用FAM标记；E07-CANN1、9269、B05-CANN1、H06-CANN2、5159、nH09的扩增引物采用HEX标记；ANUCS501、CS1、ANUCS 305的扩增引物采用TRMRA标记；3735、ANUCS 302、1528、9043的扩增引物采用ROX标记。
5.一种包括如权利要求1-4任一项所述引物组合物的用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的试剂盒，其特征在于，还包括4×PCR反应预混液Ⅶ、去离子水。
6.采用如权利要求1-4任一项所述引物组合物或者如权利要求5所述试剂盒的用于工业大麻复合鉴定多态性遗传标记的方法，其特征在于，具体用于工业大麻性别鉴定、个体识别和来源地推断；所述方法包括如下步骤：
步骤一，采用SEQ ID NO.1-38所示序列的扩增引物对待测样品的基因组DNA样本进行PCR复合扩增；
步骤二，取PCR扩增产物与适量的分子量内标、甲酰胺混匀；将混合物变性、冷却；
步骤三，采用遗传分析仪进行分型检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR复合扩增的扩增体系的总体积为10μL，包括：4×PCR反应预混液Ⅶ2.5μL，10μM引物混合物1μL，去离子水5.5μL，1ng/μL基因组DNA 1μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增引物在扩增体系中的浓度分别如下：D02-CANN1：0.03μM；C11-CANN1：0.03μM；DM029：0.05μM；DM016：0.03μM；4910：0.04μM；B01-CANN1：0.06μM；E07-CANN1：0.05μM；9269：0.04μM；B05-CANN1：0.03μM；H06-CANN2：0.04μM；5159：0.04μM；nH09：0.04μM；ANUCS 501：0.05μM；CS1：0.05μM；ANUCS 305：0.05μM；3735：0.05μM；ANUCS 302：0.04μM；1528：0.05μM；9043：0.05μM。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR复合扩增的程序为：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，56℃退火1分钟，60℃延伸30秒，共28次循环；60℃终延伸5分钟；15℃保温。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR复合扩增采用反应热循环仪；所述反应热循环仪选自ABI 9700、ABI 9600、ABI2720、Bio-Rad iCycler和Bio-Rad C1000中的一种。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分子量内标采用T500 SizeStandard并采用LIZ荧光标记；荧光校正采用5-Dye Matrix Standards。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤二中，PCR扩增产物、分子量内标和甲酰胺的体积比为1:8.5:0.5。
13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述遗传分析仪选自3100系列、3130系列和3500系列遗传分析仪中的一种。
14.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤一还包括对待测样品的花、茎、叶和/或种子进行DNA提取制备基因组DNA样本。
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| CN113584214A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-11-02 | 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所 | 适用于毛细管电泳检测技术的大麻ssr分子标记及其应用 |
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