CN110863034B - 快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速提取牛血液DNA进行β‑酪蛋白基因型检测的方法，该方法包括：向采集的牛血液样本中加入样本10～30倍体积量的细胞裂解液A，混匀后加入与稳定液B，混匀后静置，取上清用水稀释后作为模板，用于PCR或实时荧光定量PCR反应，进行β‑酪蛋白基因型的检测。本发明通过设计β‑酪蛋白基因检测位点上、下游引物和Taqman探针，96孔板批量裂解血液，快速进行奶牛β‑酪蛋白基因型的批量检测。该方法操作简单，无需加热、高速离心等DNA提取操作，成本较常规方法降低50％，获得DNA仅需10min左右，总检测耗时只需60min，大大缩短了检测时间，适合于奶牛场现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法。
背景技术
β-酪蛋白约占牛奶中酪蛋白总量的25％～35％，编码基因为beta-casein(csn2)，主要的变异型为A1和A2。A1型β-酪蛋白的第67位为组氨酸(密码子为CAT)，A2型β-酪蛋白的同一位置是脯氨酸(密码子为CCT)。A1型β-酪蛋白在蛋白酶水解下，前7个氨基酸残基可以被裂解产生β-酪啡肽-7(BCM-7)，A2型β-酪蛋白则不会。研究表明，A2型β-酪蛋白更接近天然母乳，能够最大程度的避免由A1型β-酪蛋白引起的不良反应。A2型β-酪蛋白是β-酪蛋白的野生型，最初家养的牛只含A2型β-酪蛋白，而大规模养殖放大了自然基因突变出现的A1型，目前全世界大多数奶牛普遍含A1型β-酪蛋白突变体。
目前，A2奶对多个国家如澳大利亚、新西兰、英国、美国等奶业产生了重大影响，产A2型β-酪蛋白奶牛具有较高的经济价值，对奶牛养殖和育种业来说，鉴定繁育A2个体，构建A2奶核心群具有较高的成本效益。现有检测奶牛β-酪蛋白基因型的方法依赖于提取DNA后进行检测，提取DNA的方法有常规DNA提取方法及高温水煮法提取DNA：常规DNA提取方法提取过程中需要用到多种仪器，提取流程繁琐，耗时较长，成本较高；高温水煮法提取DNA与常规DNA提取方法相同需要用到多种仪器，且提取质量较差严重影响后续检测效果。上述方法均不适用于奶牛养殖场或育种场的现场检测。
本发明提供一种能够快速、便捷从奶牛血液获得DNA以用于下游Taqman基因分型的方法，无需DNA提取即可一步实现从血液到分型，降低成本，减少时间、人力和试剂消耗，实现大规模现场快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法。
本发明技术原理如下：首先，实现牛(奶牛)血液快速获取DNA，提供一种裂解液快速释放DNA，并加入稳定液。其次，克服血液裂解液体系对Taqman扩增的抑制，本发明选用商品化的耐受性热启动Taq酶。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法，向采集的牛血液样本中加入样本10～30倍体积量的细胞裂解液A，室温振荡混匀；然后，加入与细胞裂解液A等量的稳定液B，室温振荡混匀后静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板，用于PCR或实时荧光定量PCR反应，进行β-酪蛋白基因型的检测。
其中，所述细胞裂解液A选自50～100mM Tris-HCl、50～75mM NaCl、0.5％～5％Triton X-100、50～100mM DTT中的至少一种，稳定液B选自10％～30％甘油、10％～25％DMSO、0.5％～5％Tween-20中的至少一种。
其中，用于PCR反应的引物是针对牛β-酪蛋白基因第205位碱基设计的。
优选地，细胞裂解液A成分为：50mM Tris-HCl、50mM DTT，稳定液B成分为：10％甘油、20％DMSO。
前述的方法，所采集的牛血液样本中含有抗凝剂，所述抗凝剂选自EDTA、肝素、草酸钾等中的至少一种。血液样本中抗凝剂的浓度为1～2mg/mL。
进一步地，所述方法包括：将5μL牛血液样本加入到96孔板中，加入50μL细胞裂解液A，室温振荡裂解10min；然后加入50μL稳定液B，静置，取上清稀释10～20倍作为模板进行实时荧光定量PCR反应。所采集的奶牛血液样本中含有抗凝剂，所述抗凝剂为EDTA(1～2mg/ml)、肝素(10～12IU/ml)或草酸钾(2mg/ml)。
所检测的目标基因位于奶牛6号染色体上，实时荧光定量PCR反应所用引物和探针的核苷酸序列分别如下(SEQ ID NO:1-4)：
引物F：5′-CCAGGATGAACTCCAGGATAAA-3′
引物R：5′-CACAGGGGTTTGAGTAAGAGGA-3′
探针1：5′-CCCATCCATAACAGCCTCCC-3′
探针2：5′-CCCATCCCTAACAGCCTCC-3′
其中，探针1、探针2分别带有不同的荧光基团和淬灭基团。
优选地，PCR反应体系如下：2×RealFAST Probe No-ROX Mix 2.5μL，ROX I0.1μL，模板1，10μM引物F、引物R、探针1、探针2各0.2μL，不含核酸酶的水0.6μL。
RealFAST Probe No-ROX Mix来自北京擎科新业生物技术有限公司的2×T5 FastqPCR Mix(Probe)试剂盒。
优选地，PCR反应程序如下：95℃5min；95℃10sec，60℃20sec，40个循环；4℃保存。
第二方面，本发明提供一种用于快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述细胞裂解液A、稳定液B以及SEQ ID NO:1-4所示的引物和探针。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的从牛血液快速获取DNA用于β-酪蛋白基因型检测的方法适用于奶牛养殖场/育种场的大规模现场快速检测需求，能够对牛犊实现快速区分，有助于分栏饲养和核心群构建。
(二)本方法提取成本低，提取DNA耗时10min左右，总检测耗时仅需60min左右，实现了大规模96孔板快提操作。相比常规DNA提取-PCR-电泳-成像方法，本方法优势明显：1)快速。血液裂解仅需10min左右，Taqman分型仅需50min左右，总耗时较常规提取方法减少50％以上。2)操作简单。室温下即可裂解释放DNA，无需额外加热；裂解体系涡旋混匀，无需离心。3)可批量。为便于现场大规模使用，优化扩容至96孔板操作。4)检测成本低。血液裂解、Taqman反应检测试剂成本远低于常规DNA提取-PCR-电泳-成像方法。5)仪器配套少。仅利用实时荧光定量PCR(qPCR)仪，无需依赖其他复杂仪器设备。
附图说明
图1为本发明实施例1中奶牛96孔板样本β-酪蛋白基因分型检测结果。
图2为本发明实施例2中细胞裂解液A、稳定液B的优化结果。
图3为本发明实施例3中抗凝剂为EDTA的血液样本β-酪蛋白基因分型检测结果。
图4为本发明实施例3中抗凝剂为肝素的血液样本β-酪蛋白基因分型检测结果。
图5为本发明实施例3中抗凝剂为草酸钾的血液样本β-酪蛋白基因分型检测结果。
图中，Allele X：显性纯合子，Allele Y：隐性纯合子，Both：杂合子，NTC：阴性对照，×：未检出。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1快速提取奶牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法
本实施例提供的快速提取奶牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法，包括如下步骤：奶牛血液快速简易裂解，裂解液稀释为扩增模板，Taqman探针法分型鉴定。
将从奶牛采集的5μL血液样本(样本中抗凝剂为EDTA，浓度为1mg/ml)加入到96深孔板中，加入50μL细胞裂解液A，室温振荡裂解10min；随后加入50μL稳定液B，静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板进行Taqman分型检测。
细胞裂解液A成分为：50mM Tris-HCl、50mM DTT。
稳定液B成分为：10％甘油、20％DMSO。
Taqman分型检测体系，所用反应体系及程序如下所示：
反应体系：
| 试剂 | 体系(5μL)/孔 |
| RealFAST Probe No-ROX Mix(2×) | 2.5μL |
| ROX I | 0.1μL |
| 奶牛血液裂解液稀释样本 | 1μL |
| 引物F(10μM) | 0.2μL |
| 引物R(10μM) | 0.2μL |
| 探针1(10μM) | 0.2μL |
| 探针2(10μM) | 0.2μL |
| 不含核酸酶的水 | 0.6μL |
| 总体积 | 5μL |
反应程序：
RealFAST Probe No-ROX Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司的2×T5 FastqPCR Mix(Probe)试剂盒，包含PCR缓冲体系、PCR增强剂、热启动Taq DNA聚合酶等，用于快速PCR扩增反应。Taqman基因分型反应体系所用引物和探针由北京擎科新业生物技术有限公司合成，序列如下：
所检测的β-酪蛋白基因位于奶牛6号染色体上，实时荧光定量PCR反应所用引物和探针的核苷酸序列分别如下：
引物F：5′-CCAGGATGAACTCCAGGATAAA-3′
引物R：5′-CACAGGGGTTTGAGTAAGAGGA-3′
探针1：5′-CCCATCCATAACAGCCTCCC-3′
探针2：5′-CCCATCCCTAACAGCCTCC-3′
探针1、探针2分别带有不同的荧光基团(如VIC、FAM)和淬灭基团(BHQ1)。
96孔板基因分型检测结果见图1。96个样本应用本发明方法检出率为100％，与常规提取法获得DNA相比，检出一致性为100％。Taqman分型聚类程度显示，VIC、FAM、杂合聚类区分明显。
实施例2细胞裂解液A、稳定液B的优化试验
细胞裂解液A成分为：50mL NaCl、0.5％Triton X-100，稳定液B成分为：10％甘油、0.5％Tween-20。对上述裂解液A和稳定液B的组合，测试其在血液(抗凝剂为EDTA浓度为1mg/ml)样本中的应用。
将从奶牛采集5uL血液样本(样本中抗凝剂EDTA浓度为1～2mg/ml)加入到96深孔板中，加入50uL细胞裂解液A，室温振荡裂解10min；随后加入50uL稳定液B，静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板进行β-酪蛋白基因分型检测。
Taqman分型检测体系，所用反应体系及程序同实施例1。
β-酪蛋白基因分型检测结果见图2，该裂解液和稳定液组合处理后，聚类差，未获得有效分型。
实施例3对不同种类抗凝剂血液样本的适用性
分别测试实施例1中的细胞裂解液A和稳定液B组合对不同种类抗凝剂血液样本的适用性，裂解血液后进行β-酪蛋白基因分型检测。
细胞裂解液A成分为：50mM Tris-HCl、50mM DTT；细胞裂解液B成分为：10％甘油、20％DMSO。
将从奶牛采集的5uL血液样本，抗凝剂分别为EDTA(1mg/ml)、肝素(10IU/ml)、草酸钾(2mg/ml)，加入到96深孔板中，加入50uL细胞裂解液A，稍稍震混瞬离，室温振荡裂解10min；随后加入50uL稳定液B，震混瞬离。静置，取上清用水稀释10倍作为模板进行Taqman分型检测。
Taqman分型检测体系，所用反应体系同实施例1。
可见，本发明方法对分别含上述三种抗凝剂的血液样本适用，其裂解液的β-酪蛋白基因分型检测结果有效(图3～图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京康普森生物技术有限公司
<120> 快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法
<130> KHP191116854.6
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaggatgaa ctccaggata aa 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacaggggtt tgagtaagag ga 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccatccata acagcctccc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccatcccta acagcctcc 19
Claims (8)
1.快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法，其特征在于，向采集的牛血液样本中加入样本10～30倍体积量的细胞裂解液A，室温振荡混匀；然后，加入与细胞裂解液A等量的稳定液B，室温振荡混匀后静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板，用于PCR或实时荧光定量PCR反应，进行β-酪蛋白基因型的检测；
其中，所述细胞裂解液A选自50～100mM Tris-HCl、50～75mM NaCl、0.5％～5％TritonX-100、50～100mM DTT中的至少一种，稳定液B选自10％～30％甘油、10％～25％DMSO、0.5％～5％Tween-20中的至少一种；
用于PCR反应的引物是针对牛β-酪蛋白基因第205位碱基设计的；引物序列如下：
引物F：5′-CCAGGATGAACTCCAGGATAAA-3′
引物R：5′-CACAGGGGTTTGAGTAAGAGGA-3′。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所采集的牛血液样本中含有抗凝剂，所述抗凝剂选自EDTA、肝素、草酸钾中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将5μL牛血液样本加入到96孔板中，加入50μL细胞裂解液A，室温振荡裂解10min；然后加入50μL稳定液B，静置，取上清稀释10～20倍作为模板进行实时荧光定量PCR反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应所用探针的核苷酸序列如下：
探针1：5′-CCCATCCATAACAGCCTCCC-3′
探针2：5′-CCCATCCCTAACAGCCTCC-3′
其中，探针1、探针2分别带有不同的荧光基团和淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应体系如下：2×RealFAST ProbeNo-ROX Mix 2.5μL，ROXⅠ0.1μL，模板1，10μM引物F、引物R、探针1、探针2各0.2μL，不含核酸酶的水0.6μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应程序如下：95℃5min；95℃10sec，60℃20sec，40个循环；4℃保存。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，血液样本中抗凝剂的浓度为1～2mg/mL。
8.用于快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1中所述的细胞裂解液A、稳定液B以及如下引物和探针：
引物F：5′-CCAGGATGAACTCCAGGATAAA-3′
引物R：5′-CACAGGGGTTTGAGTAAGAGGA-3′。
探针1：5′-CCCATCCATAACAGCCTCCC-3′
探针2：5′-CCCATCCCTAACAGCCTCC-3′
其中，探针1、探针2分别带有不同的荧光基团和淬灭基团。
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