CN109136390A - 一种同时鉴别鸡、鸭、羊种属来源的pcr-str方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于法医学新技术研究领域，具体涉及公开一种适用于鸡、鸭、羊物种种属来源鉴别研究的新的3个短串联重复序列（Short tandem repeat，STR）位点的复合扩增分型检测体系及基于毛细管电泳的同步并行基因分型检测方法。采用三种荧光物质（HEX、TAMRA和ROX）对3个STR位点的引物分别进行荧光标记，实现3个STR位点在同一扩增体系中复合扩增及同步并行检测。本发明所述的检测体系具有种属特异性、操作简便快捷、结果容易判读的优势，并且可以对血液、组织、器官、毛发等多种生物检材进行检测。所选择的物种特异性的STR位点在各自的物种中具有高度的种属特异性，可以实现对鸡、鸭、羊三种物种种属来源的鉴别，为法医学、食品检验等领域的物种来源的鉴定研究提供新且有效的检测方法。

Description

一种同时鉴别鸡、鸭、羊种属来源的PCR-STR方法
技术领域
本发明属于法医学新技术研究领域，具体涉及公开一种适用于鸡、鸭、羊物种种属来源鉴别研究新的3个短串联重复序列（Short tandem repeat，STR）位点的复合扩增分型检测体系及基于毛细管电泳的同步并行基因分型检测方法。
背景技术
种属鉴定是指对动物的生物性检材的种属来源进行鉴识研究。随着科技的进步和社会的发展，种属鉴定在食品检验、法科学、濒危物种保护等领域具有广泛的应用。目前，对于动物种属鉴别研究主要是基于形态学、血清学和DNA检测方法。形态学方法相对比较简单，但是方法过于粗糙，受测试者的主观因素影响比较大。血清学的方法对种属来源的鉴定具有较高的价值，可以区分出人源性与非人源性的血痕检材，但无法对具体动物的种属来源作出鉴定；而且血清学检测方法仅仅适用于血液样本的检测，不能对组织、毛发等检材的检测，限制了该方法的实际应用；此外，该方法受环境因素影响较大，存在特异性不高的缺陷。相比以上方法，DNA分子具有稳定性强、特异性高、分析结果容易判读的优势；此外，物种间的根本区别在于DNA碱基序列的差异，尤其是对不同种属的物种；因此DNA的检测方法成为动物物种种属来源鉴定的理想途径。
STR是基因组中广泛分布的遗传标记之一，也是目前遗传学研究的热点之一。STR遗传标记具有多态性好、特异性强的优势，已经被广泛用于法医遗传学等多个领域的研究。通过选择在物种间具有种属特异性强的STR位点，可以实现不同物种的鉴识研究。因此，基于STR遗传标记开发用于不同物种种属来源鉴识研究的试剂盒相比形态学、血清学方法具有较高的优势。为此，我们基于NCBI中的Nucleotide数据库，筛选出鸡、鸭、羊物种种属特异性强的STR位点各一个，基于法医学中复合扩增体系构建的理论知识和相关技术，采用3种荧光物质标记这些位点的引物，实现这些位点的同时分型检测。
发明内容
本发明的内容是基于毛细管电泳的技术平台，开发一种适用于鸡、鸭、羊物种种属鉴识研究新的3个STR位点的复合扩增检测体系。
本发明所构建的体系，不仅能够对血液进行检测，而且可以对组织、器官、毛发等各种生物样本进行检测。
在本发明的实施方案中，每个物种所选择的种属特异性的STR位点、标记的荧光染料、相应的引物序列信息和扩增片段大小如下。
根据既往报道的文献和鸡、鸭、羊物种的基因数据库筛选具有种属特异性的STR位点；同时采用NCBI BLAST工具初步评估筛选位点的种属特异性；每个物种各选出3个位点用于进一步评估；采用Primer 5.0 软件设计位点的引物，然后对位点的物种特异性进行单一PCR扩增验证，同时评估位点的实际扩增效果，最终每个物种各保留一个位点用于复合扩增体系的构建。鸡、鸭、羊物种最终确定的位点分别是MCW21、APH13和 M82875。
本发明的另一个目的是提供STR位点的检测方法，所述试剂盒主要用于鸡、鸭、羊物种的种属鉴识研究；具体步骤如下。
1. 提取鸡、鸭、羊物种的DNA样本，采用研发的3个STR位点的复合扩增体系对这些DNA样本分别进行分型检测。本发明PCR反应体系为25μL，具体包括10μL 2.5×Master mix，5μL 5×Primer mix，1μL 5U/μL Taq DNA聚合酶，2μL 样本DNA和7μL的去离子水。PCR反应条件为95℃预变性2min；然后94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；60℃终延伸30 min。
2. 本发明对样本DNA进行PCR扩增后，取1μL的PCR扩增产物，加至8.5μL的去离子甲酰胺和0.5μL AGCU Marker SIZ-500的混合液中混匀；混合物在95℃变性3min，立即置于冰上冷却3min，然后进行毛细管电泳分型检测。
本发明提供一种基于毛细管电泳技术对3个新的STR位点进行分型检测的方法。该方法包括扩增前和扩增后的体系组分配比以及每个位点分型检测的操作步骤。本发明采用法医学中常用的遗传标记STR位点构建用于动物物种（鸡、鸭、羊）种属鉴识研究的复合扩增体系，相比既往的形态学和血清学方法，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测生物样本种类多的优势；根据电泳后片段的有无，进而判断检材的物种来源，操作简便，结果容易判读；此外，STR位点主要表现出长度多态性，该方法可以采用毛细管电泳的方法进行分型检测，因此，这更便于在基层法医、食品检验等相关部门的DNA实验室中的推广应用。本发明为法医学、食品安全、肉源掺假（以鸡或鸭肉冒充羊肉）等领域的物种来源的鉴定研究提供新且有效的检测方法。。
附图说明
图1为本发明实施例中对鸡物种DNA样本MCW21位点复合扩增后的毛细管电泳图谱。
图2为本发明实施例中对鸭物种DNA样本APH13位点复合扩增后的毛细管电泳图谱。
图3为本发明实施例中对羊物种DNA样本M82875位点复合扩增后的毛细管电泳图谱。
具体实施方式
下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例：
本发明所用的试剂有2.5×Master mix，5×Primer mix，5U/μL Taq DNA聚合酶，去离子水，去离子甲酰胺溶液和AGCU Marker SIZ-500 DNA分子量内标。
所述发明中包含的每个物种种属特异性的STR位点及相应位点的引物序列信息如下：
检测方法：
1）取一个物种的DNA样本2µl，采用本发明给出的PCR反应体系，如下：
组分 体积
去离子水 7µl
2.5×Master mix 10µl
5U/μL Taq DNA聚合酶 1µl
5×Primer mix 5µl
DNA样本 2µl
扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；60℃终延伸30min。
2）在完成样本的3个STR位点复合扩增后，取1μL的PCR扩增产物，加至8.5μL的去离子甲酰胺和0.5μL AGCU Marker SIZ-500的混合液中混匀；混合物在95℃变性3min，立即置于冰上冷却3min后，再置于毛细管电泳遗传分析仪上进行基因扫描和基因分型检测。
3）结果判读。根据每个位点中的电泳峰的有无，确定鸡、鸭、羊物种检材的种属来源，如对于鸡种属特异性的MCW21位点，有荧光峰存在时，则可认为检材是来源于鸡物种，否则排除鸡物种。鸡、鸭、羊物种3个STR位点的分型结果见图1-3。

Claims (4)

1.开发一种基于毛细管电泳分型技术，用于鸡、鸭、羊物种种属来源鉴别研究新的3个短串联重复序列（Short tandem repeat，STR）位点的复合扩增分型检测体系，本发明采用三种荧光染料标记3个STR位点的引物，实现这些位点的复合扩增和同步检测，每个物种种属特异性的位点以及标记的荧光物质如下。
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述试剂盒包含3个STR位点的引物，具体如下。
3.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测组分包括2.5×Master mix，5×Primer mix，5U/μL Taq DNA聚合酶，去离子水，去离子甲酰胺溶液和AGCU Marker SIZ-500 DNA分子量内标。
4.权利要求书1-3任一项所述检测体系的检测方法，所述的检测方法可以对血液、组织、器官和毛发等多种检材进行检测，适用于鸡、鸭、羊物种种属来源的鉴别研究，具体步骤如下：（1）提取鸡、鸭、羊物种检材的DNA样本，采用所述检测体系中的试剂进行3个STR位点的复合PCR反应；PCR反应体系包括10μL 2.5×Master mix，5μL 5×Primer mix，1μL 5U/μLTaq DNA聚合酶，2μL样本DNA和7μL的去离子水；复合PCR循环反应条件如下：95℃预变性2min；然后94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；60℃终延伸30 min；（2）取1µl的PCR产物加至8.5μL的去离子甲酰胺和0.5μL AGCU Marker SIZ-500的混合液中混匀；混合物在95℃变性3min，立即置冰上冷却3min；采用毛细管电泳遗传分析仪对3个STR点进行分型检测；（3）结果判读、数据处理与分析。
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