CN103131787A - 基于y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 - Google Patents
基于y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于法医遗传学领域，具体涉及一种用于法医个体识别和亲缘关系鉴定的基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。本发明要解决的技术问题是实现利用Y染色体SNP遗传标记对人类生物学检材进行法医学亲缘关系鉴定和个人识别。本发明的技术方案是本发明解决该技术问题的方案是提供一种基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。本发明试剂盒可用于法医学常见的降解检材的检测。
Description
技术领域
本发明属于法医遗传学领域，具体涉及一种用于法医个体识别和亲缘关系鉴定的基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。
背景技术
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是基因组特定核苷酸位置上单个碱基变异引起的DNA序列多态性，是人类基因组中最常见、分布最广泛的DNA多态性类型。SNP多为二等位基因型的遗传标记，具有遗传稳定、突变率低、扩增片段小、易于自动化、高通量分析等特点。
人类Y染色体为男性所特有的性别决定染色体。由于遗传方式的不同，Y染色体可分成两个区，一个是位于Y染色体两端的拟常染区，另一个是占Y染色体大部分的Y特异区。在减数分裂中，拟常染区可以与X染色体进行配对、交换；而Y特异区则不会发生重组，呈单倍型独立向下传递，表现出父系遗传特征，故又被称为Y染色体非重组区。位于Y染色体非重组区的SNP遗传标记由于具有男性特异性和单倍型父系遗传的特征，在父系亲属间的亲权关系鉴定和混合斑精液成分的个人识别中具有的独特而重要的应用价值。同时，Y-SNP遗传标记还是研究人类起源、进化和迁移的理想工具之一，多个Y-SNP遗传标记构成的单倍型组合，能清楚的构建Y-SNP谱系树。各个Y-SNP单倍群的分布具有明显的种族地理特异性，可通过Y-SNP单倍型分析，推断未知生物样本的种族或地理来源。因此，发现适宜的Y染色体SNP遗传标记，构建一种可对生物性检材进行Y-SNP单倍型分析的复合检测体系，具有重要的法医学意义。
2002年，国际Y染色体协会(Y Chromosome Consortium，YCC)通过对来源于世界不同群体的74名男性样本(YCC样本)进行245个Y-SNP遗传标记的分析，用最大简约法则构建了含153个单倍群的进化树，并以此为基础提出了统一的命名系统。2008年，Karafet等人对原有的Y染色体谱系树进行了修订，修订后的Y染色体谱系树包含了600个Y-SNP和311个单倍群。最近，国际千人基因组计划协作组在著名的Nature杂志公布了来自14个不同群体的1092个个体的基因组数据，提供了一张包含有3.8×107个SNP的人类单倍型图。然而，和其它染色体相比，Y染色体序列变异少，其分布具有明显的群体差异，这使得具有法医学价值的Y染色体SNP遗传标记的选择变得困难。尤其，目前东亚群体的Y-SNP数量有限，尚无可应用于中国汉族群体的高效能的Y-SNP复合检测体系。若能筛选到一组适宜的Y染色体SNP遗传标记，构建一种可以用于东亚人群的高效能Y-SNP单倍型检测体系，将为法医的个人识别和亲子鉴定提供一种新的技术手段。若能进一步开发出基于现有法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台的Y染色体SNP遗传标记复合检测试剂盒，将极大推动这种新技术在法医物证鉴定中的推广和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是实现利用Y染色体SNP遗传标记对人类生物学检材进行法医学亲缘关系鉴定和个人识别。
本发明的技术方案是本发明解决该技术问题的方案是提供一种基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成；其中，等位基因分型标准物混合物由20个Y染色体SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括38个荧光素标记DNA片段，所述38个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的rs号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如表3所示；
表320个Y－SNP遗传标记的等位基因分型标准物核苷酸序列及所加荧光标记
所述各序列中“-”符号前为加尾序列；阿拉伯数字表示其后跟的那个脱氧核糖核苷酸的重复数。
各个SNP遗传标记的等位基因分型标准物是利用其单碱基延伸引物对该SNP在群体中观察到的不同等位基因进行单碱基延伸反应得到的产物；所述的等位基因分型物混合物包括38个荧光素标记DNA片段，对应其中18个Y染色体SNP遗传标记的所有已知36个等位基因和2个Y染色体缺失多态性的2个未缺失等位基因。
其中，上述试剂盒中所述复合扩增引物混合物能在单管内对含有20个Y染色体SNP遗传标记的所有DNA片段一次性同时扩增；所述复合扩增引物混合物含40条引物，各条引物的核苷酸序列分别为下表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.40所示：
表1单管内复合扩增引物对
其中，所述的多重单碱基延伸反应引物混合物能利用上述复合扩增引物混合物的扩增产物为模板，在单管内进行20个Y染色体SNP遗传标记的多重单碱基延伸反应；所述多重单碱基延伸反应引物混合物包括核苷酸序列为下表中SEQ ID No.41至SEQ ID No.60所示的20条多重单碱基延伸反应引物：
表2单碱基延伸反应引物序列
| 序号 | SNP基因座的rs号 | 各多重单碱基延伸引物序列 | 序列表中的序号 |
| 1 | M145 | GATTAGGCTAAGGCTGGCTCT | SEQ ID No.41 |
| 2 | rs9306845 | CACTCCTAGAGAAGTCATAATTGC | SEQ ID No.42 |
| 3 | rs17276358 | (GACTGA)-CAGAAGGGTAATAACCTTTCAAG | SEQ ID No.43 |
| 4 | rs9786479 | 8C-CAAATAGACATTTGGCTGACC | SEQ ID No.44 |
| 5 | rs17276345 | 8C-AGTGACATGAAATTTACTACGGCT | SEQ ID No.45 |
| 6 | rs2075640 | 12C-CATCAGCTCTGTGACTGGTTAAT | SEQ ID No.46 |
| 7 | M134 | 17C-ATACTTTTGATCCCCACCAAT | SEQ ID No.47 |
| 8 | M88 | 19C-TTCTTATTCCTGCTTCTTCTGC | SEQ ID No.48 |
| 9 | M95 | 15C-GGATAAGGAAAGACTACCATATTAGTG | SEQ ID No.49 |
| 10 | rs17323322 | 21C-CATTCAGCTAGGTATTTCAGACAT | SEQ ID No.50 |
| 11 | M122 | 28C-CAGATTTTCCCCTGAGAGC | SEQ ID No.51 |
| 12 | rs13447354 | 24C-GGTACTTTAAGTATGGTAGGCAGA | SEQ ID No.52 |
| 13 | M89 | 28C-CAACTCAGGCAAAGTGAGAGAT | SEQ ID No.53 |
| 14 | rs16980426 | 30C-AAAACCATCAAGTGACTGCAA | SEQ ID No.54 |
| 15 | rs9786707 | 35C-GACCTCAGGCTACACATTTCC | SEQ ID No.55 |
| 16 | M15 | 34C-AGAGTAGAGAAAAGGTGGTACAATG | SEQ ID No.56 |
| 17 | rs16980711 | 28C-GTTACAGGTTAGAATTTATATATACATTCTC | SEQ ID No.57 |
| 18 | M9 | 34C-CATGTCTAAATTAAAGAAAAATAAAGAG | SEQ ID No.58 |
| 19 | rs11096433 | 44C-TGTCAGATATCACCTCGGGTC | SEQ ID No.59 |
| 20 | rs17316592 | 46C-TTTAATCGCTCACCTTTTCTCT | SEQ ID No.60 |
所述多重单碱基延伸引物前端“-”符号前为加尾序列，阿拉伯数字表示某一个脱氧核糖核苷酸的重复数。
本发明试剂盒包含20个Y染色体SNP遗传标记，它们位于Y染色体的非重组区，具有男性特异性和单倍型父系遗传的特征，可用于父系亲属间的亲权关系鉴定和混合斑精液成分的个人识别；这些遗传标记均经证实多态性较好，且相互之间不连锁，从而使系统具有高效能；本试剂盒运用了单管内复合扩增和多重单碱基延伸技术，可以一次性获得生物性检材的20个Y染色体SNP遗传标记，快速进行法医学的个体识别；本试剂盒包括了特有的等位基因分型物混合物，确保分型准确；该试剂盒复合扩增产物长度最短仅78bp，最长不超过212bp，故本试剂盒对于法医学常见的降解检材的检测具有优势；由于本试剂盒是基于法医遗传实验室通用的毛细管电泳平台建立的，所以具有广泛推广和应用价值。
附图说明
图1为本发明对两个样本的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值提示DNA链长度，纵坐标数值表示荧光强度，各荧光峰为该样本在各SNP位点的检测结果，各峰上方均标示出了该峰代表的SNP遗传标记和样本在此遗传标记的分型结果。从图中可以清晰地观察到两个样本在所有二十个Y染色体SNP的分型结果，它们构成了该样本的单倍型，证明本发明Y染色体SNP复合检测试剂盒可以准确检测生物学样本。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒是基于筛选得到的20个Y染色体SNP遗传标记，利用目前法医遗传学实验室常用的毛细管电泳体系构建的。该试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。
该试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，在单管内同时扩增获得所有含有20个Y染色体SNP遗传标记的DNA片段。然后以此20个DNA片段为模板，利用单碱基延伸反应混合液和单碱基延伸反应引物混合物进行多重单碱基延伸反应以获得20个Y－SNP遗传标记的单碱基延伸反应产物。最后将单碱基延伸反应产物和等位基因分型标准物混合物同步进行毛细管电泳，并利用等位基因分型标准物混合物分析待测样本的多重单碱基延伸反应产物，确定分型结果。
在本发明中，Y染色体SNP（Y-SNP）遗传标记的选择对复合检测试剂盒的构建极其关键。Y染色体序列变异少，其分布具有明显的群体差异，目前为止，东亚群体缺少多态性较好的Y-SNP遗传标记，所以要开发基于Y染色体SNP遗传标记的复合检测试剂盒就必须首先从公共SNP数据库中筛选出适宜的Y染色体SNP遗传标记。本发明中新建立的Y染色体SNP遗传标记的筛选标准为：1)在中国汉族群体中，多态性较好，最小等位基因频率(minor allelefrequency，MAF)大于5%；2）可以设计出合适的多重单碱基延伸引物和单管内复合扩增引物；3）与自然选择和疾病不相关；4）相互之间不连锁。
根据建立的上述标准，本发明共筛选出表4所列的20个位于Y染色体非重组区的二等位基因遗传标记用于建立法医学复合检测体系。经过群体调查实验证明，本发明的Y染色体SNP遗传标记复合检测体系具有较高的效能，在220个中国汉族男性个体中共发现了56种单倍型，这些单倍型的频率从0.45％到13.2％，单倍型的变异度为0.9539。
表420个Y染色体SNP遗传标记
| 序号 | SNP基因座的rs号 | 多态性 |
| 1 | M145 | G/A |
| 2 | rs9306845 | A/G |
| 3 | rs17276358 | T/G |
| 4 | rs9786479 | T/G |
| 5 | rs17276345 | C/G |
| 6 | rs2075640 | A/G |
| 7 | M134 | 1bp(C)del |
| 8 | M88 | A/G |
| 9 | M95 | C/T |
| 10 | rs17323322 | C/T |
| 11 | M122 | C/T |
| 12 | rs13447354 | A/G |
| 13 | M89 | C/T |
| 14 | rs16980426 | G/T |
| 15 | rs9786707 | C/T |
| 16 | M15 | 1bp(C)del |
| 17 | rs16980711 | A/G |
| 18 | M9 | C/G |
| 19 | rs11096433 | C/T |
| 20 | rs17316592 | G/T |
注：1bp(C)del是指缺失1个C碱基。
本发明试剂盒在对上述筛选到的Y染色体SNP遗传标记的检测中运用了复合扩增技术。复合扩增技术可以在一个反应体系中一次性的扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，适应法医学鉴定的实际需要。复合扩增引物的设计是该技术的关键和难点，在设计引物时，考虑了以下因素：1）GC含量适宜，约在40-50％范围之内；2）扩增引物的退火温度应该适宜，且所有引物的退火温度必须一致；3）分别包含了20个SNP遗传标记的各扩增片段的长度应有差异，这样即可对复合扩增反应是否成功进行检测；4）扩增产物长度短，以用于降解检材的检测；5）引物自身、引物之间、引物与模板之间是否有明显的发卡结构、错配和二聚体结构的形成。
根据公共SNP数据库提供的DNA序列设计了近百条复合扩增引物，结合实际经验，经过反复筛选、优化，得到了表1中所列的20对复合扩增引物。这些引物长度在20～27bp之间，退火温度均为60±1°C，扩增产物在78～212bp之间，所有引物、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。
本试剂盒利用上述复合扩增引物，获得了包含20个SNP遗传标记的扩增产物，继而以此为模板，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸反应技术是一种基于四种荧光素标记的双脱氧核糖核苷酸进行等位基因特异性引物延伸的反应。多重单碱基延伸反应可以在一个反应体系中同时获得多个SNP位点的单碱基延伸产物，实现对多个SNP位点的一次性同时检测。其特点在于，通过设计不同长度的单碱基延伸引物，可以同时分析多个SNP位点，即根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据不同的双脱氧核糖核苷酸所标记荧光素的不同区分SNP的不同等位基因。为了实现对多个SNP位点同时进行单碱基延伸反应，多重单碱基延伸引物的退火温度应该大致相同，且引物自身、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。尤为重要的是，要根据单碱基延伸反应产物长度的不同来区分不同的SNP位点，多重单碱基延伸引物之间长度必须有差异。在本试剂盒中，设计的单碱基延伸引物包括两个部分，第一部分为3’端与SNP上游序列互补的序列，第二部分为5’端的加尾序列，为长度有差异的重复序列（Poly-C）或非人源DNA序列。加尾序列的应用使不同位点的单碱基延伸引物长度不同，最终使不同位点的单碱基延伸产物之间有长度差异。考虑到不同长度范围的DNA片段在毛细管电泳中电泳行为的差异，在我们设计的所有单碱基延伸引物中，30bp以下引物之间相差5bp，50bp以下引物之间相差4bp，80bp以下引物之间至少相差3bp。所有20个Y染色体SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物的序列参见表5（各序列的序列号分别在表1和表2中）。
表520个Y染色体SNP位点的复合扩增引物和多重单碱基延伸引物参照表
本发明试剂盒中引入等位基因分型标准物混合物是为了准确地分析样本基因型，本发明中提供的等位基因分型标准物混合物包括了所有20个Y染色体SNP遗传标记的等位基因分型标准物，各个SNP遗传标记的等位基因分型标准物是利用其单碱基延伸引物对该SNP在群体中观察到的等位基因进行单碱基延伸反应得到的产物。本试剂盒中的20个Y染色体遗传标记包括18个二等位基因的SNP位点和2个1bp的缺失突变，因此试剂盒中的等位基因分型物混合物包括38个荧光素标记DNA片段，对应18个二等位基因SNP遗传标记的所有已知36个等位基因和2个缺失突变相应的2个未缺失等位基因。对未知样本进行毛细管电泳分析时，并列地进行等位基因分型标准物混合物的毛细管电泳分析，通过未知样本和已知等位基因分型标准物混合物的电泳结果比对，可以确定未知样本的基因分型。
本发明试剂盒的结果分析在毛细管电泳平台上进行。毛细管电泳法既能进行长度多态性分析，又能进行序列多态性分析，具有分辨率高、重复性好、速度快等优点，因而已在法医遗传学实验室广泛应用。本发明选择复合扩增和单碱基延伸技术进行Y染色体SNP遗传标记的检测，根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据荧光素的不同区分SNP的不同等位基因，因而利用目前法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台即可进行结果分析。本发明建立的基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒可以直接应用于任何一个有毛细管电泳平台的法医遗传实验室，具有普适性，易于推广应用。
更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：
a）复合扩增反应混合液：含有PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶等常用成分。
b)复合扩增引物混合物：如表1所示的20个Y染色体SNP遗传标记的扩增引物对组成的复合扩增引物混合物；复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物用于获得含有20个Y染色体SNP遗传标记的DNA片段。
c）扩增产物纯化试剂：含有核酸外切酶1（ExoⅠ）及其缓冲溶液（ExoⅠBuffer）、虾碱性磷酸酶（SAP）及其缓冲溶液（SAP Buffe）等常用成分；用于将复合扩增的产物进行纯化，以便于进行下一步操作。
d）多重单碱基延伸反应引物混合物：表2所述的20条多重单碱基延伸反应引物组成的混合物。
e)单碱基延伸反应混合液：包括DNA聚合酶、缓冲液、MgCl2、荧光标记双脱氧核糖核酸等常用成分。
f）等位基因分型标准物混合物：由表3所述的38个荧光素标记DNA片段组成，对应18个二等位基因SNP遗传标记的所有已知36个等位基因和2个缺失突变相应的2个未缺失等位基因。
g）毛细管电泳用试剂：包括Hi－Di甲酰胺和GenescanTM Size Standard GS－120LIZ内标。
复合扩增反应混合液、扩增产物纯化试剂可按本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品。
至于提取待检测样本中的DNA的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取DNA模板可以参照现有的常规方法即可进行。
利用本发明所述试剂盒，可以对法医DNA样本进行分析。分析方法包括以下步骤；
1）提取待检测样本的DNA，作为扩增模板。
2）利用上述复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1）提取的DNA进行单管内复合扩增。所述复合扩增PCR的反应的循环参数为：94°C，5分钟;94°C,30秒，60°C，30秒，72°C，45秒，35个循环；然后72°C，10分钟。
3）纯化步骤2）的复合扩增产物，并以它为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行单管内多重单碱基延伸反应。所述单碱基延伸反应的循环参数为：96°C，10秒，50°C，5秒，60°C，30秒，25个循环后4°C保存。
4）纯化步骤3）的产物后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的单倍型。
进一步的，上述方法步骤4）中所述的多重单碱基延伸产物分析包括以下步骤：将多重单碱基延伸反应产物纯化后和等位基因分型标准物混合物进行毛细管电泳分析，通过与等位基因分型标准物混合物比对，获得待检测样本的单倍型。
以下用具体实例进一步具体说明本发明，其中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器；
1)自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪310型, ABI公司
2)PCR扩增仪 9600型,ABI公司
3)台式高速离心机 EPPENDORF公司
4)紫外分光光度计 岛津公司
5)纯水装置 Millipore公司
6)移液器 EPPENDORF公司
7)Hi－Di甲酰胺 ABI公司
8)核酸外切酶1 TaKaRa Biotechnology公司
9)虾碱性磷酸酶 TaKaRa Biotechnology公司
10）内标（GenescanTM Size Standard GS－120LIZ） ABI公司
实施例一 本发明试剂盒的制备
用于检测的Y染色体SNP复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：
a）复合扩增引物混合物。由表1所示的扩增引物混合得到，由TaKaRa Biotechnology公司合成，将合成好的20对扩增引物用超纯水配置为50pM/μL，然后按照表6中的比例混合，制成复合扩增引物混合物。
b）复合扩增反应混合液。本实施例中使用TaKaRa Biotechnology公司的PCR反应混合液One shot La PCRTM Mix。
c）多重单碱基延伸反应引物混合物。由表2所示的单碱基延伸反应引物混合得到，由TaKaRa Biotechnology公司合成。将合成好的20个单碱基延伸反应引物用超纯水配置为50pM/μL，根据表7中给出参数配成多重单碱基延伸引物混合物。
d）单碱基延伸反应混合液。使用ABI公司的SNaPshot ready reaction mix。
e）等位基因分型标准物混合物。由按表3所示的38条荧光标记DNA片段组成，标记等位基因分型标准物的绿色、黑色、蓝色和红色荧光标记物分别为dR6G、dTAMRATM、dR110和dROXTM，由ABI公司提供并按其手册标记。
将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，用于后继的实验。
表6复合扩增引物的浓度和各扩增片段的大小
| NO | SNP(rs号) | 引物浓度（μM） | 扩增片段大小(bp) |
| 1. | rs17276358 | 0.13 | 78 |
| 2. | rs2075640 | 0.30 | 83 |
| 3. | M134 | 1.20 | 88 |
| 4. | M122 | 0.18 | 94 |
| 5. | M88 | 0.15 | 97 |
| 6. | rs16980711 | 0.18 | 106 |
| 7. | M95 | 0.04 | 113 |
| 8. | M89 | 0.13 | 118 |
| 9. | M145 | 0.23 | 121 |
| 10. | M9 | 0.13 | 127 |
| 11. | rs17323322 | 0.10 | 133 |
| 12. | rs16980426 | 0.15 | 137 |
| 13. | rs9786707 | 0.30 | 155 |
| 14. | rs17276345 | 0.30 | 159 |
| 15. | rs9786479 | 1.30 | 163 |
| 16. | rs13447354 | 0.90 | 185 |
| 17. | rs9306845 | 0.03 | 193 |
| 18. | rs17316592 | 0.07 | 200 |
| 19. | rs11096433 | 0.15 | 208 |
| 20. | M15 | 0.23 | 212 |
表7多重单碱基延伸引物的浓度
| NO. | SNP(rs号) | 引物方向 | 引物大小(bp) | 引物浓度（μM） |
| 1. | M145 | R | 21 | 0.03 |
| 2. | rs9306845 | F | 24 | 0.20 |
| 3. | rs17276358 | R | 29 | 0.20 |
| 4. | rs9786479 | F | 29 | 0.25 |
| 5. | rs17276345 | F | 32 | 0.05 |
| 6. | rs2075640 | F | 35 | 0,03 |
| 7. | M134 | R | 38 | 0.20 |
| 8. | M88 | F | 41 | 0.02 |
| 9. | M95 | F | 42 | 0.35 |
| 10. | rs17323322 | F | 45 | 0.04 |
| 11. | M122 | R | 47 | 0.38 |
| 12. | rs13447354 | R | 48 | 0.15 |
| 13. | M89 | R | 50 | 0.40 |
| 14. | rs16980426 | F | 51 | 0.30 |
| 15. | rs9786707 | R | 56 | 0.05 |
| 16. | M15 | R | 59 | 0.04 |
| 17. | rs16980711 | F | 59 | 0.18 |
| 18. | M9 | F | 62 | 0.25 |
| 19. | rs11096433 | R | 65 | 0.45 |
| 20. | rs17316592 | F | 68 | 0.50 |
实施例二使用本发明方法检测无关汉族个体检材
使用实施例一的试剂盒对无关汉族个体进行检测。
a、用Chelex-100法从220个无关汉族个体血样中提取基因组DNA，作为复合扩增模板。
b、以步骤a中的DNA模板，利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液将样本DNA在下述扩增体系中进行复合PCR扩增。
扩增的热循环参数
从第2步到第4步循环34次
5、72°C 10分钟
c、多重PCR产物的纯化，下列为每一个样品扩增产物的纯化体系
扩增产物纯化反应条件：
37°C 60分钟
75°C 15分钟
4°C 保存
d、以上一步纯化得到的产物为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物进行单碱基延伸反应。
单碱基延伸反应的热循环参数：
e、纯化上一步单碱基延伸反应产物。
单碱基延伸反应产物纯化体系：
单碱基延伸反应产物纯化反应条件：
37°C 60分钟
75°C 15分钟
4°C 保存。
f、毛细管电泳。
分别取1.5μL步骤e中得到的纯化后的延伸产物和等位基因分型标准物混合物（每次加入1.5ul），加入7.5μL的Hi－Di甲醇胺和0.5μL内标混匀；然后95℃下变性3min，4℃下迅速冷却后，用美国AB公司的DNA自动分析仪（自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪，310型）进行电泳检测。
电泳条件：1500V电压，36cm毛细管，POP4凝胶，电泳20min；应用Data Collection3.0软件收集数据，Genemappe V3.2软件进行结果分析。
发明人检测了220个样本，发现了56种单倍型，这56种单倍型见表8，图1表示了其中两种单倍型的检测结果。
注：表8中SNP编号和SNP位点rs号对应关系如下：
SNP编号1：rs11096433；SNP编号2：M145；SNP编号3：rs9306845；SNP编号4：rs9786479；SNP编号5：rs17276358；SNP编号6：rs2075640；SNP编号7：M134；SNP编号8：M88；SNP编号9：M95；SNP编号10：rs16980426；SNP编号11：rs17323322；SNP编号12：M122；SNP编号13：rs13447354；SNP编号14：M89；SNP编号15：rs9786707；SNP编号16：M15；SNP编号17：rs16980711；SNP编号18：M9；SNP编号19：rs17316592；SNP编号20：rs17276345
表8中“+”表示没有相应碱基缺失；“-”表示相应碱基缺失。
以上结果还使用sanger测序法（双脱氧链终止法）和Pyrosequencing测序法（焦磷酸测序法）进行测序验证，三种方法检测结果一致，证明了本试剂盒检测结果的准确性。
Claims (3)
1.基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成；其中，等位基因分型标准物混合物由20个Y染色体SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括38个荧光素标记DNA片段，所述38个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的rs号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如表3所示；
表320个Y－SNP遗传标记的等位基因分型标准物核苷酸序列及所加荧光标记
所述各序列中“-”符号前为加尾序列；阿拉伯数字表示其后跟的该脱氧核糖核苷酸的重复数。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述复合扩增引物混合物能在单管内对含有20个Y染色体SNP遗传标记的所有DNA片段一次性同时扩增；所述复合扩增引物混合物含40条引物，各条引物的核苷酸序列分别为下表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.40所示：
表1单管内复合扩增引物对
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的多重单碱基延伸反应引物混合物能利用上述复合扩增引物混合物的扩增产物为模板，在单管内进行20个Y染色体SNP遗传标记的多重单碱基延伸反应；所述多重单碱基延伸反应引物混合物包括核苷酸序列如表2中SEQ ID No.41至SEQ ID No.60所示的20条多重单碱基延伸反应引物：
表2单碱基延伸反应引物序列
所述多重单碱基延伸引物前端“-”符号前为加尾序列，阿拉伯数字表示某一个脱氧核糖核苷酸的重复数。
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