CN110964837B - 用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒 - Google Patents

用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一特异引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二特异引物对，所述引物组还包括用于区分所述源性成分来源的马、驴、马骡以及驴骡的性别的第三特异引物对，所述第三特异引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。以及含所述引物组的多重PCR检测试剂盒。本发明实施例的用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及其检测试剂盒，在检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分过程中，其耗时短，工作量小，检测结果准确，而且节约检测成本。

Description

用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试 剂盒
技术领域
本发明实施例涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒。
背景技术
目前，马、驴为同源物种，基因组信息相似程度高，二者可杂交产生骡，马骡、驴骡的相似度特别高，仅凭肉眼观察经常会出错；其次，对于来源于马、驴、马骡、驴骡的组织样品用一般的方法很难分辨，尤其是来源与马、驴、马骡、驴骡中原料制品，例如，阿胶等产品，该产品是由驴的皮张经过煎煮、浓缩而制成，其具有改善睡眠、健脑益智等功能。但是，该产品中，不良商家通过掺入马皮、马骡或者驴骡的皮，而制得的产品会危害食用者的身体健康。而现有技术中，大多采用基因组测序方法去鉴定马、驴、马骡、驴骡源性成分，其工作繁琐，耗时长。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒，以解决现有技术中检测的马、驴、马骡以及驴骡源性成分繁琐、耗时长的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一特异引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的第二特异引物对。
优选的，所述引物组还包括用于区分所述源性成分来源的马、驴、马骡以及驴骡的性别的第三特异引物对，所述第三特异引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
优选的，所述第二特异引物对是针对所述马和驴的线粒体基因的引物对。
本发明实施例还提供含所述的引物组的多重PCR检测试剂盒。
优选的，所述检测试剂盒还包括空白对照组，所述空白对照组为水。
优选的，所述试剂盒的检测样本为动物血液、毛发、皮肤、内脏中提取的DNA。
优选的，所述检测试剂中，所述PCR反应体系为：Green Taq Mix 10ul，DNA模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddH2O 6.6ul。
优选的，所述检测试剂盒和还包括来源马、驴、马骡或者驴骡的样品的阳性对照品。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例的用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及其检测试剂盒，在检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分过程中，其耗时短，工作量小，节约成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例1提供的第一特异性引物对检测马、驴、马骡和驴骡的PCR扩增产物的DNA片段的电泳图；
图2为本发明实施例2提供的第二特异引物对检测马、驴、马骡和驴骡的PCR扩增产物的DNA片段的电泳图；
图3为本发明实施例3提供的第三特异引物对检测马、驴、马骡和驴骡的PCR扩增产物的DNA片段的电泳图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，在常染色体找到马、驴同源基因之间存在小片段的缺失，在其缺失区域两端设计第一特异性引物对，为了增加差异，在设计引物的时候，进行了碱基替换，来增加引物对的特异性，该第一特异性引物对的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。该马的同源基因CNGB3 cyclic nucleotide gated channelsubunit beta 3，具体的，马[Equus caballus(horse)]Gene ID:100055470，LocationChromosome 9,NC_009152.3(2298952..2413636)；驴[Equus asinus(ass)]Gene ID:106829842 Location NW_014637333.1(39847..171617)。通过第一特异引物对扩增的驴同源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，通过第一特异引物对扩增的扩增的马同源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明实施例中，用于检测样品中的DNA的提取过程为，血液DNA的提取使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExitracton Kit Ver.5.0(TaKaRa,9765)试剂盒并按照说明逐步操作。
一、细胞的裂解：取100ul全血于1.5ml离心管，加100ul无菌无酶水，加入180μl的Buffer GB、20μl的Proteinase K和10μl的RNase A(10mg/ml)，充分吸打混匀，于56℃水浴温浴10分钟。向裂解液中加入200μl 100％乙醇，充分吸打混匀。
二、将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。
三、将500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
四、将700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
五、重复操作步骤四。
六、将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。
七、将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50～200μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5分钟。
八、12,000rpm离心2分钟洗脱DNA，获得用于PCR检测的DNA样品。
其中，PCR的扩增体系为：使用Green Taq Mix(Vazyme,p131)，20ul反应体系，含Green Taq Mix 10ul，DNA模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddH2 O 6.6ul。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸1min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，其中，样品原料取自6匹马(Horse)，6匹驴(Dongkey)，3匹马骡(母马×公驴)(Mule)和3匹驴骡(母驴×公马)(Hinny)，当样品原料来源是马时，PCR扩增产物为474bp DNA片段，当样品来源是驴时，PCR扩增产物为711bp DNA片段，当样品来源是马骡或驴骡时，PCR扩增产物为474bp和711bp两条DNA片段。通过第一特异引物对可以将马、驴和骡源性成分进行区分。
实施例2
本发明实施例中，在鉴定区分马骡、驴骡时，使用马和驴的线粒体基因，在NCBI下载了马和驴的线粒体mitochondrial DNA(mtDNA)全长，其中，马Horse：ACCESSION NC_001640LOCUS NC_001640 16660bp；驴Dokey：ACCESSION NC_001788LOCUS NC_00178816670bp，利用BioEdit软件进行比对，找到线粒体基因中，差异很大的DNA区段，利用该DNA区段，设计核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二特异引物对。为了增加差异，在设计引物的时候，进行了碱基替换，来增加引物对的特异性，扩增PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。样品PCR的模板的提取过程中，血液DNA的提取使用TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Exitracton Kit Ver.5.0(TaKaRa,9765)试剂盒并按照说明逐步操作。
其中，PCR扩增体系为：使用Green Taq Mix(Vazyme,p131)，20ul反应体系，含Green Taq Mix 10ul，DNA模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddH2O 6.6ul。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸1min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，其中，样品原料取自6匹马(Horse)，6匹驴(Dongkey)，3匹马骡(母马×公驴)(Mule)和3匹驴骡(母驴×公马)(Hinny)，当样品原料来源是马或者是马骡时，PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上显示为148bp DNA片段；当样品来源是驴或者驴骡时，没有PCR扩增产物。通过第二特异引物对可以进一步的对来源于马骡和驴骡来源原料进行区分。
实施例3
本发明实施例中，SRY(哺乳动物早期性腺体具有双向分化的潜能，在性别决定过程中，根据体细胞是否表达SRY(sex-determining region of the Y chromosome)基因，最终决定未分化的性腺发育为卵巢或者睾丸基因，选用Y染色体上的特有基因进行设计第三特异引物对，为了增加差异，在设计引物的时候，进行了碱基替换，来增加引物对的特异性，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，扩增PCR产物的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示。
其中，PCR扩增体系为：使用Green Taq Mix(Vazyme,p131)，20ul反应体系，含Green Taq Mix 10ul，DNA模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddH2O 6.6ul。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸1min。将PCR产物琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，其中，样品原料取自6匹马(Horse)，6匹驴(Dongkey)，3匹马骡(母马×公驴)(Mule)和3匹驴骡(母驴×公马)(Hinny)，当样品来源为性别为雄性(♂)时，有PCR产物，凝胶成像有亮带，有大小为145bp DNA片段；当样本性别为雌性(♀)时，无PCR产物，凝胶成像无亮带。通过第三特异引物对可以将源性成分的马、驴、马骡以及驴骡的性别进行区分。
本发明实施例中，还提供一种用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的试剂盒，该试剂盒包括第一特异引物对、第二特异引物对以及第三特异引物对。同时，该检测试剂盒中还可设置有来源马、驴、马骡或者驴骡的样品的阳性对照品，利用该试剂盒检测的过程中，设置空白对照组，该空白对照组为水。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0002326905280000071
Figure BDA0002326905280000081
Figure BDA0002326905280000091
Figure BDA0002326905280000101
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒
<130> GG19699302A
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccggattcct atgtcataac agg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaaccttgta gacgctatgc tg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
catgccaacc ataataactc aac 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaagaacggt tgacagatct aga 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggatgccagt ggaaaatgct tac 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgtcacttat ctgtggcatc ttgg 24
<210> 7
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ccagattcct atttcataac aggtacccca taaacacgtg gtcgcgtctt cttggaactt 60
agcacaccga agggtaatgt agtgtaatat tgtaatgtta caacattagt aacaattagt 120
tactaattga gggaaggaac gggtgatgaa tttttttttt aaagatttta ttttttcctt 180
tttctcccca aagcgccccc agtacatagt tgtatattct tcgttgtggg tccttctagt 240
tgtggcatgt gggatgctgc ctcagcgtgg tttgacgagc agtgccatgt ccgcacccag 300
gattcaaacc aacgaaacac tgggccgcct gcagcggagc gcgcgaaccc aatcactcgg 360
ccacggggcc agccccggat gatgaatttt taaaaaaata attgaggtga aattcatatg 420
acataaattt aaccatttta aagtgaacaa ttcaataggg tttagtacat tcacaatgtt 480
gttcaactgg tacttctctc tagttccaaa acatttccat cactttaaag tcttttattc 540
attaaacagt ttctccctgt tctttcctcc cccgcccagc tcctatcatc catcagtctg 600
tgttcggtct cctcacattt atctattctg gatatttcac cctaatagaa tcatacaaca 660
tgtgactttt ggtgtctggt tcttccactc agcatagtgt cttcaaggtt c 711
<210> 8
<211> 475
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccagattcct atttcataac aggtacccca taaacacgtg gtcgcttctt cttggaactt 60
agcacactgt agggtaatgt agtgtaatat tgtaatgtta caacattagt aacaattagt 120
tactaattga ggaaaggaac ggatgatgaa tttttaaaaa aataattgag gtgaaattca 180
tatgacataa atttaaccat tttaaagtga acaattcaat agggtttagt acattcacaa 240
tgttgttcaa ctggtacttc tctctagttc caaaacattt ccatcacttt aaagtctttt 300
attcattaaa cagtttctcc ctcttctttc ctcccccgcc cagctcctat catccatcag 360
tctgtgttcg gtctcctcac atttatctat tctggatatt tcaccctaat agaatcatac 420
aacatgtgac ttttggtgtc tggttcttcc actcagcata gtgtcttcaa ggttc 475
<210> 9
<211> 148
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
catgccaacc ataataactc aacacaccta acaatcttaa cagaactttc cccccgccat 60
taataccaac atgctacttt aatcaataaa atttccatag acaggcatcc ccctagatct 120
aattttctaa atctgtcaac ccttcttc 148
<210> 10
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggatgccagt ggaaaatgct tacggaagcc gaaaaattgc cattcttcga ggaggcacag 60
agactacggg ctatgcatca agagaaatac ccggactata aatatcgacc tcgtcggaag 120
gccaagatgc cacagaaaag tgaca 145

Claims (7)

1.用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一特异引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二特异引物对。
2.如权利要求1所述的用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组，其特征在于，所述引物组还包括用于区分所述源性成分来源的马、驴、马骡以及驴骡的性别的第三特异引物对，所述第三特异引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
3.含权利要求1或2所述的引物组的多重PCR检测试剂盒。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括空白对照组，所述空白对照组为水。
5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为动物血液、毛发、皮肤、内脏中提取的DNA。
6.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，检测试剂中，PCR反应体系为：GreenTaq Mix 10 μl，DNA模板2.4 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，ddH2O 6.6 μl。
7.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括来源马、驴、马骡或者驴骡的样品的阳性对照品。
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