CN110551799A

CN110551799A - 检测食品中海狸鼠源性和狐狸源性成分的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110551799A
Application number: CN201910969310.7A
Authority: CN
Inventors: 薛晨玉; 姜洁; 王丹; 宋丽萍; 穆同娜; 毛婷; 杨红莲; 胡智恺; 李恩静; 郭淼; 毕思丹
Original assignee: Beijing Food Safety Monitoring And Risk Assessment Center (beijing Food Inspection Institute)
Current assignee: Beijing Food Safety Monitoring And Risk Assessment Center (beijing Food Inspection Institute)
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2019-12-10

Abstract

本发明提供检测食品中海狸鼠源性和狐狸源性成分的试剂盒及其应用。试剂盒中含有检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的特异性PCR引物对及荧光探针，序列见SEQ ID NO:1‑3和SEQ ID NO:4‑6。本发明还提供基于所述引物对和荧光探针建立的食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的实时荧光定量PCR检测方法。本试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好(可检测到样品中100 fg的海狸鼠源性、狐狸源性成分)，为食品中海狸鼠源性、狐狸源性成分的检测提供了新方法。本发明提供的荧光定量PCR技术可以准确快速地同时实现对食品中海狸鼠源性、狐狸源性成分的鉴别检测，1～2h内即可完成检测。

Description

检测食品中海狸鼠源性和狐狸源性成分的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR检测技术，具体地说，涉及检测食品中海狸鼠源性和狐狸源性成分的试剂盒及其应用。

背景技术

随着我国经济发展水平的提高，居民餐桌上动物源食品的比重越来越高。市场上的肉制品因其来源不同价格差异很大，一些不法商贩以便宜的肉类冒充或掺混进贵的肉类中贩卖以图暴利。近年来，有媒体报道一些不法分子用狐狸肉冒充牛羊肉贩卖，这种行为严重影响了消费者的健康，造成了民众恐慌。除了狐狸以外，海狸鼠也已经作为一种重要的毛皮动物在国内广泛养殖。海狸鼠肉肉质细腻，营养丰富可食用，由于其价格低廉，常被不法分子掺入到混合肉中进行售卖。为满足当前食品安全监需求，需要一种能够快速、准确、灵敏的监测食品中狐狸源性成分和海狸鼠源性成分的方法以缩短食品检测工作时间，提高工作效率。

食品中动物源性成分的检测主要分为两类，一是以蛋白质为基础的检测方法如色谱法、质谱法；二是以核酸为靶位点的检测方法，如普通PCR法、荧光PCR法、基因芯片法等。由于核酸热稳定性较强，不易随加工过程变性分解，基于核酸的检测技术更适合应用于食品中。随着分子生物学技术的法展，以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已成为食品中动物源性成分鉴定的核心方法。相对于普通PCR技术，荧光PCR技术特异性强，灵敏度高，检测用时短，能有效提高检测效率，更有利于加强市场监管的时效性。

哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)在遗传上相对独立，基因组小，拷贝数多，既有保守区又有可变区。因此，与核DNA分子标记相比，用mtDNA分子标记鉴别动物源性成分具有灵敏度高、精确度好、DNA降解小等优势。基于动物线粒体DNA的荧光PCR检测技术在动物源性成分鉴别中具有广阔的应用前景。

目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，然而，针对海狸鼠源性成分和狐狸源性成分检测的荧光PCR方法尚未见报导。因此，建立动物源性产品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分实时荧光定量PCR检测方法，对提高突发事件应急处理能力，提升食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供检测食品中海狸鼠源性和狐狸源性成分的试剂盒及其应用。

本发明的另一目的是提供检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的特异性PCR引物对、与其配合使用的荧光探针以及基于所述引物对和荧光探针建立的食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的实时荧光定量PCR检测方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的特异性PCR引物对，包括用于检测海狸鼠源性成分的上游引物1和下游引物1以及用于检测狐狸源性成分的上游引物2和下游引物2，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:4-5所示。

第二方面，本发明提供与所述引物对配合使用的荧光探针，与SEQ ID NO:1-2所示引物对配合使用的荧光探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，与SEQ ID NO:4-5所示引物对配合使用的荧光探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

第三方面，本发明提供所述引物对和/或所述荧光探针的以下任一应用：

A、在检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分中的应用；

B、在制备食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物以及荧光探针，根据需要该引物和荧光探针可以是冻干形式或溶于缓冲液中。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于荧光定量PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具，例如所述试剂盒优选还包括DNA裂解液、荧光定量反应液、阳性标准模板、阴性模板(ddH₂O)等中的至少一种。

第四方面，本发明提供检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的方法(实时荧光定量PCR检测法)包括以下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用所述引物对和所述荧光探针进行PCR扩增反应；

3)分析PCR扩增产物。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：95℃预变性5-10min；95℃变性15s，60℃退火及延伸1min，40个循环。

本发明每次检测样本时需设立阴性对照和阳性对照。样本结果判断标准如下：

①具有S型扩增曲线，Ct值<35.0时样品结果为阳性；

②Ct值≥40.0时样品结果为阴性；

③若检测结果Ct值在35-40之间应调整DNA浓度进行复检。

优选地，步骤1)采用蛋白酶K消化法提取的食品样品中的DNA。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好(可检测到样品中100fg的海狸鼠源性成分和狐狸源性成分)，为食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的检测提供了新方法。本发明提供的荧光定量PCR技术可以准确快速地实现对食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的鉴别检测，可在1～2h内完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，不仅能为检测海狸鼠源性食品提供新的方法，而且能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度。

附图说明

图1为本发明海狸鼠CYTB-Probe探针的设计位置。

图2为本发明狐狸COX1-Probe探针的设计位置。

图3为本发明实施例3中海狸鼠、狐狸特异性检测试验。

图4A～图4I为本发明实施例4中对引物探针用量配比的优化试验。其中，图4A～图4I分别对应于表4中A～I实验组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1引物的设计及优化

经大量比对GenBank中公布的COX1基因序列，选取COX1基因具有物种特异性基因序列为模板，设计狐狸COX1特异性引物对和Taqman探针，分别命名为狐狸COX1-F、狐狸COX1-R、狐狸COX1-Probe；经大量比对GenBank中公布的CYTB基因序列，选取CYTB基因具有物种特异性基因序列为模板，设计海狸鼠CYTB特异性引物对和Taqman探针，分别命名为海狸鼠CYTB-F、海狸鼠CYTB-R、海狸鼠CYTB-Probe，用于Taqman实时荧光PCR扩增的引物和探针序列如下：

CYTB-F：5`-ACTACTCCCCATACTCCATATTTCAAA-3`(SEQ ID NO:1)

CYTB-R：5`-TTACTAGGATTCATAGGAGGGATTGG-3`(SEQ ID NO:2)

CYTB-Probe：5`-VIC-CAACGTGCCATAACATTCCGCCCA-BHQ1-3`(SEQ ID NO:3)

COX1-F：5`-TGGAGCATCAGTGGACCTTACA-3'(SEQ ID NO:4)

COX1-R：5`-GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3'(SEQ ID NO:5)

COX1-Probe：5`-FAM-CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-BHQ1-3'(SEQ ID NO:6)

线粒体基因组具有分子结构简单、无重组、与核基因组无共同序列、进化速率快、多拷贝及分子钟理论等优点，相比核DNA更容易检测，亲缘关系相近的物种都能够得到区分和鉴定。线粒体细胞色素C氧化酶第I亚基(COX1)基因是作为一种线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，因其拥有较多的发育信号，且进化速率适中，经常被用于种群间的进化分化研究。本发明通过将狐狸COX1基因与其他亲缘关系相近的物种COX1基因进行比对，选择特异性较强的417-525位碱基作为靶区域进行引物设计，探针位置如图2所示。

细胞色素b(Cytochrome b，Cytb)基因就其结构和功能而言是mtDNA的13个蛋白质编码基因中了解得最清楚的基因之一。Cytb基因与其他线粒体基因相比进化速度适中，它在属间、种间具有多样性，常用作种间及科以上分类单位的进化研究。本发明通过将海狸鼠Cytb基因与其亲缘关系相近的物种Cytb基因进行比对，选择特异性较强的906～988位碱基作为靶区域进行引物设计，探针位置如图1所示。

实施例2实时荧光定量PCR检测方法的建立

1、提取样品DNA

(1)取海狸鼠肉、狐狸肉混合样本0.2g，尽量剪碎。置于1.5ml离心管中加入1ml细胞裂解缓冲液[细胞裂解缓冲液即CTAB缓冲液，其配制方法如下：将CTAB 4g，NaCl16.364g，1M Tris-HCl 20ml(pH8.0)和0.5M EDTA8ml，先用70ml ddH₂O溶解，再定容至200ml灭菌(121℃高压灭菌15min)，冷却后加入0.2-1％2-巯基乙醇400ul和氯仿-异戊醇(体积比24:1)100ml，摇匀即可]，20μl蛋白酶K(500μg/ml)，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12,000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

(2)加入等体积的酚:氯仿混合液(体积比1:1)，振荡混匀，12,000rpm离心10min。

(3)取上清液至另一管，加入等体积的氯仿，振荡混匀，12,000rpm离心10min。

(4)取上清液至另一管，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀10min，12,000rpm离心10min。

(5)弃上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min。

(6)重复步骤5一次。

(7)弃上清，将沉淀至室温干燥5min。

(8)加50μl TE或dd H₂O溶解沉淀，然后置于4℃或-20℃保存备用。

2、采用实施例1的引物和探针，上述DNA为模板，以海狸鼠和狐狸基因组DNA为阳性对照，以无核酸双蒸水为阴性对照，对荧光定量PCR检测体系进行测试。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火及延伸1min，40个循环。

扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。

每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照。样本结果判断标准如下：

①具有S型扩增曲线，Ct值<35.0时样品结果为阳性；

②Ct值≥40.0时样品结果为阴性；

③若检测结果Ct值在35-40之间应调整DNA浓度进行复检。

实施例3特异性试验

为验证本发明试剂盒及所建立的实时荧光定量PCR检测方法的特异性，以海狸鼠与狐狸基因组DNA为阳性对照，以猪，黄牛，绵羊，鸡，鸭，鸽子，鹌鹑，鸵鸟、灰雁，猫，小鼠，大鼠，狗，马，骆驼，鹿，狍子的基因组DNA为检测对象，利用实施例2建立的荧光定量PCR方法，验证本方法的特异性。

扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。设两个平行样本，实验结果为两个样本的平均值实验结果见图3，结果显示海狸鼠的Ct值为20.84，狐狸的Ct值为28.25，其余17个物种的Ct值均大于35，该实验证明本试剂盒具有良好的物种特异性。

表1本方法对25种动物DNA的检测结果

物种

猪

黄牛

绵羊

鸡

鸭

狗

Ct值

N/A

物种

小鼠

大鼠

猫

狐狸

骆驼

狍子

鹿

Ct值

N/A

28.25

N/A

物种

马

鸵鸟

灰雁

鸽子

鹌鹑

海狸鼠

ddH<sub>2</sub>O

Ct值

N/A

20.65

N/A

注：表中结果为一次实验两个重复的平均值。N/A表示无荧光信号。

实施例4灵敏度试验

为验证试剂盒及其检测方法的灵敏度，将海狸鼠基因组DNA梯度稀释为：1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl的稀释液；将狐狸基因组稀释为1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl的稀释液并以这些稀释液作为阳性对照，以无核酸双蒸水为阴性对照，利用实施例2建立的荧光定量PCR方法，验证本方法的灵敏度。

扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。每个稀释梯度设10个平行样本，实验结果为10个样本Ct值的平均值。海狸鼠灵敏度实验结果见表2，狐狸灵敏度分析结果见表3。结果显示本发明的检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的荧光定量PCR方法可检测到100fg的海狸鼠源性成分。说明本发明方法具有良好的灵敏度。

表2海狸鼠成分检测灵敏度分析结果

DNA含量	1ng	100pg	10pg	1pg	100fg
						Ct值	21.07	24.49	27.84	31.31	35.08

注：表中Ct值为10个平行样本Ct值的平均值。

表3狐狸成分检测灵敏度分析结果

DNA含量	1ng	100pg	10pg	1pg
					Ct值	26.69	30.23	33.98	37.95

注：表中Ct值为10个平行样本Ct值的平均值。

实施例5对引物探针用量配比的优化

本实施例对引物探针的用量配比按照表4进行了检测分析(分别设置A～I实验组)，实验结果如图4A～图4I所示，通过对两组探针的荧光值比较，最终选择I组配比为最佳引物用量配比。

表4狐狸成分检测灵敏度分析结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）

<120> 检测食品中海狸鼠源性和狐狸源性成分的试剂盒及其应用

<130> KHP191114246.9

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actactcccc atactccata tttcaaa 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttactaggat tcataggagg gattgg 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caacgtgcca taacattccg ccca 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggagcatca gtggacctta ca 22

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcgggaggt tttatattga taatag 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctgcacct ggccggagtc 20

Claims

1.检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的特异性PCR引物对，其特征在于，包括用于检测海狸鼠源性成分的上游引物1和下游引物1以及用于检测狐狸源性成分的上游引物2和下游引物2，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:4-5所示。

2.与权利要求1所述引物对配合使用的荧光探针，其特征在于，与SEQ ID NO:1-2所示引物对配合使用的荧光探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，与SEQ ID NO:4-5所示引物对配合使用的荧光探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.权利要求1所述引物对和/或权利要求2所述荧光探针的以下任一应用：

A、在检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分中的应用；

4.食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的检测试剂或试剂盒，其特征在于，有效成分为权利要求1所述引物对和/或权利要求2荧光探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA裂解液、荧光定量反应液、阳性标准模板中的至少一种。

6.检测食品中海狸鼠源性成分和狐狸源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物对和权利要求2所述荧光探针进行PCR扩增反应；

3)分析PCR扩增产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系为：2×GoTaq qPCRMaster Mix 10.0μL，10μM上游引物1 0.5μL，10μM下游引物1 0.5μL，10μM上游引物2 1.5μL，10μM下游引物2 1.5μL，10μM荧光探针1 0.5μL，10μM荧光探针2 1.0μL，1ng/μL DNA模板1.0μL，ddH₂O 7.5μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应程序为：95℃预变性5-10min；95℃变性15s，60℃退火及延伸1min，40个循环。

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，根据Ct值判定检测结果：

①具有S型扩增曲线，Ct值<35.0时样品结果为阳性；

②Ct值≥40.0时样品结果为阴性；

③若检测结果Ct值在35-40之间应调整DNA浓度进行复检。