CN108251534B - 一种快速检测肉源食品用多重pcr检测试剂盒 - Google Patents

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CN108251534B CN201810016749.3A CN201810016749A CN108251534B CN 108251534 B CN108251534 B CN 108251534B CN 201810016749 A CN201810016749 A CN 201810016749A CN 108251534 B CN108251534 B CN 108251534B
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Abstract

本发明提供了一种快速检测肉源食品用多重PCR检测试剂盒，由“公共引物”介导，可以鉴定食品或动物制品中鼠、狐狸、鸭、羊成分，属于动物源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒公开了鼠、狐狸、鸭、羊4种物种特异性引物对，羊特异性引物是能特异性扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物对，采用本发明的引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品中是否含有羊种源性成分；同时，能鉴别是否掺有鼠源，狐源，鸭源的成分；另外，通过多重PCR检测，可一次性鉴别源鼠源，狐源，鸭源和羊源成分。本试剂盒具有较高的敏感度、可重复性、操作简单而且成本比较低，适用性广，可用于混合肉制品肉源的筛选和鉴定检测。

Description

一种快速检测肉源食品用多重PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种快速检测肉源食品用多重PCR检测试剂盒，可用于羊肉成分鉴定及动物制品中鼠、狐狸、鸭、羊成分。
背景技术
羊肉不仅味道鲜美还能补血益气，温中暖肾，是进补的佳品，但是由于羊的生长周期长、多胎率低、养殖成本高，造成羊肉价格远高于鸡、鸭肉等肉类价格，并且随着消费者意识到羊肉具有更高的营养价值以及消费水平的提高，市场对羊肉的需求日益增加，在高价以及供不应求的情况下，不少商家铤而走险，加入了“羊肉造假大军”。市场上羊肉掺假主要有三种：用猪、鸭肉等掺入羊肉，病禽肉掺入羊肉及老鼠、狐狸等非人类常用肉类掺入羊肉。第一种至少是用正规的肉类掺假，后两种则对人体有害，不管何种掺假，都是在欺诈消费者，都破坏了市场秩序。
目前，国内外报道的肉类鉴别的主要方法包括传统感官鉴别、免疫学方法、核酸检测方法，以及近年发展的如生物芯片、近红外光谱分析技术和质谱分析技术等。免疫学方法利用抗体对蛋白的识别来区别肉类品种，与传统鉴别技术相比，较灵敏可靠，但各种肉类特异性抗体难以制备，检测结果存在交叉反应，易出现假阳性结果，特别是加工食品蛋白易受到破坏和分解，导致检查结果易出现假阴性且方法的重复性差。近年发展的生物芯片、近红外光谱分析技术和质谱分析等技术存在一些暂时无法有效解决或客观存在的缺点，如成本高、频繁维护和改进模型等原因，该类检测技术短期内仍无法有效推广应用。因此，建立快速、准确、敏感的多重PCR肉源检测技术是严格监测市场上肉制品安全的基础和关键之一。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于羊源性成分特异性检测的引物以及提供用于羊源性成分检测的检测试剂盒；同时还提供了羊源性成分鉴定及动物性制品中鼠源、狐狸源、鸭源性成分鉴定的方法，本发明公开的引物种属间特异性差异明显，可以实现一次性鉴别出鼠、狐狸、鸭、羊4个物种的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
羊特异性引物对，所述羊特异性引物对可以特异性扩增SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列，优选的，所述羊特异性引物对的序列如下：
5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCAGGTTTGTGCCAATATATGGAATT-3'。
SEQ ID No.1序列如下:
ATCTCCCAGCTC CATCAAATAT TTCATCATGA TGAAACTTTG GCTCTCTCCT AGGCATTTGCTTAATTTTAC AGATTCTAAC AGGCCTATTC CTAGCAATAC ACTATACACC TGACACAACA ACAGCATTCTCCTCTGTAAC CCACATTTGC CGAGACGTAA ACTATGGCTG AATTATCCGA TATATACACG CAAACGGGGCATCAATATTT TTTATCTGCC TATTTATGCA TGTAGGACGA GGCCTATATT ATGGATCATA TACCTTCCTAGAAACATGAA ACATCGGAGT AATCCTCCTA TTTGCGACAA TAGCCACAGC ATTCATAGGC TATGTCTTACCATGAGGACA AATATCATTC TGAGGAGCAA CAGTTATTAC CAACCTCCTT TCAGCAATTC CATATATTGGCACAAACCT
本发明还公开了引物对，所述引物对为羊特异性引物对、鼠特异性引物对、狐狸特异性引物对、鸭特异性引物对中的一种或几种；
所述羊特异性引物对如下：
羊上游引物：5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
羊下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCAGGTTTGTGCCAATATATGGAATT-3'
所述鼠特异性引物对如下：
鼠上游引物：5’-ATCATCAGAACGCCTTATTAGC-3’
鼠下游引物：5’-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGTTCGTCCTTTTGGTGTATG -3’
所述狐狸特异性引物对如下：
狐狸上游引物：5'-GTCAAATCATAGGTGAAACCCC-3’
狐狸下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCTAGAGAAGGAAGAGCAATCAGG-3’
所述鸭特异性引物对如下：
鸭上游引物：5'-CATCAACAAAGAGTGCGTCAAA-3'
鸭下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGTTTAACCTAGGTCACTGGGCA -3’。
本发明还公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括引物对与公共引物，所述引物对为羊特异性引物对、鼠特异性引物对、狐狸特异性引物对、鸭特异性引物对中的一种或一种以上；
所述羊特异性引物对如下：
羊上游引物：5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
羊下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCAGGTTTGTGCCAATATATGGAATT-3'
所述鼠特异性引物对如下：
鼠上游引物：5’-ATCATCAGAACGCCTTATTAGC-3’
鼠下游引物：5’-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGTTCGTCCTTTTGGTGTATG -3’
所述狐狸特异性引物对如下：
狐狸上游引物：5'-GTCAAATCATAGGTGAAACCCC-3’
狐狸下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCTAGAGAAGGAAGAGCAATCAGG-3’
所述鸭特异性引物对如下：
鸭上游引物：5'-CATCAACAAAGAGTGCGTCAAA-3'
鸭下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGTTTAACCTAGGTCACTGGGCA -3’；
所述公共引物如下：
5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'。
上述技术方案中，所述试剂盒还包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对、Taq DNA MasterMix、阳性对照DNA 模板中的一种或几种。
本发明还公开了上述引物对或者试剂盒在检测肉源食品中羊源性成分、鼠源性成分、狐狸源性成分、鸭源性成分中的一种或几种中的应用。尤其是本发明以自主研发的基于“公共引物”介导的多重PCR分子诊断技术为基础，针对引物间的相互作用和检测通量低这对多重PCR发展和应用的主要技术瓶颈，建立系统的、由“公共引物”介导的多重PCR技术体系，同时，以羊、鼠、狐狸、鸭这四种肉源作为检测靶标，能在一个反应管内一次检出这4种肉源，所公开的多重PCR检测试剂盒包括引物对与公共引物，所述引物对为羊特异性引物对、鼠特异性引物对、狐狸特异性引物对、鸭特异性引物对中的两种或两种以上。
本发明公开的特异性引物或检测试剂盒在肉源性成分鉴定或在肉类制品分子鉴定中有优异的应用，尤其可对动物制品中鼠、狐狸、鸭、羊成分进行多重PCR检测。
本发明还公开了检测肉源食品中肉源性成分的方法，包括以下步骤：
提取样品线粒体基因组DNA作为模板；然后在公共引物存在下，将羊特异性引物对、鼠特异性引物对、狐狸特异性引物对、鸭特异性引物对中的一种或几种按比例混合后与模板进行PCR反应；最后对PCR反应的产物进行分析完成肉源食品中肉源性成分的检测；
所述羊特异性引物对如下：
羊上游引物：5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
羊下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCAGGTTTGTGCCAATATATGGAATT-3'
所述鼠特异性引物对如下：
鼠上游引物：5’-ATCATCAGAACGCCTTATTAGC-3’
鼠下游引物：5’-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGTTCGTCCTTTTGGTGTATG -3’
所述狐狸特异性引物对如下：
狐狸上游引物：5'-GTCAAATCATAGGTGAAACCCC-3’
狐狸下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCTAGAGAAGGAAGAGCAATCAGG-3’
所述鸭特异性引物对如下：
鸭上游引物：5'-CATCAACAAAGAGTGCGTCAAA-3'
鸭下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGTTTAACCTAGGTCACTGGGCA -3’；
所述公共引物如下：
5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'。
上述技术方案中，对PCR反应的产物进行分析时以去离子水为空白对照，以模板为阳性对照，本发明中对PCR反应的产物进行分析可用2%琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法进行。
上述技术方案中，所述公共引物的终浓度为；0.1～0.45μM；当选择羊特异性引物对、鼠特异性引物对、狐狸特异性引物对、鸭特异性引物对进行多重PCR体系进行PCR反应时，公共引物、羊上游引物、鼠上游引物、狐狸上游引物、鸭上游引物、羊下游引物、鼠下游引物、狐狸下游引物、鸭下游引物的终浓度比为1.5:1:1:1:1:1:1:0.125:0.03。
上述技术方案中，PCR反应的条件为95℃预加热5min，95℃变性30s，70℃退火10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行10个循环，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行24个循环，最后72℃延伸10min。
本发明的PCR 扩增可以用上述的鼠、狐狸、鸭、羊特异性引物对分别与鼠、狐狸、鸭、羊的DNA模板进行PCR反应，以去离子为空白对照；还可以用上所述的鼠、狐狸、鸭、羊特异性引物分别与以鼠、狐狸、鸭、羊等比例混合的DNA 模板进行PCR 扩增，以去离子水为空白对照，所用引物按公共引物、羊上游引物、鼠上游引物、狐狸上游引物、鸭上游引物、羊下游引物、鼠下游引物、狐狸下游引物、鸭下游引物的终浓度比为1.5:1:1:1:1:1:1:0.125:0.03的比例混合，进行多重PCR 扩增，以鼠、狐狸、鸭、羊中的一种或多种等比例混合的DNA模板为阳性对照，以去离子水为空白对照。
本发明的PCR扩增的反应试剂包括Taq 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对中的一种或多种；或者还包括下述试剂中的一种或多种：Taq DNAMasterMix、阳性对照DNA 模板、去离子水。
本发明的PCR扩增结果判定方法是：当PCR 反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中检测出对照品肉源性成分；当PCR反应无扩增产物或产物与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出对照品成分；如果阳性样品未检测预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或操作失误。
比如以羊为对照品可以检测样品中羊源成分，此外，以鼠、狐狸或鸭线粒体基因组DNA 为阳性对照，利用上述引物或试剂盒还可以进一步判断其是否含有鼠、狐狸或鸭源性成分。
尤其是，本发明还提供动物制品中羊、鼠、狐狸或鸭源性成分的多重PCR 检测方法，将上述引物按公共引物、羊上游引物、鼠上游引物、狐狸上游引物、鸭上游引物、羊下游引物、鼠下游引物、狐狸下游引物、鸭下游引物的终浓度比为1.5:1:1:1:1:1:1:0.125:0.03的比例混合，可进行多重PCR 扩增，以羊、鼠、狐狸或鸭等比例混合DNA 模板为阳性对照，以去离子水为空白对照；利用上述引物或试剂盒还可以进一步进行羊、鼠、狐狸或鸭的快速检测，方便混合样品的检测。本发明中检测结果可用2%琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测。
本发明提供了一种鉴定羊源性成分及动物制品中鼠、狐狸、鸭、羊成分的由“公共引物”介导的多重PCR方法，可判定样品中是否含有羊种源性成分；同时，能鉴别是否掺有鼠源，狐源，鸭源的成分。本试剂盒具有较高的敏感度、可重复性、操作简单而且成本比较低，适用性广，可用于混合肉制品肉源的筛选和鉴定检测。
附图说明
图1为实施例PCR反应程序；
图2为4种引物对单引物单模板方法特异性检测电泳图；
图3为4种引物对单引物多模板方法特异性检测电泳图；
图4为4种引物对多引物单模板检测电泳图；
图5为4种引物对多引物二模板检测电泳图；
图6为4种引物对多引物三模板检测电泳图；
图7为4种引物对多引物四模板检测电泳图；
图8为多重体系敏感性检测电泳图。
具体实施方式
实施例中，
所述羊特异性引物对如下：
羊上游引物：5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
羊下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCAGGTTTGTGCCAATATATGGAATT-3'
所述鼠特异性引物对如下：
鼠上游引物：5’-ATCATCAGAACGCCTTATTAGC-3’
鼠下游引物：5’-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGTTCGTCCTTTTGGTGTATG -3’
所述狐狸特异性引物对如下：
狐狸上游引物：5'-GTCAAATCATAGGTGAAACCCC-3’
狐狸下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCTAGAGAAGGAAGAGCAATCAGG-3’
所述鸭特异性引物对如下：
鸭上游引物：5'-CATCAACAAAGAGTGCGTCAAA-3'
鸭下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGTTTAACCTAGGTCACTGGGCA -3’；
所述公共引物如下：
5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'。
实施例1 鼠、狐狸、鸭、羊引物对的特异性检测
（1） 采集鼠、狐狸、鸭、羊样品各1g，于-20℃下保存备用；
（2） DNA 模板制备， DNA 模板制备分别用柱式动物线粒体DNA提取试剂盒PCR级（北京百奥莱博）或者公认的、具有相同效力的其他提取方法；纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度稀释为20ng/μL；
（3）PCR 检测与结果分析
单引物单模板方法
在PCR 反应管中依次加入反应试剂( 如表1 所示)，引物分别为鼠、狐狸、鸭、羊的特异性引物对，及其相应的模板。进行PCR 反应，程序见附图1；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图2为特异性检测结果，其中第1泳道空白对照，第2泳道到第5泳道分别是鼠、狐、鸭、羊，目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
单引物多模板
在PCR 反应管中依次加入反应试剂( 如表1 所示)，引物分别为鼠、狐、鸭、羊的引物对，模板为混合模板（鼠：狐：鸭：羊=1:1:1：1）；进行PCR 反应，程序见附图1；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图3为特异性检测结果，其中第1泳道空白对照，第2泳道到第5泳道分别是鼠、狐、鸭、羊，目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
表1 PCR反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明使用的Taq Master Mix购自ThermoFisher公司。
实施例2 多重PCR体系的特异性检测
（1）采集鼠、狐狸、鸭、羊样品各1g，于-20℃下保存备用；
（2） DNA 模板制备，DNA 模板制备分别用柱式动物线粒体DNA提取试剂盒PCR级（北京百奥莱博）或者公认的、具有相同效力的其他提取方法；纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度分别稀释为20ng/μL；
（3）PCR 检测与结果分析
将试剂盒内引物按公共引物、羊上游引物、鼠上游引物、狐狸上游引物、鸭上游引物、羊下游引物、鼠下游引物、狐狸下游引物、鸭下游引物的终浓度比为1.5:1:1:1:1:1:1:0.125:0.03的比例混合；首先分别配置5μM的公共引物溶液，分别配置10μM的羊上游引物溶液、鼠上游引物溶液、狐狸上游引物溶液、鸭上游引物溶液、羊下游引物溶液、鼠下游引物溶液、0.125μM狐狸下游引物溶液、0.03μM鸭下游引物溶液；分别取3微升公共引物溶液、1微升的羊上游引物溶液、鼠上游引物溶液、狐狸上游引物溶液、鸭上游引物溶液、羊下游引物溶液、鼠下游引物溶液、狐狸下游引物溶液、鸭下游引物溶液组成11微升混合溶液，取2微升混合溶液作为表2的混合引物。
多引物单模板的方法
反应体系如表2，反应程序见附图1；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图4为检测结果其中第1泳道空白对照，第2泳道到第5泳道分别是鼠、狐、鸭、羊，目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
多引物二模板的方法
反应体系如表2，反应程序见附图1；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图5为检测结果，其中第1泳道空白对照，第2泳道到第7泳道分别是鼠和狐、鼠和鸭、鼠和羊、狐和鸭、狐和羊、鸭和羊。2条目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
多引物三模板的方法
反应体系如表2，反应程序见附图1；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图6为检测结果，其中第1泳道空白对照，第2泳道到第5泳道分别是鼠,、狐和鸭；鼠、狐和羊；鼠、鸭和羊；狐、鸭和羊。每个泳道3条目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
多引物四模板的方法
反应体系如表2，反应程序见附图1；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图7为检测结果，其中第1泳道空白对照，第2泳道到第5泳道分别是鼠、狐、鸭、羊。每个泳道4条目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
表2 PCR反应体系
组分 体积(μL)
Taq master Mix 12.5
混合引物 2
模板（20 μl/ng） 1
去离子水至 25
实施例3 多重体系的敏感性检测
（1）采集鼠、狐狸、鸭、羊样品各1g，于-20℃下保存备用；
（2） DNA 模板制备， DNA 模板制备分别用柱式动物线粒体DNA提取试剂盒PCR级（北京百奥莱博）或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度分别稀释为20ng/μL；
（3）PCR 检测与结果分析
体系敏感性检测采用多引物单模板的方法，与实施例二一样，将试剂盒内引物按公共引物、羊上游引物、鼠上游引物、狐狸上游引物、鸭上游引物、羊下游引物、鼠下游引物、狐狸下游引物、鸭下游引物的摩尔比为1.5:1:1:1:1:1:1:0.125:0.03的比例混合，反应体系如表2，反应程序见附图1；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图8为体系敏感性的检测结果，a-d分别是鼠，狐狸，鸭，羊各个模板浓度在4、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05ng/ul模板浓度下多引物单模板的电泳图，第1泳道空白对照，第2泳道到第5泳道这 4个泳道均能跑出清晰可辨目的条带；图中各产物条带大小分别为：鼠：114bp；狐：294bp；鸭：387bp；羊：439bp；鸭，羊检测敏感性达到0.1ng/ul模板浓度，鼠检测敏感性达到0.2ng/ul模板浓度，狐狸检测敏感性达到0.05ng/ul模板浓度；0.1ng/ul 的模板浓度都有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。
序列表
<110> 苏州市药品检验检测研究中心（苏州市药品不良反应监测中心）
苏州大学
<120> 一种快速检测肉源食品用多重PCR检测试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 421
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atctcccagc tccatcaaat atttcatcat gatgaaactt tggctctctc ctaggcattt 60
gcttaatttt acagattcta acaggcctat tcctagcaat acactataca cctgacacaa 120
caacagcatt ctcctctgta acccacattt gccgagacgt aaactatggc tgaattatcc 180
gatatataca cgcaaacggg gcatcaatat tttttatctg cctatttatg catgtaggac 240
gaggcctata ttatggatca tataccttcc tagaaacatg aaacatcgga gtaatcctcc 300
tatttgcgac aatagccaca gcattcatag gctatgtctt accatgagga caaatatcat 360
tctgaggagc aacagttatt accaacctcc tttcagcaat tccatatatt ggcacaaacc 420
t 421
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gacctcccag ctccatcaaa catctcatct tgatgaaa 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
gtcaaatcat aggtgaaacc cc 22
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
ccttccttcc ttccccccta gagaaggaag agcaatcagg 40
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
catcaacaaa gagtgcgtca aa 22
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
ccttccttcc ttccccccgt ttaacctagg tcactgggca 40
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
ccttccttcc ttcccccc 18

Claims (3)

1.羊特异性引物对，其特征在于；所述羊特异性引物对可以特异性扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述羊特异性引物对的序列如下：
5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCAGGTTTGTGCCAATATATGGAATT-3'。
2.引物对，所述引物对为羊特异性引物对、鼠特异性引物对、狐狸特异性引物对、鸭特异性引物对中的一种或几种；
所述羊特异性引物对如下：
羊上游引物：5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
羊下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCAGGTTTGTGCCAATATATGGAATT-3'
所述鼠特异性引物对如下：
鼠上游引物：5’-ATCATCAGAACGCCTTATTAGC-3’
鼠下游引物：5’-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGTTCGTCCTTTTGGTGTATG -3’
所述狐狸特异性引物对如下：
狐狸上游引物：5'-GTCAAATCATAGGTGAAACCCC-3’
狐狸下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCTAGAGAAGGAAGAGCAATCAGG-3’
所述鸭特异性引物对如下：
鸭上游引物：5'-CATCAACAAAGAGTGCGTCAAA-3'
鸭下游引物：5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCCGTTTAACCTAGGTCACTGGGCA -3’。
3.权利要求2所述引物对在检测肉源食品中羊源性成分、鼠源性成分、狐狸源性成分、鸭源性成分中的一种或几种中的应用。
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