CN107058498B

CN107058498B - 一种检测牛、羊、猪源性成分的三重实时荧光pcr方法

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Publication number: CN107058498B
Application number: CN201710052775.7A
Authority: CN
Inventors: 孙端方; 李春宇; 田志强; 董睿; 寻思颖; 罗绍楠; 刘廷菊
Original assignee: Guizhou Product Quality Inspection And Testing Institute
Current assignee: Guizhou Product Quality Inspection And Testing Institute
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2037-01-24
Also published as: CN107058498A

Abstract

检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，具有样品DNA、一对通用引物和三条探针、荧光PCR预混液、阳性对照等4个要素；根据牛、绵羊和山羊、猪的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发和淬灭荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体做法包括：建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物体系；建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR试剂盒；确定检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法。本发明具有标准误差小、检测时间短、可同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；适用于动物产品的真假鉴别。

Description

一种检测牛、羊、猪源性成分的三重实时荧光PCR方法

技术领域

本发明涉及包括基因的鉴定方法，特别涉及动物产品的源性检测及真假鉴别的方法。

背景技术

当前，动物产品的绝大部分有添加香精香料、添加调味剂，且经过加工，消费者仅通过观察和感官品评，难辨真伪。

在利用分子生物学技术鉴定动物产品真伪及掺假检测的方法研究中，通过PCR技术扩增并检测目标动物源性基因，是目前主流的科学依据和技术手段，近年来得到广泛的应用。常规PCR技术在该领域具有如下几个特点：①绝大多数动物产品可以提取到DNA；②设计合理的引物对可特异性地识别目的动物源性基因；③核心设备为PCR仪。

常规PCR为第一代PCR技术，而第二代PCR技术为实时定量荧光PCR(以下简称荧光PCR)。荧光PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。相对常规PCR具有如下特点：①特异性探针的加入，进一步提升了整个PCR扩增的特异性；②PCR扩增过程即检测过程，反应结束即可获得检测结果，整体检测时间更短；③核心设备为实时定量荧光PCR仪。

多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于实时定量荧光PCR的一种，首先针对多个目的基因，逐项设计特异性的引物对和探针序列；接着在多个探针上分别标记不同波长的荧光基团及淬灭基团，从而可以对一个PCR反应管内的DNA模板同时进行多个目的基因的荧光PCR扩增并发出不同荧光信号，被多通道实时定量荧光PCR仪中相应的多波长检测器捕获，达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通的荧光PCR有如下优点：①每增加一套引物对和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂的成本降低一倍；②核心设备为多通道实时定量荧光PCR仪。

中国专利数据库中涉及动物源性成分鉴定的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如20151012723.2《同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒》、201610272771.5《一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用》、201510527762.1《鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光PCR检测方法》等，本申请件与这些申请件在检测领域和对象上各不相同，核心的引物、探针序列及荧光标记也完全不同。

发明内容

本发明旨在提供检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，以解决动物制品的真假鉴别问题。

发明人提供的检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，具有三重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和三条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；发明特点是根据牛(Bos taurus)、绵羊(Ovis aries)和山羊(Capra aegagrus)、猪(Sus scrofa)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(英文名Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，以下简称GAPDH)基因设计引物和探针，仅能对目标序列进行扩增并激发和淬灭荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体的做法包括：

第一步，建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物和探针体系；

第二步，建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR试剂盒；

第三步，确定检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的三重荧光PCR引物体系，在可同时检测FAM、HEX、TARMA等荧光激发信号和MGB荧光淬灭信号的三通道及以上的多重荧光PCR仪上进行扩增和检测。

上述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物体系见附录：序列1为牛、羊、猪的通用上游引物，序列2为牛、羊、猪的通用下游引物，序列3为牛特异性探针，序列4为羊特异性探针，序列5为猪特异性探针。序列3、4、5在5’端分别用FAM、HEX、TARMA荧光激发基团修饰，3’端均为MGB荧光淬灭基团修饰。

上述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR试剂盒成分如下所示：

①引物溶液：包括序列1、2所示引物，浓度均为20μmol/L，使用1.5mL无色透明离心管封装；

②探针溶液：包括序列3、4、5所示探针，浓度均为10μmol/L，使用1.5mL棕色不透明离心管封装；

③荧光PCR试剂：经验证可适用于所述的三重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装，包括荧光PCR预混液、ROX染料、三蒸水；

④阳性对照：包括含有序列1和序列2所示引物扩增目的片段的牛、羊、猪源性DNA，浓度均为10⁵拷贝/μL左右，使用1.5mL无色透明离心管封装。

上述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法中，所述待测样品总DNA来源：对于待测样品，可通过试剂法、柱膜法、磁珠法等分子生物学DNA提取方法或外购试剂盒，提取样品DNA；所述多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50μL体系进行反应液配制，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定；所述判定条件包括：

①质控标准：阳性对照的FAM、HEX、TARMA荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤28；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。

②阳性样品：当①成立时，FAM或(和)HEX或(和)TARMA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出牛或(和)羊或(和)猪源性成分。

③阴性样品：当①成立时，FAM或(和)HEX或(和)TARMA无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出牛或(和)羊或(和)猪源性成分。

④疑似样品：当①成立时，FAM或(和)HEX或(和)TARMA有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，重复检测一次。复检结果Ct值≥40.0，表明该样品未检出牛或(和)羊或(和)猪源性成分；复检结果Ct值<40.0，表明该样品检出牛或(和)羊或(和)猪源性成分。

上述反应液配制如表1所示：

表1反应液配方

注1：当荧光PCR仪需要ROX染料校准时加入相应浓度，否则不应添加，具体要求荧光PCR仪说明书。

注2：阳性对照为所述试剂盒成分“阳性对照”，阴性对照为非牛、羊、猪源性DNA或三蒸水，空白对照为三蒸水。

上述设置的反应条件如表2所示：

表2反应条件

注1：生物热敏抗体为20–120s；化学热敏抗体为10–15min。

注2：检测荧光信号。

本发明相对多重PCR方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为10⁵级时，定量标准误差在10⁴级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μL级)的优点；相对荧光PCR方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通PCR方法，兼具上述两种优点。

本发明的试剂盒在选用适于三重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装时，选择带热敏Taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；外购的试剂套装中包括ROX染料，对于需要ROX染料的多重荧光PCR仪可提升检测准确性。

本发明方法已应用于贵州省产品质量监督检验院日常相关检测中(检出限0.01％质量分数)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间2/3以上、节约试剂成本2/3以上，具有一定实用价值。

具体实施方式

实施例1自制样品

首先，在本地沃尔玛超市购买牛肉、羊肉、猪肉，粉碎后按1∶1∶1混合制样，接着提取DNA：使用外购DNA提取试剂盒(名称：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0)提取样品DNA；DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.81、DNA浓度为382.75ng/μL，-20℃保存。之后将DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照和空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为TaKaRa Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)，按表3进行配制，按表4设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为Step one plus)。

表3反应体系

表4反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表5：

②检测样品：FAM、HEX、TARMA均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出牛、羊、猪源性成分。

③比对结果：与按照SB/T 10923-2012《肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法》对样品进行牛、羊、猪源性成分检测的结果相符。

表5实验结果

实施例2国家监督抽查风险检测样品---灯影牛肉的检测

配料表包括：牛肉、植物油、芝麻、白砂糖、味精、香辛料、食用盐。过程中使用外购DNA提取试剂盒(ABI MagMAX^TM DNA Isolation Kit)，在ABI MagMAX^TM Express-96磁珠抽提仪上提取样品DNA，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.70、DNA浓度为39.46ng/μL，-20℃保存。之后将DNA用Labogene MiniVac Alpha浓缩仪在60℃真空浓缩至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为鸡源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为

Environmental Master Mix，按表6进行配制，按表7设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

表6反应体系

表7反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表8：

②检测样品：FAM有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出牛源性成分。HEX、TARMA无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出羊、猪源性成分。

表8实验结果

实施例3省级监督抽查检测样品---风干羊肉的检测

配料表包括：羊腿肉、食用盐、香辛料等。过程中使用外购DNA提取试剂盒(TOYOBO

-Genome-)提取样品DNA，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.79、DNA浓度为282.75ng/μL，-20℃保存。之后将DNA浓缩至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为鸭源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为TOYOBO THUNDERBIRD qPCR Mix，按表7进行配制，按表8设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为Step one plus)。

表9反应体系

表10反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表11：

②检测样品：HEX有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出牛源性成分。FAM、TARMA无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出羊、猪源性成分。

表11实验结果

实施例4企业委托样品---干煸肉丝辣椒的检测

配料表包括：菜籽油、辣椒、精瘦猪肉、味精、食盐、白砂糖、花椒。过程中使用外购DNA提取试剂盒——天根深加工食品DNA提取试剂盒提取样品DNA，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.80、DNA浓度为394.69ng/μL，-20℃保存。之后将DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液试剂和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为鹅源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为天根Super Real PreMix(Probe)，按表12进行配制，按表13设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

表12反应体系

表13反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表14：

②检测样品：TARMA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出猪源性成分。FAM、HEX无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出牛、羊源性成分。

表14实验结果

根据4个实施例可见，本发明的三重荧光PCR引物体系及鉴定方法和试剂盒仅对牛、羊、猪的目标基因进行特异性扩增，并在扩增中产生荧光信号并淬灭，可有效适用于牛、羊、猪相关产品的源性检测及真假鉴别，具有一定实用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州省产品质量监督检验院

<120> 一种检测牛、羊、猪源性成分的三重实时荧光PCR方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 牛（Bos taurus）、绵羊（Ovis aries）和山羊（Capra aegagrus）、猪（Susscrofa）

<400> 1

gaatcctgcc cttctcccca tc 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<400> 2

gtcaggcagc tatatttaac cccag 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 3

cttcagaaac cagatccccg t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）和山羊（Capra aegagrus）

<400> 4

ctccagaaac cagatccccg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 猪（Sus scrofa）

<400> 5

cttccagaaa ccagatcccc a 21

Claims

1.检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，具有三重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和三条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；其特征在于：根据牛、绵羊和山羊、猪的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发和淬灭荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方制成试剂盒；具体的做法包括：

第一步，建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物体系；

第三步，确定检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的三重荧光PCR引物体系，在可同时检测FAM、HEX、TARMA激发荧光信号和MGB淬灭荧光信号的三通道及以上的荧光PCR仪上进行扩增和检测；

所述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物体系：序列1为牛、羊、猪的通用上游引物，序列2为牛、羊、猪的通用下游引物，序列3为牛源特异性探针，序列4为羊源特异性探针，序列5为猪源特异性探针；序列3、4、5在5’端分别用FAM、HEX、TARMA荧光激发基团修饰，3’端均为MGB荧光淬灭基团修饰。

2.按照权利要求1所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR试剂盒成分如下所示：

①引物：包括序列1、2所示引物，浓度均为20 μmol/L，使用1.5 mL无色透明离心管封装；

②探针：包括序列3、4、5所示探针，浓度均为10 μmol/L，使用1.5 mL棕色不透明离心管封装；

④阳性对照：包括含有序列1和序列2所示引物扩增目的片段的牛、羊、猪源性DNA，浓度均为10⁵拷贝/μL，使用1.5 mL无色透明离心管封装。

3.按照权利要求1所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法中，所述待测样品总DNA来源：对于待测样品，通过试剂法、柱膜法、磁珠法或外购试剂盒，提取样品DNA；所述多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50 μL体系进行反应液配制，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定；所述判定条件包括：

① 质控标准：阳性对照的FAM、HEX、TARMA荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤ 28；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥ 40.0；

② 阳性样品：当①成立时， FAM或/和HEX或/和TARMA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出牛或/和羊或/和猪源性成分；

③ 阴性样品：当①成立时，FAM或/和HEX或/和TARMA无荧光对数增长，Ct值≥ 40.0，表明该样品未检出牛或/和羊或/和猪源性成分；

④ 疑似样品：当①成立时，FAM或/和HEX或/和TARMA有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，重复检测一次；复检结果Ct值≥ 40.0，表明该样品未检出牛或/和羊或/和猪源性成分；复检结果Ct值< 40.0，表明该样品检出牛或/和羊或/和猪源性成分。

4.按照权利要求3所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述反应液配制如下表所示：

。

5.按照权利要求3所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述反应条件如下表所示：

。