CN108546762A - 一种用于法医学个体识别的35个插入/缺失位点的试剂盒 - Google Patents

一种用于法医学个体识别的35个插入/缺失位点的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于法医学新技术研究领域，具体涉及公开一种适用于法医学个体识别研究新的35个插入/缺失（Insertion/Deletion，InDel）位点的复合扩增分型检测体系试剂盒及检测方法。采用四种荧光物质（FAM、HEX、TAMRA和ROX）对35个InDel位点的引物分别进行荧光标记，实现35个位点在同一扩增体系中进行复合扩增，并同步进行检测。本发明提供的InDel位点是长度多态性分子遗传标记，可采用毛细管电泳的方法进行分型，有利于在基层法医单位中应用推广。本发明所述的试剂盒兼容各类生物检材、灵敏度高、特异性强，操作简便快捷。35个InDel位点在无关健康个体中具有较高的累积个体识别率，能够满足法医学个体识别的需要，为法医学实践提供新且有效的检测试剂。

Description

一种用于法医学个体识别的35个插入/缺失位点的试剂盒
技术领域
本发明属于法医学新技术研究领域，具体涉及公开一种适用于法医学个体识别研究新的35个插入/缺失（Insertion/Deletion，InDel）位点的复合扩增分型检测试剂盒。
背景技术
短串联重复是2-6bp的核酸序列组成的重复单元所形成的遗传多态性，因其多态性高的优势，被广泛应用于法医学研究。但是，STR扩增片段多在300bp以上，不利于法医学中降解检材的分型检测。
插入/缺失多态性位点是由于基因组中插入或缺失不同长度的DNA片段所形成的遗传多态性位点。InDel位点在人类基因组中分布广泛，平均每7.2kp就包含一个InDel位点。InDel位点具有候选位点多、稳定性好、多态性较高、种属特异性强、检测灵敏度好、分型操作简单、基因分型结果精准以及突变率低（10-8）等优势，成为法医物证学研究的新热点。
目前国际上常用的InDel分型检测试剂盒Investigator® DIPplex主要是针对欧美人群研发，这些位点在国内群体中多态性程度偏低，多数位点在国内群体中具有较低的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于国内群体法医学个体识别研究的35个InDel位点的复合扩增检测试剂盒。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
1)筛选用于国内群体法医学个体识别研究的InDel位点。我们基于千人数据库中的中国群体（北京汉族、南方汉族和傣族）对InDel位点进行甄选和法医学效能的评估，位点的筛选原则为：a. InDel位点位于内含子区域；b. InDel位点位于不同染色体上或在同一条染色体上至少相距10Mb；c. InDel位点在东亚群体的插入或缺失等位基因的频率分布在0.4-0.6之间；d. InDel位点在国内三个群体（北京汉族、南方汉族和傣族）中均符合Hardy-Weinberg平衡并处于连锁平衡状态。本发明选择rs3028455、rs2308194、rs3067194、rs10629077、rs5846092、rs3082950、rs1160964、rs4210、rs4024564、rs3040095、rs3839237、rs2307433、rs1610945、rs16678、rs25570、rs16646、rs3066543、rs3029940、rs5882232、rs3057689、rs66502133、rs3831219、rs34224758、rs5803454、rs3054057、rs61681053、rs10556291、rs10637537、rs10609615、rs139995318、rs141749783、rs4189、rs6480、rs5840847和rs371194629共35个InDel位点进行分型检测。
2)35个InDel位点的复合扩增体系的构建。本发明采用Primer5.0软件对各位点进行引物设计，同时通过对PCR引物的优化结合四色荧光物质的调配，实现35个InDel位点在同一反应体系中并行检测。
35个InDel位点的复合PCR体系为20µl，具体成分配比如下：人源样本DNA 2µl，Nuclease-Free Water 6µl，2×Master mix 10µl，Primer mix 2µl；复合PCR热循环反应条件如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃终延伸60min。
3)采用毛细管电泳的方法对35个InDel位点进行分型检测，具体步骤如下：取1µl的PCR产物和Size Standard Org 500试剂0.5µl和去离子甲酰胺8.5µl混匀；混合物在95℃变性3min后，立即置冰上冷却3min；最后采用毛细管电泳遗传分析仪对35个InDel位点进行分型检测。
本发明提供一种用于国内群体法医学个体识别的35个新的InDel位点分型检测的试剂盒，包括35个InDel位点复合扩增前和扩增后的体系组分配比以及位点分型检测的操作步骤。本发明采用新一代的分子遗传标记InDel构建法医学个体识别的复合检测试剂盒，相比传统的STR遗传标记，具有突变率低、灵敏度高的优势，对于一些降解的法医物证检材样本本发明的方法仍可获得良好的分型结果；本发明提供的InDel位点被设计为长度多态性位点，可以采用毛细管电泳的方法进行分型检测，因此，便于在基层法医DNA实验室中进行推广应用。
附图说明
图1：实施例中：一个样本的35个InDel位点的基因分型结果图。
具体实施方式
下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明中所用的试剂：2×Master mix，Primer mix，Nuclease-Free Water，Control DNA M308，Size Standard Org500，5-Dye matrix Standards和去离子甲酰胺溶液。
本发明的检测方法如下：
1)取一个个体样本的DNA 2µl，采用本发明给出的PCR反应体系，如下：
组分 体积
Nuclease-Free Water 6µl
2×Master mix 10µl
Primer mix 2µl
DNA样本 2µl
扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃终延伸60min。对35个InDel位点进行复合扩增。
2)在对扩增产物进行毛细管电泳分型检测前，需对使用的遗传分析仪进行光谱校正，具体步骤如下（以3100遗传分析仪为例）：a. 更换测序以上的POP7胶和电泳Buffer；b.取10µl 5-Dye matrix Standards试剂加到200µl的去离子甲酰胺中，震荡混匀，分装至96孔板中的两排，每孔各10µl；c. 95℃变性3min，立即冰上冷却3min；d. 光谱校正时，Dyeset选择“E5”，Run Module选择Fragment Analysis36_POP7。
3)光谱校正后，对扩增产物进行电泳检测，上样检测液的体系组分配比如下：
组分 体积
PCR扩增产物 1µl
Size Standard Org500 0.5µl
去离子甲酰胺 8.5µl
混合物在95℃变性3min，立即置于冰上冷却3min后，再置于毛细管电泳遗传分析仪上进行基因扫描和基因分型检测。
3）结果判读：a. 打开Genemapper ID软件，导入本发明构建的Panel和Bin文件，建立相应的Analysis Method，新建Size Standard（选择Size Standard Org500）；b. 导入电泳数据，选择相应的Panel、Bin、Analysis Method和Size Standard等分析参数，对待测样本的35个InDel位点的电泳结果进行判读。

Claims (5)

1.一种用于法医学个体识别研究的35个InDel位点复合扩增检测试剂盒，其特征在于法医学个体识别研究的35个InDel位点；35个InDel位点的引物对；用于35个InDel位点复合扩增的扩增组分；用于35个InDel位点分型检测的检测组分。
2.根据权利要求书1所述，试剂盒中35个InDel位点复合扩增的扩增组分为2×Mastermix、Primer mix、Nuclease-Free Water、Control DNA M308。
3.根据权利要求书1所述，试剂盒中35个InDel位点的分型检测组分为Size StandardOrg500和5-Dye matrix Standards。
4.一种用于法医学个体识别研究的35个InDel位点复合扩增检测试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：
取待测样品；
采用复合PCR方法，对样本的35个InDel位点进行扩增检测；复合PCR反应体系为20µl，包含人源样本DNA 2µl，Nuclease-Free Water 6µl，2×Master mix 10µl，Primer mix 2µl；复合PCR热循环反应条件如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃终延伸60min；
取1µl的PCR产物和Size Standard Org 500试剂0.5µl和去离子甲酰胺8.5µl混匀；并设置阳性、阴性对照，混合物在95℃变性3min，立即置冰上冷却3min；采用毛细管电泳遗传分析仪对35个InDel位点进行分型检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，待测样本为人源性的样本DNA。
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