CN109735629B - 一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测猪源性成份的锁式探针‑实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。本试剂盒利用特异的锁式探针(plp)同样品核酸进行等温扩增连接，利用锁式探针上的taqman荧光探针位点，采用Real‑Time PCR技术，通过Ct值对特异性连接后的环状常务进行定性分析，结果准确直观，省时省力；比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的动物源性样品，检测DNA的阈值达到50 fg/μl；试剂耗材成本较低，适用于出入境口岸检疫部门及食品安全检测实验室大批量检测业务以及科研院所的检测研究。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体地说是一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒。
背景技术
肉类掺假一直是食品领域中存在的重要质量问题，特别是高价肉制品中掺杂低价肉原料严重损害消费者利益。目前食品中动物源性成分的鉴定主要是通过形态学、细胞学、生物化学、分子生物学等技术手段。通过分子生物学方法，利用DNA分子序列特异性开发定性、定量检测食品中动物源性成份的技术已成为检测鉴定的研究焦点和主流，也是多数国家检测方法标准中指定的检测方法。
锁式探针（Padlock Probe）是一种较长的单链寡核苷酸片段，由 5'和 3′端两段靶标序列和中间的一段与检测结果无影响的连接序列构成，一般总长约为100bp 左右，由5 部分构成，与靶标序列互补的 T1 和 T2 检测臂，保证了检测的特异性；中间的 P1 和P2 通用引物结合区；Zip 区域可变区域，根据不同的检测需要来设计，一般可设计分子信标、杂交探针或是荧光探针等，可利用荧光探针进行实时荧光 PCR 扩增，保证检测的灵敏性，也可利用杂交探针结合方向斑点杂交技术或是 DNA 芯片技术实现高通量的检测。锁式探针这种独特的设计，保证了特异性、灵敏性和高通量性,已广泛运用在免疫分析、核酸检测、细胞原位分析等领域。
本发明基于锁式探针技术，针对猪基因序列中的保守片段，设计特异性锁式探针（Padlock Probe），建立一套基于锁式探针技术的动物源性成分检测鉴定试剂盒。
现有技术存在的问题：本发明公开一种用于检测动物源性的试剂盒，本试剂盒的发明克服了现有常规检测方法步骤繁琐、耗时耗力、灵敏度不高、试剂有毒不环保等缺点，该试剂盒所含试剂环保无毒、操作简单、探针和引物特异性强、检测灵敏度非常高，达到50fg/μL，试剂盒成本低，适用于口岸检疫部门日常业务的检测。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒，利用设计锁式探针、Taqman探针和扩增引物序列及优化的反应体系实现猪肉制品的检测。
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒，试剂盒包括如下成分：
（1）猪源性锁式探针 2OD；
（2）PCR Forward Primer (5’-ATTGGTTTTGCCTCCTTGTG-3’) 2OD；
（3）PCR Reverse Primer (5’-TCAGACCCGTGTATGAACGA -3’) 2OD；
（4）Taqman Probe (5’FAM-ATCCGACTAGGCGCT-3’MGB) 2OD；
（5）RNase-free ddH2O 1.5ml；
（6）核酸外切酶 I（20U/ul） 30μl；
（7）核酸外切酶 Ⅲ（100U/ul） 20μl；
（8）Taq DNA连接酶(40000U/ml) 1ml；
（9）10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液1ml；
（10）10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液1ml；
（11）Taq DNA连接酶缓冲液（10×）1ml；
（12）猪源成分核酸阳性对照 100μl；
（13）猪源成分核酸阴性对照 100μl。
优选的，所述猪源性锁式探针的序列为：ATTCTGGGCTTGCTGGGTATGAGTAGCACAAGGAGGCAAAACCAATTCAGACCCGTGTATGAACGAATCCGACTAGGCGCTGTTTTGAGTTCGGTTG。
优选的，Taqman Probe中FAM为羧基荧光素，MGB (Minor Groove Binder)为小沟结合物荧光探针。
优选的，该检测试剂盒使用所需要仪器包括：Real-time PCR扩增仪、高压灭菌离心管、微量移液枪和高压灭菌枪头。
优选的，该检测试剂盒保存方法：-20℃保存，防止污染。
一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测方法，采用该试剂盒进行检测，包括如下步骤：
1.探针及引物稀释
探针和引物在开盖前离心5min，然后根据nmol数，使用RNase-free ddH2O配制成浓度为XμM Oligo溶液。配制浓度为XμM Oligo溶液加入RNase-free ddH2O体积：V(ml)=nmol数/X。
2.连接反应
如附图6所示，按下列组分配置连接反应液（反应液在冰上配置）：Taq DNA 连接酶0.15 μl；10×Taq DNA连接酶缓冲液1μl；Padlock Probe 1 μl；RNase-free ddH2O 6.85 μl；DNA 1μl；总反应体积10 μl。反应物置于PCR仪上94℃5min；（94℃ 15s，65℃ 5min）15循环；95℃ 15min；反应结束后立即将反应管冰浴 5min。
3.消化反应
如附图7所示，按下列组分配置连接反应液（反应液在冰上配置）：核酸外切酶Ⅲ0.25 μl；10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液 2 μl；核酸外切酶 Ⅲ 0.1μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL；ddH2O 5.65μL；Total 10 μl。向冰浴后的反应管中加入上述混合液。混合液在PCR仪上反应：37℃ 2h，90℃ 2.5h。
4. Real-time PCR反应
如附图8所示，Premix Ex Taq 10µL；PF 1µL；PR 1µL；Probe 0.4µL；RNase-freedd H2O 6.8µL；消化产物1µL。采用附图2所示条件进行反应。PCR扩增标准程序：（1）HoldStage:预变性，Reps:1，95℃ 5min；（2）PCR Stage:PCR反应：Reps：40，95℃ 15秒，60℃1min。
5.实验结果分析
反应结束后确认Real-time PCR反应扩增曲线及CT值。待测样品２个平行样检测结果CT≥35，阳性对照检测20≤CT≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品未检出猪肉源。
待测样品２个平行样检测结果CT≤36，阳性对照检测20≤CT≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品检出猪肉源。
待测样品２个平行样检测结果36＜CT＜40并出现典型的扩增曲线，阳性对照检测20≤CT≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。
附图说明
图1是Real-time PCR反应条件。
图2是本发明的主要技术路线。
图3是本发明的检测特异性示意图。
图4是本发明的检测灵敏度示意图。
图5是本发明的锁式探针、扩增引物与荧光探针列表。
图6是本发明的环化连接体系。
图7是本发明的消化体系。
图8是本发明的荧光定量PCR反应体系(20ul)。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供了一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒，试剂盒包括如下成分：
（1）猪源性锁式探针 2OD（如附图5所示）；
（2）PCR Forward Primer(5’-ATTGGTTTTGCCTCCTTGTG-3’) 2OD；
（3）PCR Reverse Primer(5’-TCAGACCCGTGTATGAACGA -3’) 2OD；
（4）Taqman Probe(5’FAM-ATCCGACTAGGCGCT-3’MGB) 2OD；
（5）RNase-free ddH2O 1.5ml；
（6）核酸外切酶 I（20U/ul）30μl；
（7）核酸外切酶 Ⅲ（100U/ul）20μl；
（8）Taq DNA连接酶(40000U/ml) 1ml；
（9）10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液1ml；
（10）10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液1ml；
（11）Taq DNA连接酶缓冲液（10×）1ml；
（12）猪源成分核酸阳性对照 100μl；
（13）猪源成分核酸阴性对照 100μl。
进一步地，所述猪源性锁式探针的序列为：ATTCTGGGCTTGCTGGGTATGAGTAGCACAAGGAGGCAAAACCAATTCAGACCCGTGTATGAACGAATCCGACTAGGCGCTGTTTTGAGTTCGGTTG。
进一步地，PCR Forward Primer采用广州伯信生物工程有限公司合成，纯度为：2OD。
进一步地，Taqman Probe中FAM为羧基荧光素，MGB (Minor Groove Binder)为小沟结合物荧光探针，采用广州伯信生物工程有限公司合成。
进一步地，核酸外切酶 I 优选宝生物公司TaKaRa 的2650A型号产品、核酸外切酶Ⅲ优选宝生物公司TaKaRa 的2170A型号产品，Taq DNA连接酶优选Biolabs公司的 M0208型号的产品。
进一步地，10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液优选宝生物公司TaKaRa 的2170A型号产品、核酸外切酶Ⅰ缓冲液优选宝生物公司TaKaRa 的2650A型号产品，Taq DNA连接酶缓冲液优选Biolabs公司的 M0208型号的产品。
进一步地，猪源成分核酸阳性对照采用宝生物TAKARA公司的阳性DNA样品。
进一步地，猪源成分核酸阴性性对照采用宝生物TAKARA公司的阴性DNA样品。
进一步地，该检测试剂盒使用所需要仪器包括：Real-time PCR扩增仪、高压灭菌离心管、微量移液枪和高压灭菌枪头。
进一步地，该检测试剂盒保存方法：-20℃保存，防止污染。
实施例2
本实施例提供了一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测方法，采用该试剂盒进行检测，如附图1所示，包括如下步骤：
1.探针及引物稀释
探针和引物在开盖前离心5min，然后根据nmol数，使用RNase-free ddH2O配制成浓度为XμM Oligo溶液。配制浓度为XμM Oligo溶液加入RNase-free ddH2O体积：V(ml)=nmol数/X。
2.连接反应
如附图6所示，按下列组分配置连接反应液（反应液在冰上配置）：Taq DNA 连接酶0.15 μl；10×Taq DNA连接酶缓冲液1μl；Padlock Probe 1 μl；RNase-free ddH2O 6.85 μl；DNA 1μl；总反应体积10 μl。反应物置于PCR仪上94℃5min；（94℃ 15s，65℃ 5min）15循环；95℃ 15min；反应结束后立即将反应管冰浴 5min。
3.消化反应
如附图7所示，按下列组分配置连接反应液（反应液在冰上配置）：核酸外切酶Ⅲ0.25 μl；10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液 2 μl；核酸外切酶 Ⅲ 0.1μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL；ddH2O 5.65μL；Total 10 μl。向冰浴后的反应管中加入上述混合液。混合液在PCR仪上反应：37℃ 2h，90℃ 2.5h。
4. Real-time PCR反应
如附图8所示，Premix Ex Taq 10µL；PF 1µL；PR 1µL；Probe 0.4µL；RNase-freedd H2O 6.8µL；消化产物1µL。采用附图2所示条件进行反应。PCR扩增标准程序：（1）HoldStage:预变性，Reps:1，95℃ 5min；（2）PCR Stage:PCR反应：Reps：40，95℃ 15秒，60℃1min。
5.实验结果分析
反应结束后确认Real-time PCR反应扩增曲线及CT值。待测样品２个平行样检测结果CT≥35，阳性对照检测20≤CT≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品未检出猪肉源。
待测样品２个平行样检测结果CT≤36，阳性对照检测20≤CT≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品检出猪肉源。
待测样品２个平行样检测结果36＜CT＜40并出现典型的扩增曲线，阳性对照检测20≤CT≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。
实施例3
本实施例提供了一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒特异性及灵敏度评价，包括如下方法和步骤：
1材料和方法
1.1供试样本
猪肉、鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉各1份。
1.2核酸制备
用液氮研磨肉块，采用市场常见普通DNA提取试剂盒（如：宝生物公司通用DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit）提取样本DNA，用超微量核酸蛋白仪（艾本德公司BioSpectrometer basic）测量提取DNA浓度，-20℃保存。
1.3探针的特异性测试
以不同肉类DNA作为模板，对该探针进行实时荧光PCR的特异性检测。按试剂盒说明书配置PCR反应液，同时设置阳性对照、阴性对照及空白对照。连接体系如下：
Taq DNA 连接酶 0.15 μl；10×Taq DNA连接酶缓冲液 1μl；Padlock Probe 1 μl；RNase-free ddH2O 6.85 μl；DNA 1μl；Total 10 μl。
消化体系：核酸外切酶 I I 0.25μL；10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液 2μL；核酸外切酶Ⅲ 0.1μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液 2μL；ddH2O 5.65μL；Total 10 μl。
实时荧光体系：Premix Ex Taq 10µL；PF 1μL；PR 1μL；Probe 0.4μL；ddH2O 6.8µL；消化产物 1µL；Total 20 μl。
1.4探针的灵敏度测试
用超微量核酸蛋白仪测量阳性样本DNA浓度，再将提取DNA进行10倍梯度稀释，稀释10管：5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl。各取1μl作为模板进行实时荧光PCR扩增，反应体系同1.3。以Ct≤36作为阳性标准阈值。
1.5连接反应
按照如下步骤PCR扩增标准程序进行扩增：94℃5min，94℃15s，65℃5min，15个循环，95℃15min。
1.6消化反应
将反应后的溶液冰浴5min,配置10μl混合溶液（10×ExoⅢ缓冲液2µL；10×Exo I缓冲液 2µL；Exo Ⅲ 0.1 µL；ExoI 0.25 µL；RNase-free dd H2O 5.65 µL）加入冰浴后的反应管中，PCR反应37℃ 2h，90℃2.5h。
1.7 Real-time PCR反应
Premix Ex Taq 10µL， PF 1µL，PF 1µL， Probe 0.4µL，RNase-free ddH2O 6.8µL，消化产物4µL。按照PCR扩增标准程序进行扩增：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。Real-time PCR仪器设置探针报告荧光基团FAM和淬灭荧光基团GEB。以CT≤35作为阳性标准阈值。
2结果分析
2.1探针的特异性
采用该试剂盒所提供的探针，对购买的猪肉进行实时荧光PCR的特异性检测。结果显示探针对猪肉制品及阳性对照均表现特异性阳性扩增，荧光信号增加，而其他非猪肉样本及阴性对照没有表现荧光信号，说明供试样本不掺杂猪肉（附图3）。表明该试剂盒探针对猪肉具有非常好的特异性。
2.2探针的灵敏度测试
超微量核酸蛋白仪测量阳性样本DNA浓度为18μg/ml，将原液DNA模板与10倍梯度稀释后的DNA模板同时进行实时荧光PCR扩增，5ng/μl 、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl均有明显的扩增曲线，50fg/μl CT值大于36（附图4），因此该混合探针灵敏度为5×10-5μg/ml，即50fg/μl，远远高于普通PCR灵敏度。
有益效果：近年来，食品安全一直是国人关心的热点问题，肉制品掺假就是其中让人深恶痛绝的事件，尤以低价肉假冒牛羊肉为甚。基于PCR技术的普及，已有多种PCR方法应用于肉类产品猪源性成分检测，已经报导的包括PCR法，荧光定量PCR法，多重实时荧光 PCR法以及微滴数字PCR法。不过上述方法均存在缺陷。普通的PCR方法成本高，检测时间长，耗费人力物力；荧光定量PCR法成本高，而且假阳性出现概率比其他方法要高；多重实时荧光PCR法步骤繁琐，不易操作；微滴数字PCR法作为新近出现的技术，对于设备要求高，需要特定设备才能开展，检测成本高，不易于广泛推广。因此，本发明希望能为肉制品中猪源性成分鉴定提供新的PCR检测方法。
锁式探针具有极佳的特异性和灵敏度，实用性强，因此近来广泛用于微生物、病原物种类检测与鉴定。不过目前未有使用锁式探针进行猪源性成分检测的报道。本发明基于猪线粒体基因组特异性保守序列设计锁式探针和PCR引物，建立了基于锁式探针的荧光定量PCR检测肉制品中猪源性成分快速检测技术。该技术了结合了锁式探针的高特异性与荧光定量PCR的高灵敏性，可在试验的鸭肉、猪肉、羊肉和牛肉中特异性地检测出猪源性DNA成分，检测浓度达到50fg/μl。这些结果表明基于锁式探针的荧光定量PCR法具有高度特异性和灵敏度。
在锁式探针设计中，靶基因选择是首要考虑的问题。相比较于核基因组，线粒体基因组尽快速度更快，种内遗传稳定，种间高度变异，即使亲源关系较近的种属也存在有特异的线粒体组基因。其次，在所有细胞中均有大量的线粒体，保证可大量获得模板DNA。另外，在肉制品制作过程中核基因组经常被破坏，然而线粒体基因组经过特殊处理后仍能保持完整。因此线粒体组DNA已经广泛应用于动物源性检测。
另外，如何保证探针特异性也是十分重要的方面。锁式探针具有单碱基错配识别功能，如果错配位置位于探针3`末端，由于错配会导致连接失败。因此，我们选取具有高度种属特异性的16s rDNA作为模板靶标DNA序列，将锁式探针的3`末端选择在与16s rDNA序列高度一致的碱基序列位置，保证锁式探针3`末端与靶标DNA完全互补，确保检测的特异性。
本发明设计特异性锁式探针，结合荧光定量PCR技术对靶基因进行扩增。经验证，本发明特异性好，灵敏度高，可有效快速检测猪源性成分，为肉类掺假鉴定提供了新的技术手段。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心
<120> 一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 97
<212> DNA
<213> Sus barbatus
<400> 1
Attctgggct tgctgggtat gagtagcaca aggaggcaaa accaattcag acccgtgtat 60
Gaacgaatcc gactaggcgc tgttttgagt tcggttg 97
Claims (1)
1.一种基于锁式探针技术的食品中猪源性成分检测试剂盒，其特征在于，包括如下成分：
(1)猪源性锁式探针2OD，所述猪源性锁式探针如序列表SEQ ID NO：1所示；
(2)2OD的PCR Forward Primer，序列为：5’-ATTGGTTTTGCCTCCTTGTG-3’；
(3)2OD的PCR Reverse Primer，序列为：5’-TCAGACCCGTGTATGAACGA-3’；
(4)2OD的Taqman Probe，序列为：5’FAM-ATCCGACTAGGCGCT-3’MGB；
(5)RNase-free ddH2O 1.5mL；
(6)20U/ul的核酸外切酶I 30μL；
(7)100U/ul的核酸外切酶Ⅲ20μL；
(8)40000U/mL的Taq DNA连接酶1mL；
(9)10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液1mL；
(10)10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液1mL；
(11)10×Taq DNA连接酶缓冲液1mL；
(12)猪源成分核酸阳性对照100μL；
(13)猪源成分核酸阴性对照100μL。
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| PB01 | Publication | ||
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Address after: 730000 Lanzhou, Chengguan District, Gansu River Road, No. 2168 Applicant after: Lanzhou Customs Technical Center Address before: 730010, Nanhe Road, Chengguan District, Gansu, Lanzhou, 2168 Applicant before: INSPECTION AND QUARANTINE COMPREHENSIVE TECHNOLOGY CENTER, GANSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BEREAU |
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| GR01 | Patent grant | ||
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