CN113355428B - 一种与达100kg体重日龄相关的SNP标记及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与达100kg体重日龄相关的SNP位点，该SNP位点位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处，具有C/T多态性，该位点处基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪，具有较低的达100kg体重日龄。本发明提供的与达100kg体重日龄相关的SNP位点，对解释猪生长速率和肌肉发育等性状的分子机制有着至关重要的作用。在猪生长性状的早期选育过程中，可以通过鉴定该SNP位点的不同等位基因来筛选达100kg体重日龄低的猪种。本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，操作简单快捷，鉴定准确，可以用于猪生长性状的早期选育，缩短了育种周期，提高了育种效率。

Description

一种与达100kg体重日龄相关的SNP标记及其应用方法

技术领域

本发明属于分子遗传学中的遗传标记检测技术领域，具体涉及一种与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记及其应用方法。

背景技术

猪肉是现代人类主要的肉食产品之一，我国猪肉消费量约占全球消费的一半以上。猪生长性能高低的评价主要包括背膘厚度、眼肌面积和达100kg体重日龄等生长性状指标，其中，达100kg体重日龄是反映肌肉生长的重要指标。

达100kg体重日龄是指猪体重达到100kg时的日龄，可以反映猪个体的生长速度。对于猪达100kg体重日龄，目前除了在性染色体上没有找到相关位点外，其余的常染色体上都发现了与其相关的QTL区域。但是大部分报道的QTL置信区间比较大，很难通过QTL图谱鉴定到影响达100kg体重日龄的候选基因。

全基因组关联分析是鉴定表型和基因型之间遗传联系的主要手段，可以发现影响不同生产性状的SNPs(单核苷酸多态性)。但是，目前缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记。

因此，发掘与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记及其应用方法，对猪生产和育种具有重要意义。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，采用全基因关联分析的方法，挖掘得到与猪达100kg体重日龄相关的SNP位点，该SNP位点位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处，具有C/T多态性，该位点处基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪，具有较低的达100kg体重日龄，该SNP标记对解释猪生长速率和肌肉发育等性状的分子机制有着至关重要的作用。在猪生长性状的早期选育过程中，可以通过鉴定该SNP位点的不同等位基因来筛选达100kg体重日龄低的猪种，缩短了育种周期，加速了改良进程，对猪生产和育种具有重要意义，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

本发明提供了一种与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP标记，其中，所述标记位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处。

其中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP标记具有C/T多态性。

其中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪，具有较低的达100kg体重日龄。

本发明还提供了一种鉴定或者辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，其中，所述方法包括检测猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的核苷酸类型，并确定待测猪基因型的步骤。

其中，所述确定待测猪的基因型的方法可以采用直接测序或先扩增含所述SNP标记的核苷酸片段再检测的方式进行。

本发明还提供了一种第一方面所述的SNP标记在筛选达100kg体重日龄低的猪群体方面的应用。

其中，所述应用包括以下步骤：

步骤I，提取待测猪的基因组DNA；

步骤II，检测待测猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP位点的基因型；

步骤III，根据基因型筛选达100kg体重日龄低的猪群体。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，对解释猪生长速率和肌肉发育等性状的分子机制起着至关重要的作用；

(2)本发明提供的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，可以用于猪的早期选育，降低猪育种成本，缩短育种周期，加速了育种进程；

(3)本发明提供的与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记，可以应用在猪的遗传改良中，通过鉴定该SNP标记来选择猪达100kg体重日龄低的种猪个体，提高猪的生长速度和产肉量，具有重要的经济效益；

(4)本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，操作简单快捷，鉴定准确，可以用于猪生长性状的早期选育。

附图说明

图1示出本发明实施例1中的猪达100kg体重日龄的全基因关联分析曼哈顿图；

图2示出本发明实施例2中基因型效应的箱线图。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明人研究发现，通过全基因组关联分析挖掘与达100kg体重日龄相关的SNP位点，对解释猪生长速率和肌肉发育等性状的分子机制有着至关重要的作用，从而可以利用与达100kg体重日龄显著关联的SNPs对猪进行早期选择，节省生产成本并加快遗传进展。

本发明的第一方面，提供了一种与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP标记，所述标记位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处。

其中，所述SNP位点为ASGA0098828。

根据本发明一种优选的实施方式，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP标记与SEQ ID NO.1所示核苷酸片段的第501bp处。

在本发明中，优选所述SNP位点的碱基与SEQ ID NO.1所示核苷酸片段第501bp处的碱基互补。

在进一步优选的实施方式中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP标记具有C/T多态性。

在更进一步优选的实施方式中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪，具有较低的达100kg体重日龄。

其中，所述SNP位点对应的三种基因型分别为CC、TC和TT，CC基因型是该SNP位点为碱基C的纯合子，TC基因型是该位点为杂合子，TT基因型是该SNP位点为碱基T的纯合子。

对SNP位点进行基因分型可以在一定程度上排除表型选择中饲养环境、饲料、疾病等因素对猪优良基因的误淘和误选，增强目标性状选择准确性。因此，本发明中优选对SNP位点进行基因分型。

优选地，本发明中的基因分型选择高密度SNP芯片技术，因为其相对于传统的基因分型方法(如PCR、RFLP等)，可以在很短的时间周期内对大量的SNP进行分型，效率高，其能极大地降低成本。

更优选地，本发明采用Neogen公司的Neogen POR 80K芯片进行基因分型，采用的分型平台软件为Neogen公司的GenCall(Version7.0.0)。

本发明的第二方面，提供了一种第一方面所述SNP标记的获取方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，选择猪群体，进行达100kg体重日龄测定。

其中，选择的猪群体包括多个品种的公猪和母猪。

优选地，猪群体的体重在85～105kg范围内，称重前禁食12小时再进行测定，采用电子称重台称重，记录猪的体重和测定时的实际日龄。

更优选地，对猪达100kg体重的实际日龄进行校正，利用河北省地方标准(DB-13/T2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正，

具体按下述校正公式进行：

校正日龄＝测定日龄(d)-[(实测体重(kg)-100)/CF]

其中，公猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.826040；

母猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.714615。

对测定后的表型数据进行质量控制：清除表型值缺失的个体，清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。

步骤2，提取猪群体的基因组DNA，进行基因分型。

在本发明中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪群体中每个个体的基因组DNA，采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。

在得到DNA后，优选采用分光光度计和电泳对提取的猪基因组DNA进行浓度测定和质量检测，其中，提取的DNA的A260/A280比值在1.8～2.0，A260/A230比值在1.7～1.9判定为纯度合格；将浓度高于300ng/μL判定为浓度合格。

优选地，将检测合格的DNA利用高密度SNP芯片进行基因型检测，如Neogen公司的Neogen_POR80K芯片，优选利用分型软件GenCall Version7.0.0进行。

更优选地，对分型后的基因型数据进行质量控制：清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率小于(Minimum AlleleFrequency，MAF)小于1％的个体；清除哈代-温伯格平衡(Hardy–Weinberg Equilibrium，HWE)卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点；清除性染色体上的SNP位点。

步骤3，进行关联分析。

在本发明中，采用R语言包GAPIT(Version 3)统计分析软件，基于压缩混合线性模型进行SNP位点与校正达100kg日龄的全基因组关联分析，统计分析模型如下：

Y＝Xβ+Zu+e；

其中，Y是观察到的表型值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(Q矩阵)和截距；u是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。

通过上述关联分析，能够得到与校正猪达100kg体重日龄相关的SNP位点，还需要进一步比较分析所得SNP位点中不同基因型与校正猪达100kg体重日龄的关联结果。

优选地，采用Rstudio软件对基因型数据和表型数据利用Kruskal-Wallis方法进行差异显著性检验，以获得与猪达100kg体重日龄显著相关的基因型类型。

本发明的第三方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获取的SNP标记在鉴定或者辅助鉴定猪达100kg体重日龄方面的应用。

本发明的第四方面，提供了一种用于检测第一方面所述SNP标记的引物对，所述引物对包括P1和P2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明的第五方面，提供了一种四方面所述引物对在鉴定或者辅助鉴定猪达100kg体重日龄方面的应用。

本发明的第六方面，提供了一种鉴定或者辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，所述方法包括检测猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的核苷酸类型，并确定待测猪基因型的步骤。

其中，可采用直接测序，或先扩增含所述SNP标记的核苷酸片段再检测的方式进行。例如：采用上述引物对P1和P2扩增得到含有SNP标记的DNA片段，再检测该位点上的等位基因。

在本发明中，若待测猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP位点的基因型为TT，则具有较低的达100kg体重日龄；若待测猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP位点的基因型为TC或CC，则具有较高的达100kg体重日龄。

本发明的第七方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法筛选得到的SNP标记在筛选达100kg体重日龄低的猪群体方面的应用，所述应用包括以下步骤：

步骤I，提取待测猪的基因组DNA。

步骤II，检测待测猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP位点的基因型。

步骤III，根据基因型筛选达100kg体重日龄低的猪群体。

本发明的第八方面，提供了一种猪达100kg体重日龄的遗传改良方法，所述方法包括确定猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP标记，并根据SNP标记做出相应选择的步骤。

进一步地，种猪的继代选择猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr17：47,632,193处的SNP位点的基因型为TT的个体，淘汰该位点基因型为TC和CC的个体，以逐代提高该位点的纯合基因型TT的频率，从而降低猪达100kg体重日龄，提高猪的肌肉生长速度。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1 SNP位点的获得

1、试验猪群体

本实施例所采用的猪群体为1173头来自河北美神原种猪场的猪，其中，杜洛克公猪23头，杜洛克母猪177头，长白公猪15头，长白母猪363头，大白公猪2头，大白母猪593头。

2、达100kg体重日龄测定与校正

挑选体重在85～105kg的公、母猪，称重前禁食12小时，采用电子称重台称重，记录猪的体重和测定时实际日龄，并按照如下校正公式转换成100kg体重的日龄(D100)：

校正日龄＝测定日龄(d)-[(实测体重(kg)-100)/CF]

其中，公猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.826040；

母猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.714615。

3、基因组DNA提取

采用北京百泰克生物技术有限公司的DP1902型号细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，从猪的耳组织中提取DNA，用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测，将检测合格的DNA放置于-20℃长期保存。

猪耳组织DNA的具体提取步骤如下：

(1)将猪耳组织剪碎后放入一个1.5ml离心管后，加入200μl组织裂解液TL，用大口径枪头吹打混匀；

(2)加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒轻摇充分混匀；

(3)将裂解的耳组织放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解；

(4)用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2-3次；

(5)加入200μl结合液CB和100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混匀；

(6)13000rpm离心5分钟，将上清液加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；

(7)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液；

(8)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液；

(9)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液；

(10)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

(11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟；洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量；

(12)DNA可以暂存于2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃，为DNA分型做准备。

上述步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时(如样品粘稠不易混匀)可以涡旋振荡15秒混匀。

用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测，将检测合格的DNA放置于-20℃保存。

4、基因分型

取检测合格的基因组DNA，采用Neogen公司的Neogen_POR80K芯片检测每个个体的基因型，SNP的分型平台软件为Neogen公司的GenCall(Version 7.0.0)。

5、对表型数据和基因型数据进行质量控制

表型数据的质量控制标准为：清除表型值缺失的个体，清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体；

基因型数据的质量控制标准为：清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率小于(Minimum Allele Frequency，MAF)小于1％的个体；清除哈代-温伯格平衡(Hardy–Weinberg Equilibrium，HWE)卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点；清除性染色体上的SNP位点。

经过上述质量控制后，共筛选获得1123头猪的基因型和表型数据，其中杜洛克公猪23头、母猪171头，长白猪公猪12头、母猪336头，大白猪公猪2头、母猪579头。

6、全基因组关联分析

采用R语言包GAPIT Version 3对所有分型SNP位点与校正猪达100kg体重日龄进行全基因组关联分析，采用的统计分析模型如下：

Y＝Xβ+Zu+e；

其中，Y是观察到的表型值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(Q矩阵)和截距；u是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。

与达100kg体重日龄的全基因关联分析曼哈顿图如图1所示，可以看出，ASGA0098828是全基因组范围内关联性最显著的SNP位点。

实施例2 SNP位点不同基因型与达100kg体重日龄的关联结果

取实施例1中猪群体的基因组DNA，采用纽勤公司的Neogen_POR80K检测每个个体的基因型，通过R语言提取多态性位点的序列，统计SNP位点(ASGA0098828)的基因型频率和基因频率分布，结果如表1所示：

表1

由表1可知，TT基因型为本实施例中试验群体优势基因型。

采用Rstudio软件对基因型数据和表型数据利用Kruskal-Wallis方法进行差异显著性检验，其中，P-value＜0.01表明差异极显著。关联分析结果如表2所示：

表2

由表2可知，SNP位点ASGA0098828(T/C；Chr17:47,632,193)与达100kg体重日龄存在极显著相关(P<0.01)。TT基因型的猪个体平均达100kg体重日龄极显著低于TC和CC基因型的个体的平均达100kg体重日龄(P<0.01)。

进一步地，利用R语言的ggplot2、ggpubr和magrittr函数包绘制三种基因型效应的箱线图，结果如图2所示。

由图2可知，TT基因型的个体达100kg体重日龄(145.36天)比TC基因型的个体(155.28天)低9.92天，比CC基因型的个体(153.33天)低7.97天。

因此，综上所述，位点ASGA0098828的多态可以作为猪达100kg体重日龄鉴定的分子标记，应用于分子育种中以改良猪的生长性状，提高产肉量。在猪分子育种过程中，继代选育该位点的TT基因型个体作为种猪，可以筛选出达100kg体重日龄低的猪群体，进而达到提高猪的生产效率的目的。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院农业基因组研究所

<120> 一种与达100kg体重日龄相关的SNP标记及其应用方法

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 核苷酸片段（Sus scrofa）

<400> 1

caacagatgt atacacggca gagtgaccta gtctaaacca caagtctaat tagcctctat 60

caccgtacag ttgacctcca acctccttcc cctcagctaa cccctaaaag cttcacctgc 120

agctgtgagt ttgcttttgt gttattttat tttttttgct cactgttatt ttttgctttt 180

tttttttcag tttctacgta tgaaaaaaat cacgtggtgt ttgtctttgt ctgacctatt 240

tcacttaaca taatgccctc aaggtccatc caagttgttg ccaacagcag ggtttcattc 300

ttttttgtgc tgacaaaaaa gacatacaca cagcccacgt cttttttatc catccattga 360

tgggttctta tgctgtttcc atatcttggc tattgtaaat aacgttgctg tggacatagg 420

ggtgcatata tctttttgaa tgaatgcttt tgttttcttt ggataaatat ccagtagtag 480

aatagctgga tcatgcggtt gttctagtct taattttctg aggaatctcc atactatgat 540

ccaaagtggc tgcaccattt tacagtccta ccagcagtgt atgagggtcc cctttcccta 600

catcctctcc aacatttgtg acccctttcc tttttttttt tttttgtctt tttagggcca 660

catccatggc atatggaagt tcccaggcta gggagtcgaa tcagagctac agtggccggc 720

ctgcaccaca gccacagcaa caccagatat gagccacatc tgtgacctat accacagctc 780

atggccatgc tggatcctta acacactaag tgaggccaga gattgaaccc aagtcctcat 840

ggatactagt tgagttcatt accgctgagc cacagtggga actcccaccc cttgtctttt 900

tgataataac catcctaaca ggtatggtga tatctcattg tggttttaat ttgtatttct 960

ctggcaatta gtgatgctga atatcttttc atgtgcctgt t 1001

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物P1（人工序列）

<400> 2

agctgtgagt ttgcttttgt gttat 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物P2（人工序列）

<400> 3

cagcggtaat gaactcaact agtat 25

Claims (4)

1.一种鉴定或者辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于，所述方法包括确定猪位于国际猪参考基因组10.2版本的17号染色体第47,632,193个核苷酸位点的基因型的步骤；

所述第47,632,193个核苷酸位点具有C/T多态性，所述第47,632,193个核苷酸位点为TT基因型的猪的100kg体重日龄低于基因型为TC或CC的猪的100kg体重日龄；

所述猪的品种为杜洛克猪、长白猪和大白猪。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定猪位于国际猪参考基因组10.2版本的17号染色体第47,632,193个核苷酸位点的基因型的方法可以采用直接测序或先扩增含所述第47,632,193个核苷酸位点的核苷酸片段再检测的方式进行。

3.用于检测与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP分子标记的引物对在筛选达100kg体重日龄低的猪群体方面的应用，其特征在于，

所述与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP分子标记的SNP位点为国际猪参考基因组10.2版本的17号染色体第47,632,193个核苷酸位点；选择所述SNP位点的基因型为TT的猪群体，

所述引物对包括P1和P2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述猪的品种为杜洛克猪、长白猪和大白猪。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

步骤I，提取待测猪的基因组DNA；

步骤II，检测待测猪位于所述SNP位点的基因型；

步骤III，根据基因型筛选达100kg体重日龄低的猪群体。

Images