CN113549700B

CN113549700B - 一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记及其在猪育种中的应用

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Publication number: CN113549700B
Application number: CN202110807236.6A
Authority: CN
Inventors: 唐辉; 郭子骄; 王文文; 滕军; 宁超; 王丹; 张勤; 陈伟; 曾勇庆; 樊新忠
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2041-07-16
Also published as: CN113549700A

Abstract

本发明公开了一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记及其在猪育种中的应用。该突变位点为‑1103(A>G)位点，利用MassARRAY技术对其在2个不同群体中进行基因分型并与肌内脂肪含量关联分析，结果发现该位点与猪肌内脂肪含量存在显著(P<0.05)相关，GG基因型的肌内脂肪含量显著高于AA基因型和AG基因型。检测这个与肌内脂肪含量相关联的分子标记，有助于选育肌内脂肪含量高的肉用品种/系，为猪育种工作提供有利的帮助。

Description

一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记及其在猪育种中的应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记及其在猪育种中的应用。

背景技术

肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量是影响猪肉品质特征的一个重要因素，适量肌内脂肪的沉积及氨基酸组成不仅提高肌肉的感官评分，还可以增加肉的风味、嫩度、多汁性以及消费者对肉的口感，并且IMF中脂肪酸的组成与肉的营养价值密切相关(杨二林等,2016；Suárez-Belloch et al.,2015)。

脂肪酸(fatty acid，FA)是各种动物体内一种非常重要的脂类，脂肪酸活化以后，可用于合成TG、神经酰胺，或者直接进行脂肪酸的β-氧化为机体产生能量(Piccini etal.,1998)。脂酰辅酶A 合成酶家族(ACS)拥有26个成员，是一类具有组织特异性和底物特异性的酶，主要作用于脂肪酸活化(肖航，2017)。机体大部分的脂肪酸属于机体摄入的食物中的脂肪酸，碳链长度均为C12-C20，活化这些长度均为C12-C20的脂肪酸的ACS成员，便命名为长链脂酰辅酶A合成酶(ACSL)(Li et al.,2009；Mashek,2004)。长链脂酰CoA合成酶3(Long-chain acyl-CoA synthetase 3，ACSL3)是ACSLs家族中的一员，其存于内质网(ER)和胞质脂滴(LDs)中，能影响卵磷脂的合成和细胞质中脂滴的形成，以及激活脂肪酸(FA)的氧化代谢，是哺乳动物脂质代谢过程中的关键酶(Laiet al.,2020)。ACSL3在LDs上特有的定位表明其在脂质的局部合成中发挥重要功能，研究发现，ACSL3过表达时可增加细胞对脂肪酸的摄取，而干扰ACSL3则FA摄取降低，并且ACSL3的结构组织能够从ER到LDs高效快速的移动。综上表明，ACSL3不仅仅可以作为脂酰CoA活化脂肪酸，也参与了脂肪酸的细胞吸收(Yan,2015；Islam et al.,2009)。猪ACSL3基因定位在第15号染色体上，其中它与ACSL4有68％同源序列，而与ACSL1仅有30％的同源性(Kang et al.,1997)。

分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可以不受环境影响，通过遗传背景选择，减少连锁累赘，从而加速育种过程及精准度。基因表达是指基因经过调控将其遗传信息表达的过程，表现为将基因转录激活翻译为蛋白质。基因表达是多层次级别共同调控的作用结果，包含了从基因转录激活到翻译为蛋白质的过程，其中最为重要的是转录水平的调控(Ishihama,2010)。其中，转录受5′调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的过程，从而影响基因的表达。因此，研究猪ACSL3基因5′调控区的SNPs，有助于找到有意义的分子标记，为猪的标记辅助选择育种提供有利的理论依据。

目前有关猪ACSL基因SNP的研究主要集中在ACSL1基因和ACSL4基因，但还未见有与猪肌内脂肪性状相关猪ACSL3基因SNP的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记及其在猪育种中的应用。本发明在猪ACSL3基因5′调控区发现一个与猪肌内脂肪性状密切相关的分子标记，检测这个与猪肌内脂肪性状相关联的分子标记，有助于选育肌内脂肪含量高的肉用品种/系，为猪育种工作提供有利的帮助。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其序列中第465位碱基R为A或G，导致猪肌内脂肪含量出现多态性。

所述分子标记位于猪的15号染色体上ACSL3基因的5′调控区，突变位点为-1103A>G的突变。(突变位点的位置是根据Gene ID:100233169，相对于转录起始位点而言)利用MassARRAY技术对其在2个不同群体中进行基因分型并与猪肌内脂肪含量关联分析，结果发现该位点与猪肌内脂肪含量存在显著(P<0.05)相关，GG基因型的肌内脂肪含量显著高于AA基因型和AG基因型。

本发明的第二方面，提供上述分子标记在如下1)-4)至少一项中的应用：

1)检测猪肌内脂肪含量；

2)筛选肌内脂肪含量高的猪品种和/或品系；

3)猪肌内脂肪性状遗传改良；

4)高或低猪肌内脂肪含量品种或品系选育。

本发明的第三方面，提供一组用于扩增上述分子标记的引物，所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。具体如下：

P-ACSL3-F：5′-AATAAAACATGTTAGAGACTGGAAA-3′；(SEQ ID NO.1)

P-ACSL3-R：5′-GAAGTGATGAAGGCGCTAGA-3′。(SEQ ID NO.2)

本发明的第四方面，提供一种用于检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含上述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。

本发明的第五方面，提供上述引物或试剂盒在如下1)-4)至少一项中的应用：

1)检测猪肌内脂肪含量；

2)筛选肌内脂肪含量高的猪品种和/或品系；

3)猪肌内脂肪性状遗传改良；

4)高或低猪肌内脂肪含量品种或品系选育。

本发明的第六方面，提供一种检测猪肌内脂肪含量的方法，包括以下步骤：

提取待测猪个体的DNA并将其作为模板，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，根据测序结果对猪肌内脂肪含量的高低进行判断：扩增产物第465位碱基为G的猪个体的肌内脂肪含量高于扩增产物第465位碱基为A的猪个体。

本发明的第七方面，提供一种筛选高肌内脂肪含量猪的方法，包括以下步骤：

对待测猪个体15号染色体上ACSL3基因5′调控区的突变位点-1103A>G进行基因分型检测；GG基因型的肌内脂肪含量高于AA基因型和AG基因型。

优选的，利用MassARRAY技术对突变位点-1103A>G进行基因分型检测；MassARRAY检测所采用的引物序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所示。

本发明的第八方面，提供一种选育肌内脂肪含量高的肉用品种/系的方法，包括以下步骤：

对待测猪个体15号染色体上ACSL3基因5′调控区的突变位点-1103A>G进行基因分型检测；筛选出纯合GG基因型公猪和纯合GG基因型的母猪，然后通过相互交配得到GG纯合基因型种猪，制作用于肌内脂肪含量高的品种/系培育的配套系。

本发明的有益效果：

本发明首次在猪ACSL3基因5′调控区发现一个与猪肌内脂肪含量性状相关的突变位点，该突变位点为-1103(A>G)位点。利用MassARRAY技术对其在2个不同群体中进行基因分型并与肌内脂肪含量关联分析，结果发现该位点与猪肌内脂肪含量存在显著(P<0.05)相关，GG基因型的肌内脂肪含量显著高于AA基因型和AG基因型。通过检测这个与肌内脂肪含量相关联的分子标记，有助于选育肌内脂肪含量高的肉用品种/系，为猪育种工作提供有利的帮助。

附图说明

图1为猪ACSL3基因5′调控区-1103(A>G)(5'-3')位点的多态性测序图；

图2为本发明实施例3构建突变型载体后与野生型载体进行序列比对结果；

图3为本发明实施例3突变型和野生型两种基因型双荧光素酶报告基因启动活性检测结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，肌内脂肪含量是影响猪肉品质特征的一个重要因素，通过分子标记辅助选择育种技术选育肌内脂肪含量高的肉用品种/系，能够为猪育种工作提供有利的帮助。

基于此，本发明对猪ACSL3基因5′调控区进行了深入研究，发现了一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记，该分子标记为位于猪ACSL3基因5′调控区中与猪肌内脂肪含量相关联的突变位点，该突变位点为-1103A>G的突变；

上述与猪肌内脂肪含量相关的分子标记的标记方法，该方法所采用的两条引物分别为P-ACSL3-F，P-ACSL3-R；具体引物序列如下：

P-ACSL3-F：

AATAAAACATGTTAGAGACTGGAAA(SEQ ID NO.1)

P-ACSL3-R：

GAAGTGATGAAGGCGCTAGA(SEQ ID NO.2)

上述引物是根据已发表猪ACSL3基因序列(Gene ID:100233169)设计获得的，主要目的是筛选猪ACSL3基因5′调控区的突变位点及确定其在群体中的分布；

在获得上述引物之后，发明人利用其扩增猪育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物，经测序得到的序列如图1所示，结果检测到存在1个突变位点，即-1103(A>G)位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

进一步利用MassARRAY技术对大群内个体进行基因型鉴定，选择出纯合GG基因型公猪和纯合GG基因型的母猪，然后通过相互交配得到GG纯合基因型后代。

通过这种标记方法得到的GG基因型种猪能显著提高肌内脂肪含量，在猪肌内脂肪含量低的品种中有意增加GG基因型的频率对提高肌内脂肪含量是一个有效措施。

综上所述，本发明提供的突变位点作为分子标记与猪肌内脂肪含量关联显著(P<0.05)，GG基因型的肌内脂肪含量显著高于AA基因型和AG基因型。可见检测这个与肌内脂肪含量相关联的分子标记，有助于选育肌内脂肪含量高的肉用品种/系，为猪育种工作提供有利的帮助。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：猪ACSL3基因5′调控区序列比对及多态性位点分析

1.试验材料

莱芜黑猪138头，杜长大猪50头，共计188头，莱芜黑猪和杜长大猪分别来自于山东济南莱芜猪种猪繁育公司和山东优倍牧业有限公司。按照国家标准宰杀取背长肌以及所需组织，放入冻存管，迅速转移入液氮罐中保存，并提取DNA。

2.试验方法

2.1引物设计

根据已发表猪ACSL3基因序列(Gene ID:100233169)设计引物，其序列详见表1，此引物是为研究猪ACSL3基因5′调控区的突变而根据数据库中登录的猪ACSL3基因序列设计的。

表1：引物序列、退火温度

2.2PCR扩增

随机选取莱芜黑猪和杜长大猪的基因组各24个，用引物进行PCR扩增，引物见表1。PCR反应体系为：2×Phanta Max buffer 12.5μL，dNTP Mix(10mM each)0.5μL，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，DNA模板1μL，引物P-ACSL3-F、P-ACSL3-R各1μL，ddH₂O 8.5μL，共25μL。PCR反应程序为：上盖110℃；95℃3min；95℃15sec，58℃15sec，72℃60sec(延伸程序为60s/kb)35个循环；72℃5min。

将48头个体的PCR扩增产物送去上海生工技术服务有限公司进行测序。

3.结果与分析

使用DNAMAN对序列同源性进行比对并完成突变核苷酸的检索，用Chromas软件对测序结果分析，发现扩增的两个品种的猪ACSL3基因5′调控区-1103点均存在A>G的SNP突变(见图1序列比对图和峰图)。

实施例2：猪ACSL3基因5′调控区多态性与肌内脂肪含量的关联分析

1试验材料

本案例所用试验动物为日龄130天的莱芜黑猪138头，杜长大猪50头，共计188头。莱芜黑猪和杜长大猪分别来自于山东济南莱芜猪种猪繁育公司和山东优倍牧业有限公司。按照国家标准宰杀取背长肌以及所需组织，放入冻存管，迅速转移入液氮罐中保存。用相同方法测量肌内脂肪含量，测定方法参考(张伟力,曾勇庆.猪肉肌内脂肪测定方法及其误差分析[J].猪业科学,2008(07):102-103.)，并提取DNA用于后续试验和SNPs的筛选。

2试验方法

2.1MassARRAYSNP位点基因分型

MassARRAYSNP检测技术结合多重PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)对SNP位点(-1103(A>G)位点)进行基因分型检测。

2.2实验操作

(1)对SNP位点进行基因分型检测有三条引物，包括PCR扩增所用的上游引物、下游引物与一条单碱基延伸引物(UEP引物)(引物信息如表2所示)。

(2)PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行。将配制好的PCR master mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用移液器调节加样体积为3μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCR Master Mix液。取出已经制备好的DNA样品96孔板，使用移液器调节加样体积为2μL，按照384排版表的位置将样本加至相对应的384孔板，贴上封口膜，离心。

(3)在384孔PCR仪上进行PCR反应。

(4)PCR产物碱性磷酸酶处理。

(5)在碱性磷酸酶处理结束后，将384反应板取出后空甩，在进行单碱基延伸反应。

(6)树脂纯化。

(7)芯片点样。

(8)质谱检测，出具基因型报告。

2.3关联分析

利用R软件统计基因型和基因型频率。

数据统计采用SAS9.2统计软件包的GLM程序进行基因型与性状(肌内脂肪含量)的关联分析。不同基因型间的比较分析用最小二乘法，试验数据用最小二乘均值±标准误表示(LSM±SE)，显著水平设定P<0.05。

表2：MassARRAY检测用引物序列

3结果与分析

3.1ACSL3基因5′调控区1个突变位点在不同品种中基因型和等位基因频率的分布分别统计了莱芜黑猪和杜长大猪品种的基因型和等位基因频率。分析结果见表3。

由表3可知，该位点的优势等位基因在莱芜黑猪和杜长大猪中都为A，但不同品种中基因型频率及等位基因频率存在差异，莱芜黑猪中AA和AG为优势基因型，杜长大猪中AA基因型为优势基因型。

表3：-1103多态位点的基因型和等位基因频率在不同品种中的分布

3.2ACSL3基因5′调控区-1103(A>G)位点多态性分析及其与肌内脂肪含量的关联分析

关联分析结果表明，GG基因型猪的肌内脂肪含量分别比AA和AG基因型的猪高了2.1和2.3个百分点；G为有利等位基因，加性效应显著(P<0.05)(见表4)。

表4：-1103位点多态性分析及其与肌内脂肪含量的关联分析

注：表中数据为“最小二乘均数±标准误”，同一位点同一列标有不同字母的均数间差异显著(P<0.05)。

^*.P<0.05。AE为加性效应的缩写，DE为显性效应的缩写。

实施例3：猪ACSL3基因5′调控区多态位点对基因表达的影响

1试验材料

PK15细胞系、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司)

2试验方法

2.1ACSL3基因5′调控区多态位点野生型、突变型荧光素酶表达载体的构建

1)设计引物构建野生型载体，由上游-1595bp扩增至下游+9bp处，片段长度为1604bp，所采用的引物序列见表5。

表5：野生型引物序列、退火温度

注：下划线所表示酶切酶的位点与该酶的保护碱基

2)PCR扩增

PCR反应体系为：2×Phanta Max buffer 12.5μL，dNTP Mix(10mM each)0.5μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，DNA模板1μL，引物Primer野生型_F、Primer野生型_R各1μL，ddH₂O 8.5μL，共25μL。PCR反应程序为：上盖110℃；95℃3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃60sec(延伸程序为60s/kb)35个循环；72℃5min。

PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶检测，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物纯化回收。将回收产物与pGL3-Basic载体进行双酶切以及连接转化实验，阳性菌液送去上海生工技术服务有限公司进行测序。测序成功代表野生型载体构建成功。

3)无内毒素质粒大提

用TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒对测序结果正确的阳性菌液进行无内毒素质粒大提，用于转染试验。

4)定点突变

利用诺唯赞生物科技有限公司Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒以野生型质粒为DNA模板，设计定点突变引物，构建突变型载体，所采用的引物序列见表6。

表6：突变型引物序列、退火温度

2.2PK15细胞系培养

1)细胞复苏

a.将恒温水浴锅的温度调节至37℃。

b.把冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中，轻轻颠倒冻存管，使溶液完全溶解。

c.将融化的冻存液转移至超净工作台中，将溶液吸入新的离心管中，并加入1mL完全培养液到离心管中，轻轻吹打混匀。

d.将细胞悬液经1000rmp离心3min，弃掉上清液；

e.离心后的管中加入1mL 10％FBS完全培养基，并轻轻吹打细胞沉淀使其与培养基混匀，把混匀的细胞悬液加入培养瓶中，10％FBS完全培养液补至5mL，置于5％CO₂、37℃恒温培养箱内培养。

2)细胞传代培养

a.当细胞密度为70％时，把原先的培养液吸出，用2mL PBS清洗2～3次。

b.加入1mL的0.25％的胰酶消化液，37℃，消化2min。

c.在显微镜下观察，当发现细胞皱缩为圆形时，马上加入1mL完全培养基使其停止消化。

d.使用移液枪把处于培养瓶底面的细胞轻轻吹下，让细胞都悬浮于培养液内，把培养液吸出至一个新的离心管中，1000rmp离心3min，并将上清弃掉。

e.在离心管中加入适量细胞完全培养基，把细胞沉淀用移液枪重悬混匀，混匀液分别加入两个新的培养瓶中，培养瓶中完全培养基共5mL，培养于37℃、5％CO₂恒温培养箱内。

g.当细胞密度为70％时，进行传代或冻存。

3)细胞冻存

a.按照FBS:DMSO＝9:1配制细胞冻存液。

b.在细胞汇合度达到70％时，弃去培养液，用2mL PBS清洗2～3次。

c.加入1mL的0.25％的胰酶消化液，37℃，消化2min。

d.在显微镜下观察，当发现细胞皱缩为圆形时，马上加入1mL完全培养基使其停止消化。

e.使用移液枪把处于培养瓶底面的细胞轻轻吹下，让细胞都悬浮于培养液内，把培养液吸出至一个新的离心管中，1000rmp离心3min，并将上清弃掉。

f.把只有细胞沉淀的离心管中加入1mL细胞冻存液，把细胞沉淀用移液枪重悬混匀，将混匀的细胞悬液转移到冻存管内，并在管壁上记录日期及细胞名称。

e.将冻存管放入逐级降温细胞冻存盒内，或在冻存管外包裹棉花达到逐级降温的效果，放置于-80℃冰箱内。

h.24h后，将冻存管转移到液氮罐内保存。

2.3质粒DNA瞬时转染

将长势良好的PK15细胞系传代至24孔培养板，每孔加入500μL不含无抗生素的培养液，在37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养，当细胞密度为70％时进行质粒DNA瞬时转染。依照Lipofectamine^TM 2000转染试说明对PK15细胞系进行转染操作，每组设置三个重复，具体转染步骤如下：

1)转染前将24孔培养板中的培养基吸去，用PBS对其清洗2～3遍，清洗后每孔加入400μL Opti-MEM培养基。

2)A液配制：50μL Opti-MEM+2μL Lipofectamine^TM 2000。

3)B液配制：50μL Opti-MEM+20ng(pRL-TK)+800ng(目的质粒)。

4)A液和B液各室温放置5min，然后将A液与B液混合均匀后室温放置20min。

5)将100μL混合溶液轻轻逐滴加入24孔培养板中，以pGL3-Basic质粒作为阴性对照。

6)将细胞放入37℃、5％CO₂恒温培养箱内培养4～6小时，之后将24孔培养板中的液体更换为无双抗10％FBS完全培养基继续培养。

7)收集转染48h后的细胞，对其进行双荧光素酶活性报告分析。

2.4双荧光素酶活性测定

使用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒对双荧光素酶活性进行检测。具体测定步骤如下：

1)配制裂解液：将5×Passive Lysis Buffer(PLB)裂解液用双蒸水稀释为1×PLB裂解液，混合均匀，现配现用。

2)配制萤火虫荧光素酶(M1)：将冻干粉Luciferase Assay Substrate中加入Luciferase Assay BufferⅡ溶液，充分混合均匀，将混匀液体分装于干净的1.5mL离心管中，-20℃冰箱避光保存。

3)配置海肾荧光素酶(M2)：将50×Stop&

Substrate用Stop&

Buffer稀释为1×Stop&

Substrate，混合均匀，避光保存，现配现用。

4)吸去24孔板中培养基，用PBS清洗1遍细胞。

5)每孔中加入100μL裂解液，37℃，200rmp摇床摇15min，吸取全部溶液于1.5mL离心管中，5000rmp离心2min。

6)在新的1.5mL离心管加入离心后的上清10μL，并在其中加入50μL萤火虫荧光素酶检测试剂，轻轻吹打混匀后读取荧光强度值。

7)接着加入50μL海肾荧光素酶检测试剂，混匀后读取荧光强度值。

8)计算M1/M2比值，得到启动子系列缺失片段的相对启动子活性。

3结果与分析

3.1多态位点突变测序

将野生型载体(AA)和突变型载体(GG)进行测序比对，保证不同等位基因间除突变位点外其他序列的一致性，结果如图2。

3.2野生型和突变型启动子活性

双荧光素酶报告基因检测结果如图3和表7所示突变型(GG)启动效率显著高于野生型(AA)(P<0.05)。

表7：ACSL3基因5′调控区不同基因型对ACSL3基因启动活性的影响

注：表中数据为“平均数±标准误”，同一位点同一列标有不同字母的均数间差异显著(P<0.05)。

综合以上3个实例结果：表明ACSL3基因5′调控区-1103位点存在碱基突变；该位点不同基因型与肌内脂肪含量显著相关，GG基因型肌内脂肪含量分别比AG基因型、AA基因型增加了2.3个百分点和2.1个百分点(P<0.05)。双荧光素酶检测结果表明GG型的启动效率显著高于AA型(P<0.05)，表明GG基因型可增加ACSL3基因的表达量从而增加了肌内脂肪的生成。

由此，通过这种标记方法在种群中有意增加GG型种猪，对提高猪肌内脂肪含量是一个有效措施，而对于肌内脂肪含量低的群体，这样的措施会使其增加肌内脂肪含量，该分子标记方法可以实现早期选种。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记及其在猪育种中的应用

<130> 2021

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aataaaacat gttagagact ggaaa 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaagtgatga aggcgctaga 20

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgttggatg tgaaaggtga cgttcacgag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttggatg gcggcatcac tgattttgag 30

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggctgatttt gagattttct tgaga 25

<210> 6

<211> 1604

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctctccctc tctctcacac ccacacaaac acacaaacat ggaaagggat aatgaagaaa 60

gatgttaagg tgttgctgga attctactag tctgcttcac acttattgac ggaaaaaaaa 120

gttcctcctt tggaaactac atattttgct agaggctttt cttggttctg gaacaaccac 180

ttttaaggta tacttccttt tgcatgcaga atggtggcaa tcttttcaga taagaaattc 240

tgcattccat ttatcttcag ggtgtatctt ttgatagcat ttcctcagat taggagcaat 300

ggaacctcct ttcttagtag aagatcaggt tgcctgagta tccttttttt agcaaggtaa 360

attggcctgg ggcccgaggt gagtgagcct tctttgctct cagcctcatc actccaccta 420

gctcaagttg aggcggcatc actgattttg agattttctt gagargcaag ctcctgcttt 480

agcctgcggt tggctcgtga acgtcacctt tcacctactt aaacacaagt tttgcatcgc 540

ggggaggttt actattcaaa cagccatttc tagcgccttc atcacttcaa aaccaaacca 600

aaccctctaa atgttttatt tcctgtggta tcatatctga cttaacgtta taacttcgtt 660

cactaattcg ttggatttaa aaaaaaaccc ccttcatccc actcctattt gtttaatgaa 720

agtcaacttt cttattgtgc actgtagcta ttgtttaagt catttgtgtt ttggtttgtt 780

tgctaatggg aaggcagtct acctgtgttc cgtgtctttt gtttttcctt ccgtattgtc 840

taacgtggga tataatggca acctccttaa aatgcaggaa cacttctagc ttcataagaa 900

aaacatccaa agacgataat ttggggtaaa ctttgtcctt tgaaaaatat caatctttta 960

taaatagtgc actgagggga gaagggttat ttgcagggtt cagagaagtc aaaacaggag 1020

aaataataaa catggtacat ggctagaatt tttgagcccc tctcgcttca gccatttcca 1080

aaaatcattt tattttaata atttgacaaa tttgttcaag aacaaaacaa gtaaacacgt 1140

taagaatgaa aataatatgc gcatttccct ctgatctata ttaagattta tgcattagag 1200

taataactgt gtttgtaaat cttttggggg cgggggggtc ggagtctttt tctccaggaa 1260

cggcctccgc tgtagacccg gtcggaccct cccctcctcc gccagcttcc cggccgcgca 1320

gcccggctcc cctccccctg cagctgtggt cccattcctc cccgccgacg gctccccgcc 1380

ccgcgccggc tgcggctggg tcccgtccgc cgctgctccg tggaatgacc tgtagtaacc 1440

ccgccccgcc cccggccgcc cgcgccgcgc tcccggccgg aattcgatag gcccagcccc 1500

gcacgcgcca ccgccgccgg gccaatgggc ggcggtctct ctgcatatgc aacgagcgcc 1560

ggccggggga gtgcgtcccg ggcggttcgg ctcaacagac gctg 1604

<210> 7

<211> 1604

<212> DNA

<213> 野生型扩增序列

<400> 7

tctctccctc tctctcacac ccacacaaac acacaaacat ggaaagggat aatgaagaaa 60

gatgttaagg tgttgctgga attctactag tctgcttcac acttattgac ggaaaaaaaa 120

gttcctcctt tggaaactac atattttgct agaggctttt cttggttctg gaacaaccac 180

ttttaaggta tacttccttt tgcatgcaga atggtggcaa tcttttcaga taagaaattc 240

tgcattccat ttatcttcag ggtgtatctt ttgatagcat ttcctcagat taggagcaat 300

ggaacctcct ttcttagtag aagatcaggt tgcctgagta tccttttttt agcaaggtaa 360

attggcctgg ggcccgaggt gagtgagcct tctttgctct cagcctcatc actccaccta 420

gctcaagttg aggcggcatc actgattttg agattttctt gagaagcaag ctcctgcttt 480

agcctgcggt tggctcgtga acgtcacctt tcacctactt aaacacaagt tttgcatcgc 540

ggggaggttt actattcaaa cagccatttc tagcgccttc atcacttcaa aaccaaacca 600

aaccctctaa atgttttatt tcctgtggta tcatatctga cttaacgtta taacttcgtt 660

cactaattcg ttggatttaa aaaaaaaccc ccttcatccc actcctattt gtttaatgaa 720

agtcaacttt cttattgtgc actgtagcta ttgtttaagt catttgtgtt ttggtttgtt 780

tgctaatggg aaggcagtct acctgtgttc cgtgtctttt gtttttcctt ccgtattgtc 840

taacgtggga tataatggca acctccttaa aatgcaggaa cacttctagc ttcataagaa 900

aaacatccaa agacgataat ttggggtaaa ctttgtcctt tgaaaaatat caatctttta 960

taaatagtgc actgagggga gaagggttat ttgcagggtt cagagaagtc aaaacaggag 1020

aaataataaa catggtacat ggctagaatt tttgagcccc tctcgcttca gccatttcca 1080

aaaatcattt tattttaata atttgacaaa tttgttcaag aacaaaacaa gtaaacacgt 1140

taagaatgaa aataatatgc gcatttccct ctgatctata ttaagattta tgcattagag 1200

taataactgt gtttgtaaat cttttggggg cgggggggtc ggagtctttt tctccaggaa 1260

cggcctccgc tgtagacccg gtcggaccct cccctcctcc gccagcttcc cggccgcgca 1320

gcccggctcc cctccccctg cagctgtggt cccattcctc cccgccgacg gctccccgcc 1380

ccgcgccggc tgcggctggg tcccgtccgc cgctgctccg tggaatgacc tgtagtaacc 1440

ccgccccgcc cccggccgcc cgcgccgcgc tcccggccgg aattcgatag gcccagcccc 1500

gcacgcgcca ccgccgccgg gccaatgggc ggcggtctct ctgcatatgc aacgagcgcc 1560

ggccggggga gtgcgtcccg ggcggttcgg ctcaacagac gctg 1604

<210> 8

<211> 1604

<212> DNA

<213> 突变型扩增序列

<400> 8

tctctccctc tctctcacac ccacacaaac acacaaacat ggaaagggat aatgaagaaa 60

gatgttaagg tgttgctgga attctactag tctgcttcac acttattgac ggaaaaaaaa 120

gttcctcctt tggaaactac atattttgct agaggctttt cttggttctg gaacaaccac 180

ttttaaggta tacttccttt tgcatgcaga atggtggcaa tcttttcaga taagaaattc 240

tgcattccat ttatcttcag ggtgtatctt ttgatagcat ttcctcagat taggagcaat 300

ggaacctcct ttcttagtag aagatcaggt tgcctgagta tccttttttt agcaaggtaa 360

attggcctgg ggcccgaggt gagtgagcct tctttgctct cagcctcatc actccaccta 420

gctcaagttg aggcggcatc actgattttg agattttctt gagaggcaag ctcctgcttt 480

agcctgcggt tggctcgtga acgtcacctt tcacctactt aaacacaagt tttgcatcgc 540

ggggaggttt actattcaaa cagccatttc tagcgccttc atcacttcaa aaccaaacca 600

aaccctctaa atgttttatt tcctgtggta tcatatctga cttaacgtta taacttcgtt 660

cactaattcg ttggatttaa aaaaaaaccc ccttcatccc actcctattt gtttaatgaa 720

agtcaacttt cttattgtgc actgtagcta ttgtttaagt catttgtgtt ttggtttgtt 780

tgctaatggg aaggcagtct acctgtgttc cgtgtctttt gtttttcctt ccgtattgtc 840

taacgtggga tataatggca acctccttaa aatgcaggaa cacttctagc ttcataagaa 900

aaacatccaa agacgataat ttggggtaaa ctttgtcctt tgaaaaatat caatctttta 960

taaatagtgc actgagggga gaagggttat ttgcagggtt cagagaagtc aaaacaggag 1020

aaataataaa catggtacat ggctagaatt tttgagcccc tctcgcttca gccatttcca 1080

aaaatcattt tattttaata atttgacaaa tttgttcaag aacaaaacaa gtaaacacgt 1140

taagaatgaa aataatatgc gcatttccct ctgatctata ttaagattta tgcattagag 1200

taataactgt gtttgtaaat cttttggggg cgggggggtc ggagtctttt tctccaggaa 1260

cggcctccgc tgtagacccg gtcggaccct cccctcctcc gccagcttcc cggccgcgca 1320

gcccggctcc cctccccctg cagctgtggt cccattcctc cccgccgacg gctccccgcc 1380

ccgcgccggc tgcggctggg tcccgtccgc cgctgctccg tggaatgacc tgtagtaacc 1440

ccgccccgcc cccggccgcc cgcgccgcgc tcccggccgg aattcgatag gcccagcccc 1500

gcacgcgcca ccgccgccgg gccaatgggc ggcggtctct ctgcatatgc aacgagcgcc 1560

ggccggggga gtgcgtcccg ggcggttcgg ctcaacagac gctg 1604

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggggtacctc tctccctctc tctcacaccc 30

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgctcgagc agcgtctgtt gagccgaa 28

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcttgagaag caagctcctg ctttagcctg cg 32

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gagcttgctt ctcaagaaaa tctcaaaatc agtgat 36

Claims

1.用于扩增与猪肌内脂肪性状相关的分子标记的引物在如下1）-3）至少一项中的应用：

1）检测猪肌内脂肪含量；

2）筛选肌内脂肪含量高的猪品种；

3）猪肌内脂肪性状遗传改良；

所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其序列中第465位碱基为A或G，导致猪肌内脂肪含量出现多态性；

分子标记的位点位于猪的15号染色体上ACSL3基因的5′调控区，突变位点为-1103A>G的突变，ACSL3基因的Gene ID: 100233169；

GG基因型的猪的肌内脂肪含量高于AA基因型和AG基因型。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

3.一种筛选高肌内脂肪含量猪的方法，其特征在于，包括以下步骤：

对待测猪个体15号染色体上ACSL3基因5′调控区的突变位点-1103A>G进行基因分型检测，ACSL3基因的Gene ID: 100233169；GG基因型的肌内脂肪含量高于AA基因型和AG基因型。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用MassARRAY技术对突变位点-1103A>G进行基因分型检测；MassARRAY检测所采用的引物序列如SEQ ID NO.3- SEQ ID NO.5所示。

5.一种选育肌内脂肪含量高的肉用品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

对待测猪个体15号染色体上ACSL3基因5′调控区的突变位点-1103A>G进行基因分型检测，ACSL3基因的Gene ID: 100233169；筛选出纯合GG基因型公猪和纯合GG基因型的母猪，然后通过相互交配得到GG纯合基因型种猪，制作用于肌内脂肪含量高的品种培育的配套系。