CN109762909A - 一种用于降解检材法医学个体鉴识的44个InDels位点复合扩增检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于法医学新技术研究领域，具体涉及公开一种适用于法医学降解检材个体识别及性别确认应用研究的43个插入/缺失)及1个牙釉基因位点的复合扩增分型检测体系试剂盒及检测方法。采用四种不同颜色的荧光物质(FAM、HEX、TAMRA和ROX)对44个位点的引物进行荧光标记分组，可实现44个位点同时在同一扩增体系中进行复合扩增。本发明提供的InDels位点由于扩增片段短，可用于降解检材的分型检测。本发明包含的44个位点在无关健康个体中具有较高的累积个体识别率，能够满足法医降解生物检材的个体识别的需要。
Description
技术领域
本发明属于法医学新技术研究领域，具体涉及公开一种适用于降解检材的法医学个体鉴识与性别确认的新的43个插入/缺失（Insertion/Deletion，InDels）以及1个牙釉基因（Amelogenin）位点的复合扩增分型检测试剂盒。
背景技术
短串联重复序列（STR）是2-6bp的核酸序列组成的重复单元所形成的遗传多态性;单核苷酸多态性(SNP) 是基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP与STR因其多态性高且在基因组中广泛存在，因此是法医学领域常用的遗传学标记。但是，这STR标记扩增片段多在300bp以上，不利于法医学中降解检材的分型检测，SNP标记因其测序操作较为复杂，不利于在基层法医实验室推广。
插入/缺失（InDels）多态性是由于基因组中插入或缺失不同长度的DNA片段所形成的遗传多态性。InDel位点在人类基因组中分布广泛，平均每7.2kp就包含一个InDel位点，且表现为长度多态性，可采用法医学常用的毛细管电泳平台进行分型，操作方法简单。InDels位点兼具STR与SNP位点的诸多优点例如： 候选位点多、稳定性好、多态性较高、种属特异性强、检测灵敏度高等。此外其还具有操作简单、基因分型结果精准以及位点突变率低（10-8），扩增片段较小可用于法医学降解检材分型等优势，因此成为法医物证学研究的新热点。此外，在人类Y染色体中心粒附近有一类牙釉基因（Amelogenin），与牙釉基因的碱基序列有90%同源性，扩增后，男性可获得两条带，女性只观察到一条带，因此该位点在法医学研究中可用于性别确认。
目前国际上常用的用于个体识别的InDels分型检测试剂盒Investigator®DIPplex主要是针对欧美人群，过往研究发现这些位点在国内群体中多态性程度偏低，多数位点在东亚人群以及国内群体中应用价值较低，且不能进行性别确认。我们甄选的这43个InDels位点与Investigator® DIPplex试剂盒中的30个InDels位点并无重合，研发时主要针对东亚人群以及国内群体，为全新的用于法医学个体鉴识的位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于降解检材法医学个体鉴识的43个插入/缺失（InDels）及1个牙釉基因（Amelogenin ）位点复合扩增检测试剂盒。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
1)筛选适用于东亚人群以及国内群体法医学个体识别研究的InDels位点。我们基于千人数据库中的东亚群体（中国北京汉族、南方汉族和西双版纳傣族；越南京族以及日本东京人群样本）对InDels位点进行甄选和法医学效能的评估，位点的筛选原则为：a. InDels位点片段在2-30bp之间；b. InDels位点位于内含子区域；c.同一条染色体上的InDels位点至少相距10Mb以上；d.筛选的位点在千人基因组数据库中东亚群体内都处于Hardy-Weinberg平衡和连锁平衡状态；e. InDels位点在千人基因组的东亚群体内等位基因频率分布在0.4-0.6之间。对于引物的设计，要求每个InDel位点的扩增片段小于200bp。
本发明甄选rs33990282，rs146880183，rs5852131，rs3036240，rs142159306，rs35700881，rs3092307，rs3830564，rs79287422，rs142281120，rs6144473，rs63064161，rs10555434，rs63136060，rs5822909，rs10540867，rs140025863，rs142623177，rs55714089，rs35974596，rs5882232，rs10537321，rs10541072，rs5825145，rs66534669，rs4019986，rs201844336，rs10533337，rs67941259，rs3993057，rs10589141，rs10584875，rs10588341，rs3830885，rs10555133，rs147682692，rs10573809，rs3043804，rs144537609，rs142392113，rs10544053，rs5821525，rs16646 共43个InDels位点以及一个性别特异的Amelogenin位点进行分型检测。
2)44个位点的复合扩增体系的构建。本发明采用Primer 5.0软件对各位点进行引物设计，同时通过对PCR引物的优化结合四色荧光物质的调配，实现44个位点在同一反应体系中同步并行检测。所述方法包含44个位点及标记的荧光染料分组和相应的引物序列信息如下：
44个位点的复合PCR体系总体积为20µl，具体成分配比如下：20µl，包含人源生物样本DNA 1µl，Nuclease-Free Water 6.6 µl，Master mix I 12µl，Primer mix 0.4µl；复合PCR热循环反应条件如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃终延伸60min。
3)采用毛细管电泳的方法对44个位点进行分型检测，具体步骤如下：取1µl的PCR产物和Size Standard Org 500试剂0.5µl和去离子甲酰胺8.5µl混匀；混合物在95℃变性3min后，立即置冰上冷却3min；最后采用毛细管电泳遗传分析仪对44个位点进行分型检测。
本发明提供一种用于东亚人群和国内群体法医学个体识别新的44个位点分型检测试剂盒，包括44个位点复合扩增前和扩增后的体系组分配比以及位点分型检测的操作步骤。本发明采用新一代分子遗传标记InDels及一个Amelogenin位点构建用于降解检材的法医学个体识别的复合检测试剂盒，其相比传统的SNP与STR分子遗传标记，具有突变率低、灵敏度高、操作简单的优势；添加一个Amelogenin位点可以在对样本进行个体鉴识的同时进行性别判定；由于InDels扩增片段较小, 对一些陈旧降解的法医物证检材样本，本发明的方法仍可获得良好的分型结果。此外，本发明提供的InDels位点，被设计为长度多态性位点，可以采用毛细管电泳的方法进行分型检测，利用四种荧光物质标记引物，可以实现44个位点同时并行检测，因此，此发明便于在基层法医DNA实验室中进行推广应用。
附图说明
图1：实施例中：一个样本的44个位点的基因分型结果图。
具体实施方式
下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例阐述本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明中所用的试剂包括：Master mix I，Primer mix，Nuclease-Free Water，Control DNA M308，Size Standard Org500，5-Dye matrix Standards和去离子甲酰胺溶液。
本发明中44个位点的引物序列信息如下：
检测方法：
1)取一个个体样本的DNA1µl，采用本发明给出的PCR反应体系，如下：
| 组分 | 体积 |
| Master mix I | 12ul |
| primer mix | 0.4ul |
| DNA | 1ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 补齐20ul |
扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃终延伸60min。对44个位点进行复合扩增。
2)在对扩增产物进行毛细管电泳分型检测前，需对使用的遗传分析仪进行光谱校正，具体步骤如下（以3100遗传分析仪为例）：a. 更换测序以上的POP7胶和电泳Buffer；b.取10µl 5-Dye matrix Standards试剂加到200µl的去离子甲酰胺中，震荡混匀，分装至96孔板中的两排，每孔各10µl；c. 95℃变性3min，立即冰上冷却3min；d. 光谱校正时，Dyeset选择“E5”，Run Module选择Fragment Analysis36_POP7。
3)光谱校正后，对扩增产物进行电泳检测，上样检测液的体系组分配比如下：
| 组分 | 体积 |
| PCR扩增产物 | 1µl |
| Size Standard Org500 | 0.5µl |
| 去离子甲酰胺 | 8.5µl |
混合物在95℃变性3min，立即置于冰上冷却3min后，再置于毛细管电泳遗传分析仪上进行基因扫描和基因分型检测。
3）结果判读：a. 打开Genemapper ID软件，导入本发明构建的Panel和Bin文件，建立相应的Analysis Method，新建Size Standard（选择Size Standard Org500）；b. 导入电泳数据，选择相应的Panel、Bin、Analysis Method和Size Standard等分析参数，对待测样本的44个位点的电泳结果进行判读。
Claims (6)
1.一种用于降解检材法医学个体鉴识的43个插入/缺失（Insertion/Deletion,InDels）及1个牙釉基因（Amelogenin）位点复合扩增检测试剂盒，其特征在于适用于降解生物检材，可同时进行个体鉴识与性别确认，InDel为长度多态性遗传标记，可利用毛细管电泳平台进行分型检测，操作简便；本发明包括44个位点的甄选，44个位点的引物对设计； 44个位点复合扩增的扩增体系组分开发；以及利用四种荧光物质标记44个位点引物的设计，可实现多位点在同一反应体系中同步并行检测。
2.根据权利要求书1所述，该试剂盒包括44个位点的引物。
3. 根据权利要求书1所述，试剂盒中44个位点复合扩增的扩增组分为 Master mix I、Primer mix、Nuclease-Free Water、Control DNA M308。
4.根据权利要求书1所述，试剂盒中44个位点的分型检测组分为Size StandardOrg500和5-Dye matrix Standards。
5.一种用于法医学降解检材的个体识别与性别确认研究的44个位点复合扩增检测试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：
取待测样品；
采用复合PCR方法，对样本的44个位点进行扩增检测；复合PCR反应体系为20µl，包含人源样本DNA 1µl，Nuclease-Free Water 6.6 µl，Master mix I 12µl，Primer mix 0.4µl；复合PCR热循环反应条件如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃终延伸60min；
取1µl的PCR产物和Size Standard Org 500试剂0.5µl和去离子甲酰胺8.5µl混匀；并设置阳性、阴性对照，混合物在95℃变性3min，立即置冰上冷却3min；采用毛细管电泳遗传分析仪对44个位点进行分型检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，待测样本为人源性的样本DNA。
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| PB01 | Publication | ||
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