CN108004327A

CN108004327A - 一种检测5种动物源性成分的四重荧光pcr方法

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Publication number: CN108004327A
Application number: CN201710945248.9A
Authority: CN
Inventors: 孙端方; 李春宇; 田志强; 董睿; 寻思颖; 刘廷菊; 陈梅; 张谦
Original assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE
Current assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-05-08

Abstract

检测5种动物源性成分的四重荧光PCR方法，具有样品DNA、引物和探针、荧光PCR预混液、阳性对照4要素；根据田鼠、兔、马、驴、骡5种动物特异基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列则无；做法是：建立检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分四重荧光PCR引物和探针体系；建立检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重荧光PCR试剂盒；确定检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重荧光PCR鉴定法。本发明具有标准误差小、检测时间短、可同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；适用于动物产品的鉴别。

Description

一种检测5种动物源性成分的四重荧光PCR方法

技术领域

本发明涉及包括基因的鉴定方法，特别涉及动物产品的源性检测及真假鉴别的方法。

背景技术

从古至今，仅凭传统感官评价和近代理化检测均不能准确鉴定动物产品中的源性成分，因此在动物产品中偶有掺假造假现象却难于判定。随着现代分子生物学中PCR技术的广泛普及，其对样品DNA的准确鉴定，成为了动物产品中源性成分的重要鉴定方法，很多掺假造假事件从而被检出和曝光。由于掺假动物产品绝大部分有添加香精香料、添加调味剂、已经过深加工等迷惑措施，而普通消费者仅通过感官品评，基本不能辨别，因此食品安全问题堪忧。

PCR技术鉴定动物产品掺假造假的检测方法，是通过在样品DNA中检测物种特异基因，从而判定样品是否含有该物种源性成分。

第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪) 对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。

多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个物种特异基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。

中国专利数据库中涉及动物源性成分鉴定的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如 201410322626.4《一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒》、 201610272771.5《一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用》、201510527762.1《鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光PCR检测方法》等，均侧重于牛、马、驴源性成分的药用价值。且这些专利类似于学术文章，其试剂种类繁多、操作步骤复杂、对实验人员技能要求高，更适于科研领域。对于普通检测单位来说，牛、羊、猪、鸡、鸭源性检测已有成熟的标准方法，商品化试剂盒也较多。鼠、兔、马、驴、骡源性的特色食品虽远不如牛、羊、猪、鸡、鸭源性的常规食品常见，但在我国多地也极具地方特色且有一定市场规模，相关检测方法和试剂较少，从而提出了一定的检测需求；同时，相关检测人员能力参差不齐，对试剂成本、操作简便化、方法标准化等方面也提出了更高要求。

发明内容

本发明旨在提供检测5种动物源性成分的四重荧光PCR方法，以解决鼠、兔、马、驴、骡5种动物制品的真假鉴别问题。

发明人提供的检测5种动物源性成分的四重荧光PCR方法，具有多重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、两套引物和四条探针、荧光 PCR预混液、阳性对照；发明特点是根据田鼠(Microtus)、兔(Oryctolagus cuniculus)、马(Equus caballus)、驴(E.asinus)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因设计引物和探针，仅能对目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体的做法包括：

第一步，建立检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重荧光PCR引物和探针体系；

第二步，建立检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重荧光PCR试剂盒；

第三步，确定检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的四重荧光PCR引物和探针体系，在可同时检测FAM、VI C、Cy3、Cy5荧光激发信号及BHQ1、BHQ2荧光淬灭信号的四通道及以上的多重荧光PCR仪上进行扩增和检测。

上述检测鼠、兔、马、驴、骡5种动物源性成分的四重荧光PCR引物体系见附录：序列1为鼠、兔的通用上游引物，序列2为鼠、兔的通用下游引物，序列3为马、驴的通用上游引物，序列4为马、驴的通用下游引物，序列5为鼠特异性探针，序列6为兔特异性探针，序列7为马特异性探针，序列8为驴特异性探针。序列5、6、7、8在5’端分别用FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光激发基团修饰，序列5、6的3’端均用BHQ1荧光淬灭基团修饰。序列7、8的3’端均用BHQ2荧光淬灭基团修饰。

上述检测鼠、兔、马、驴、骡5种动物源性成分的四重荧光PCR试剂盒成分如下所示：

①引物溶液：包括序列1、2、3、4所示引物，浓度均为20μmol/L；使用1.5mL无色透明离心管封装；

④探针溶液：包括序列5、6、7、8所示探针，浓度均为10μmol/L，使用1.5mL棕色不透明离心管封装；

③荧光PCR试剂：经验证可适用于所述的四重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装，包括荧光PCR预混液、ROX染料、三蒸水；

④阳性对照：包括含有序列1、2、3、4所示引物扩增目的片段的鼠、兔、马、驴、骡源性DNA，浓度均为10⁵拷贝/μL左右，使用1.5mL无色透明离心管封装。

上述检测鼠、兔、马、驴、骡5种动物源性成分的四重荧光PCR鉴定方法中，所述待测样品总DNA来源：对于待测样品，可通过试剂法、柱膜法、磁珠法等分子生物学DNA提取方法或外购试剂盒，提取样品DNA；所述多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50μL体系进行配制，接着设置反应条件，按判定条件进行结果判定；所述判定条件包括：

一.质控标准：阳性对照的FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。满足上述条件后，可进行第二、三项的鼠、兔、马、驴、骡源性成分判定。

二.鼠、兔：

①阳性样品：FAM或/和VIC有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出鼠或/和兔源性成分。

②阴性样品：FAM或/和VIC无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠或/和兔源性成分。

③疑似样品：FAM或/和VIC有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，重复检测一次。复检结果Ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠或/和兔源性成分；复检结果Ct值<40.0，表明该样品检出鼠或/和兔源性成分。

三.马、驴、骡：

①阳性样品：Cy3或Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出马或驴源性成分，且无骡源性成分；Cy3和Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明样品具有以下4种源性成分组合中的1种组合：马、驴，马、骡，驴、骡，马、驴、骡。

②阴性样品：Cy3或/和Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出马或/和驴源性成分，且无骡源性成分。

③疑似样品：Cy3或/和Cy5有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，重复检测一次。复检结果Cy3或/和Cy5的Ct值<40.0，等同“①阳性样品”进行判定；复检结果Cy3或/和Cy5的Ct值≥40.0，等同“②阴性样品”进行判定。

上述反应液配制如表1所示：

表1反应液配方

注1：当荧光PCR仪需要ROX染料校准时加入相应浓度，否则不应添加，具体要求荧光 PCR仪说明书。

注2：阳性对照为所述试剂盒成分“阳性对照”，阴性对照为非鼠、兔、马、驴、骡源性DNA 或三蒸水，空白对照为三蒸水。

上述设置的反应条件如表2所示：

表2反应条件

注1：生物热敏抗体为20–120s；化学热敏抗体为10–15min。

注2：检测荧光信号。

本发明相对多重PCR方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为10⁵级时，定量标准误差在10⁴级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μL级)的优点；相对荧光PCR方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通PCR方法，兼具上述两种优点。

本发明的试剂盒在选用适于四重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装时，选择带热敏Taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；外购的试剂套装中包括ROX染料，对于需要ROX染料的多重荧光PCR仪可提升检测准确性。

发明人指出：骡(E.asinus×caballus)是马(E.caballus)、驴(E.asinus) 的种间杂种，其63条染色体由马32条染色体和驴31染色体共同构成，即骡核基因组兼有且只有马、驴的核基因组，导致在使用PCR技术对马、驴、骡的相关产品进行定性鉴定时，可以根据马基因组设计马的特异性引物和探针、可以根据驴基因组设计驴的特异性引物和探针，但根据骡基因组设计的特异性引物和探针即是马或/和驴的特异性引物和探针，从而导致以下情况：准确鉴定可在马和驴双阴性、马或驴单阳性时获得：①马基因阴性、驴基因阴性——没有马、驴、骡源性成分；②马基因阳性、驴基因阴性——只有马源性成分，没有驴、骡源性成分；③马基因阴性、驴基因阳性——只有驴源性成分，没有马、骡源性成分。若实验结果为马和驴双阳性，则样品可能为马、驴，马、骡，驴、骡，马、驴、骡这4种组合中的任意1种组合。实际生产上，驴皮药用价值较高、驴肉在华北地区食用广泛，我省有马肉菜式、云南有骡子干巴等特产，上述产品的销售价格从驴皮、驴肉、马肉、骡肉价格依次递减，因而能满足实际检测需要。

本发明方法已应用于贵州省产品质量监督检验院日常相关检测中(检出限0.01％质量分数)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；相对标准方法节约操作时间3/4以上、节约试剂成本3/4以上，具有一定实用价值。

附图说明

图1为实验结果的曲线图。

图中：曲线1-4与曲线5-8分别为检测样品与阳性对照的FAM、VIC、 Cy3、Cy5荧光信号曲线，曲线9-16为阴性对照和空白对照的FAM、VIC、 Cy3、Cy5荧光信号曲线。

具体实施方式

实施例1自制样品

首先，在本地沃尔玛超市购买兔肉、在本地餐饮商铺购买马肉、通过几家外省同行业检测单位分别赠予田鼠肉、驴肉、骡肉，粉碎后按1∶ 1∶1∶1∶1混合制样，接着提取DNA：使用外购DNA提取试剂盒(ABI MagMAX^TM DNA Isolation Kit)在ABI MagMAX^TM Express-96磁珠抽提仪上提取样品DNA；DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.81、浓度为217.13ng/μL，-20℃保存。将DNA稀释至50ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为牛、羊、猪源性 DNA，空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为Path-ID^TM qPCR MasterMix，按表3进行配制，按表4设置相关参数上机检测(ABI 荧光PCR仪，型号为QuantStudio 5)。

表3反应体系

表4反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见图1和表5：

①图1中曲线1至4与曲线5至8分别为检测样品与阳性对照的FAM、 VIC、Cy3、Cy5荧光信号曲线，曲线9至16为阴性对照和空白对照的FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光信号曲线。

②质控标准：阳性对照的FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。

③检测样品：FAM、VIC、Cy3、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出鼠、兔源性成分，并具有以下4种源性成分组合中的1种组合：马、驴，马、骡，驴、骡，马、驴、骡。

④比对结果：与按照GB/T 21102-2007《动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法》(下同)、SN/T 3730.4-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第4部分驴成分检测实时荧光PCR法》 (下同)、SN/T 3730.5-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5 部分马成分检测实时荧光PCR法》(下同)对样品进行兔、马、驴源性成分检测的结果相符；鼠源性结果与省内同行业检测单位比对检测结果相符。

表5实验结果：实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线

实施例2企业委托样品---田鼠干的检测

配料表包括：山田鼠、食用盐、酱油、味精、香辛料。使用外购DNA 提取试剂盒(ABIMagMAX^TM DNA Isolation Kit)在ABI MagMAX^TM Express-96磁珠抽提仪上提取样品DNA，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.80、浓度为103.45ng/μL，-20℃保存。将DNA稀释至50ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为植物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为 Path-ID^TM qPCR Master Mix，按表6进行配制，按表7设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

表6反应体系

表7反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表8：

①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。

②检测样品：FAM有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出鼠源性成分。VIC、Cy3、Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出兔、马、驴、骡源性成分。

③比对结果：与按照GB/T 21102-2007、SN/T 3730.4-2013、SN/T 3730.5-2013对样品进行兔、马、驴源性成分检测的结果相符。鼠源性结果与省内同行业检测单位比对检测结果相符。

表8实验结果：实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线

实施例3国家监督抽查风险检测样品---泡椒兔丁的检测

配料表包括：兔肉、植物油、食用盐、白砂糖、辣椒、花椒、芝麻、豆瓣酱、香辛料、味精、鸡精调味料、调味料酒。使用外购DNA提取试剂盒(Toyobo-Genome-)提取样品DNA，DNA纯度为 OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.79、浓度为129.77ng/μL，-20℃保存。将DNA稀释至50ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为植物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光 PCR试剂为Toyobo Thunderbird qPCRMix，按表9进行配制，按表10设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

表9反应体系

表10反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表11：

②检测样品：VIC有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出兔源性成分。FAM、Cy3、Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠、马、驴、骡源性成分。

③比对结果：与按照GB/T 21102-2007、SN/T 3730.4-2013、SN/T 3730.5-2013对样品进行兔、马、驴源性成分检测的结果相符。

表11实验结果：实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线

实施例4省级监督抽查检测样品---餐饮马肉的检测

餐饮马肉主材为生鲜马肉，外部兼有其他腌制调料。使用外购DNA 提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样品DNA，DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.75、浓度为219.35 ng/μL，-20℃保存。将DNA稀释至50ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为植物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为TaKaRaPremix Ex Taq^TM (Probe qPCR)，按表12进行配制，按表13设置相关参数上机检测(ABI 荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

表12反应体系

表13反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表14：

②检测样品：Cy3有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出马源性成分。FAM、VIC、Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠、兔、驴、骡源性成分。

表14实验结果：实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线

实施例4个人委托样品---阿胶的检测

阿胶制作工艺复杂，主要原料为驴皮，经深加工后DNA受损严重。先用球磨机将1kg样品粉碎后，加入等体积正己烷和50mL的CTAB抽提液上摇床100r/min萃取5h，然后滤去杂质，再通过分液漏斗分层移去正己烷；加50mL氯仿/异戊醇24∶1溶液混匀，10,000g离心分相去杂质，重复一次；接着用外购试剂盒(QIAamp DNABlood Maxi Kit)提取DNA， DNA纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.62、DNA浓度为1.84ng/μL，-20℃保存。将 DNA用浓缩管(MilliporeMicrocon DNA fast flow(PCR grade))浓缩至10 ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为植物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光 PCR试剂为Multiplex PCR Kit，按表15进行配制，按表16设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。

表15反应体系

表16反应条件

注*：检测荧光信号。

检测结果见表17：

②检测样品：Cy5有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，复检仍有荧光对数增长，且Ct值<40.0，等同阳性样品进行判定，表明该样品检出驴源性成分。FAM、VIC、Cy3无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠、兔、马、骡源性成分。

表17实验结果：实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线

根据4个实施例可见，本发明的四重荧光PCR引物体系及鉴定方法和试剂盒仅对鼠、兔、马、驴、骡5种动物的目标基因进行特异性扩增，并在扩增中产生荧光信号，可有效适用于鼠、兔、马、驴、骡5种动物相关产品的源性检测及真假鉴别，具有一定实用价值。

序列表

<110> 贵州省产品质量监督检验院

<120> 一种检测5种动物源性成分的四重荧光PCR方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 260

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

atntnvrsnc rtsandryct agscncsccc caggtctaca tgttccagtc rtsandryct 60

agscncstcc tggaagatgg tgatggcsca basandsasn sctgtgccta atcacctctt 120

ggscabasan dsasnsttta tcttccttga gcaaccctcr tsactccacc catggcaary 180

ctagscncsa ttccacccac ggcaascaba stggtcatac agtgacagct cccsasnsca 240

gtcatacagt gacagctcct 260

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atntnvrsnr tcasnccccc aggtctacat gttccagt 38

Claims

1.检测5种动物源性成分的四重荧光PCR方法，具有四重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、两套引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；发明特点是根据田鼠、兔、马、驴的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因设计引物和探针，仅能对目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；所述5种动物是鼠、兔、马、驴、骡；具体的做法包括：

第三步，确定检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的四重荧光PCR引物和探针体系，在可同时检测FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光激发信号及BHQ1、BHQ2荧光淬灭信号的四通道及以上的多重荧光PCR仪上进行扩增和检测。

2.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测5种动物源性成分的四重荧光PCR引物体系：序列1为鼠、兔的通用上游引物，序列2为鼠、兔的通用下游引物，序列3为马、驴的通用上游引物，序列4为马、驴的通用下游引物，序列5为鼠特异性探针，序列6为兔特异性探针，序列7为马特异性探针，序列8为驴特异性探针。序列5、6、7、8在5’端分别用FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光激发基团修饰；序列5、6的3’端均用BHQ1荧光淬灭基团修饰，序列7、8的3’端均用BHQ2荧光淬灭基团修饰。

3.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测5种动物源性成分的四重荧光PCR试剂盒成分如下所示：

④阳性对照：包括含有序列1、2、3、4所示引物扩增目的片段的鼠、兔、马、驴、骡源性DNA，浓度均为10⁵拷贝/μL，使用1.5mL无色透明离心管封装。

4.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测5种动物源性成分的四重荧光PCR鉴定方法中，所述待测样品总DNA来源：对于待测样品，可通过试剂法、柱膜法、磁珠法等分子生物学DNA提取方法或外购试剂盒，提取样品DNA；所述多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是先选择25μL或50μL体系进行配制，接着设置反应条件，按判定条件进行结果判定；所述判定条件包括：

一.质控标准：阳性对照的FAM、VIC、Cy3、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。满足上述条件后，可进行第二、三项的鼠、兔、马、驴、骡源性成分判定；

二.鼠、兔：

①阳性样品：FAM或/和VIC有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出鼠或/和兔源性成分；

②阴性样品：FAM或/和VIC无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠或/和兔源性成分；

③疑似样品：FAM或/和VIC有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，重复检测一次。复检结果Ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠或/和兔源性成分；复检结果Ct值<40.0，表明该样品检出鼠或/和兔源性成分；

三.马、驴、骡：

①阳性样品：Cy3或Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出马或驴源性成分，且无骡源性成分；Cy3和Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明样品具有以下4种源性成分组合中的1种组合：马、驴，马、骡，驴、骡，马、驴、骡；

②阴性样品：Cy3或/和Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出马或/和驴源性成分，且无骡源性成分；

③疑似样品：Cy3或/和Cy5有荧光对数增长，且30.0<Ct值<40.0，重复检测一次；复检结果Cy3或/和Cy5的Ct值<40.0，等同“①阳性样品”进行判定；复检结果Cy3或/和Cy5的Ct值≥40.0，等同“②阴性样品”进行判定。

5.按照权利要求4所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述反应液配制如下表所示：

注1：当荧光PCR仪需要ROX reference Dye校准时加入相应浓度，否则不应添加，具体要求荧光PCR仪说明书；

注2：阳性对照为所述试剂盒成分“阳性对照”，阴性对照为非鼠、兔、马、驴、骡源性DNA或三蒸水，空白对照为三蒸水。

6.按照权利要求4所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述反应条件如下表所示：

反应条件

注*1：生物热敏抗体为20–120s；化学热敏抗体为10–15min；

注*2：检测荧光信号。