CN114134233B - 一种与猪达100kg日龄和眼肌面积相关的SNP - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪达100kg日龄和眼肌面积相关的SNP，本发明发现猪8号染色体正义链第143,777,724位点A/G型突变的SNP分子标记与猪生长性状显著相关，GG基因型与其他基因型相比具有更小的达100kg体重日龄和更大的眼肌面积(P<0.0001)。该核苷酸位点检测方法简单快捷，可作为评价家猪生长性能的分子遗传标记，有效提高猪群的选种效率并加快遗传进展。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与猪达100kg日龄和眼肌面积相关的SNP标记的开发与利用。
背景技术
生猪产业一直都是畜牧业的重要组成部分，猪肉产量以及整个生猪产业的经济效益与猪生长性状紧密相关，肌肉发育越快，生长育肥期越短，饲料投入越低，饲养成本越少，经济效益越高。
杜洛克猪具有生长速度快、料重比低、胴体品质好、眼肌面积大和瘦肉率高等优点，常用作猪育种工作的终端父本；长白猪同样具有着生长发育快、料重比低和胴体瘦肉率高等优良特性，是市场上最常见的商品猪类型之一；大白猪又称大约克猪，由于母性好，繁殖性能好，常用于猪育种工作的母本。以上三种猪种均为世界知名猪种，在我国生猪养殖业中具有支柱性作用。为了提高猪肉产量，最直接的手段之一是提高生猪的生长性能。其中个体达100kg体重日龄和眼肌面积是衡量猪生长性状的重要指标，达100kg体重日龄越小、眼肌面积越大说明猪生长性能越好。
为了进一步提高家猪的生长速度，需要更加深入地研究影响猪生长性能的关键遗传位点和候选基因。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。全基因组关联分析(Genome-wide AssociationStudy,GWAS)是通过全基因组范围内的SNP分布信息与生产性状进行关联分析，鉴定与猪表型相关的SNP位点与数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)，进一步可以发现与猪生长性状相关的分子标记等，从而有效提高生猪的选种效率，也为分子育种、标记辅助选择和转基因育种等提供重要的参考材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一个可用于猪育种工作中，与猪生长性状相关的分子标记。
所述分子标记位于猪Sscrofa10.2第8号染色体正义链第143,777,724位核苷酸，为A或G，命名为SNP标记ASGA0040345，其对应序列信息如SEQ.1的第125bp处R所示,R表示A或G。
本发明提供一种鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积大小的方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中SNP标记ASGA0040345的基因型，所述SNP标记ASGA0040345为位于10.2版猪参考基因组的第8号染色体第143,777,724位核苷酸，其为A或G；其中，所述AA基因型与AG基因型的猪的猪眼肌面积小于GG基因型的猪的猪眼肌面积，AA基因型的猪的猪眼肌面积小于AG基因型的猪的猪眼肌面积；
所述AA基因型为SNP标记ASGA0040345为A的纯合型；
所述AG基因型为SNP标记ASGA0040345为A和G的杂合型；
所述GG基因型为SNP标记ASGA0040345为G的纯合型。
本发明提供一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄大小的方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中SNP标记ASGA0040345的基因型，所述SNP标记ASGA0040345为位于10.2版猪参考基因组的第8号染色体第143,777,724位核苷酸，其为A或G；其中，纯合GG基因型与纯合GA基因型的猪的达100kg体重日龄小于杂合AA基因型的猪的达100kg体重日龄，纯合AA基因型的猪的达100kg体重日龄大于纯合AG基因型的猪的达100kg体重日龄；
所述AA基因型为SNP标记ASGA0040345为A的纯合型；
所述AG基因型为SNP标记ASGA0040345为A和G的杂合型；
所述GG基因型为SNP标记ASGA0040345为G的纯合型。
检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的物质在如下A1-A3中的应用；所述SNP标记ASGA0040345为位于10.2版猪参考基因组的第8号染色体第143,777,724位核苷酸，其为A或G：
A1，在鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄中的应用；
A2，在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积中的应用；
A3，在猪育种中的应用。
其中，所述A3中的猪育种为培育猪达100kg体重日龄小和/或猪眼肌面积大的猪品种。
所述检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的物质如下B1)或B2)或B3)或B4)：
B1)用于扩增含有SNP标记ASGA0040345的DNA片段的成套引物；
B2)含有A1)的PCR试剂；
B3)含有A1)或A2)的试剂盒；
B4)用于检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的SNP芯片，如Neogen公司的Neogen_POR80K芯片。
本发明提供一种产品，所述产品为上述检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的物质：
B1)用于扩增含有SNP标记ASGA0040345的DNA片段的成套引物；
B2)含有A1)的PCR试剂；
B3)含有A1)或A2)的试剂盒；
B4)用于检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的SNP芯片，如Neogen公司的Neogen_POR80K芯片。
本发明提供一种猪的育种方法，所述方法包括：检测待测猪基因组中所述SNP标记ASGA0040345的基因型，选择纯合GG基因型的猪进行育种。
所述产品或所述方法在猪育种中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明发现猪8号染色体正义链第143,777,724位点A/G型突变的SNP分子标记与猪生长性状显著相关，GG基因型与其他基因型相比具有更小的达100kg体重日龄和更大的眼肌面积(P<0.0001)。该核苷酸位点检测方法简单快捷，可作为评价家猪生长性能的分子遗传标记，有效提高猪群的选种效率并加快遗传进展。
附图说明
图1.全基因组关联分析曼哈顿图。A：D100关联分析；B：LEA关联分析。
图2.ASGA0040345位点单因素方差分析。A：D100相关性分析；B：LEA相关性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的杜洛克猪、长白猪和大白猪，河北衡水原种猪场；
下述实施例中的猪10.2版参考基因组均是指GenBank中更新日为2011年09月07日的猪参考基因组序列。
实施例1猪ASGA0040345位点多态性的确定
发明人发现了与猪生长性状相关的分子标记，所述分子标记位于猪Sscrofa10.2第8号染色体正义链第143,777,724位核苷酸，为A或G，命名为SNP标记ASGA0040345，其对应序列信息如SEQ.1的第125bp处R所示,R表示A或G。
所述SNP标记ASGA0040345的基因型为AA(简称为AA基因型)、GG(简称为GG基因型)或AG(简称为AG基因型)。其中，所述AA基因型为SNP标记ASGA0040345为A的纯合型；所述AG基因型为SNP标记ASGA0040345为A和G的杂合型；所述GG基因型为SNP标记ASGA0040345为G的纯合型。
本发明发现猪8号染色体正义链第143,777,724位点A/G型突变的SNP分子标记与猪生长性状显著相关，GG基因型与其他基因型相比具有更小的达100kg体重日龄和更大的眼肌面积(P<0.0001)。
实施例2、SNP标记ASGA0040345与猪生长性状性状相关分子标记
所述生长性状指标为达100kg体重日龄及眼肌面积
1.实验动物
试验猪资源群体来自河北衡水原种场基础母猪场，共1,177头。其中DD_BOAR(杜洛克公猪)23头，DD_GILT(杜洛克母猪)178头，LL_BOAR(长白公猪)15头，LL_GTLT(长白母猪)364头，YY_BOAR(大白公猪)2头，YY_GILT(大白母猪)595头。
2.样品采集及DNA提取
实施例1共采集了1,177头猪耳组织样品(具体信息如上所示)，并记录了每头猪的表型数据，包括达100kg体重日龄(D100)及眼肌面积(LEA)。采用全国畜牧兽医总站[2000]60号文件《全国种猪遗传评估方案》的遗传评估性状测定规程，对采集的数据进行表型数据校正。DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司的DP1902型号细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，从猪的耳组织中提取DNA(具体方法见说明书)，用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测，将检测合格的DNA放置于-20℃长期保存。
3.基因分型
采用的是Neogen公司的Neogen_POR80K芯片对步骤2中采集的1177份DNA样品，1,177个个体的SNP分型工作由Neogen公司完成，SNP的分型所用平台软件为GenCall，Version为7.0.0。结果如表1所示。
表1.位点ASGA0040345基因分型情况
4.获取生长性状(达100kg体重日龄和眼肌面积)表型信息
挑选上述1177头已知基因型的猪，分别测定每头猪的达100kg体重日龄和眼肌面积，因篇幅原因，选取部分对应表型数据记录在表2中。
其中，达100kg体重日龄的获取方法为：在测定达100kg体重日龄时，挑选体重在80～105kg范围的后备公、母猪进行空腹测定，使用带有单栏的电子秤，测定同时进行记录，纪律的数据包括个体编号、性别、测定日期、体重、测定人员等，并按河北省地方标准(DB13/T2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正，转换成达100kg体重的日龄：
校正日龄＝测定日龄-[(实测体重-100)/CF]
其中：公猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.826040
母猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615
其中，眼肌面积的获取方法为：待目标猪群在体重85-105kg范围内，称重前禁食12小时再进行测定，记录测定日龄和测定的体重和眼肌面积。采用B超扫描测定倒数第1-2肋骨间背最长肌的横断面面积，以平方厘米(cm2)为单位，利用河北省地方标准(DB13/T2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正：
校正眼肌面积(cm2)＝实际眼肌面积(cm2)+{[100-实际体重(kg)]×实际眼肌面积(cm2)}/[实际体重(kg)+70]
表型数据和基因型数据的质量控制
表型数据的质量控制标准为：清除表型值缺失的个体；标准差检验出来表型值偏差较大的个体。
芯片控制的过滤标准为：清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)小于1％的个体；清除哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点；清除性染色体上的SNP位点。
表2，1177头中部分测试猪的基因型与生长性状数据统计
5.多品种全基因组关联分析
本采用华盛顿大学张志武老师实验室研发的分析软件包为R语言包GAPITVersion 3进行全基因关联分析，此软件包的统计模型为压缩混合线性模型(http://www.zzlab.net/GAPIT/，在文献GAPIT Version 2:An Enhanced Integrated Tool forGenomic Association and Prediction.The Plant Genome2016,9(2)1-9.中公开)。GAPIT的设计目的是在大数据集上准确地执行GWAS和基因组预测。混合线性模型(Mixed LinerModel，MLM)包括固定和随机效应，模型将种群结构作为固定效应，同时将个体纳入随机效应进行个体亲缘关系矩阵的构建。其统计分析模型为：
Y＝Xβ+Zu+e
其中Y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(Q矩阵)和截距；u是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。
利用GAPIT的混合线性模型(MLM)在包含三个品种的群体中，针对步骤三中1177头的SNP位点与两种生长性状(达100kg体重日龄和眼肌面积)的数据进行全基因组关联分析，若P-value＜0.05则表明关联显著，结果如表3所示。ASGA0040345位点与达100kg体重日龄和眼肌面积显著相关(图1.A，图1.B)。对ASGA0040345位点单独进行单因素分析结果如图2.A，图2.B所示，GG基因型呈现明显的较小的达100kg体重日龄和较大的平均眼肌面积。
表3 ASGA0040345位点全基因组关联分析
结合表3和图1和图2，可以看出，三种基因型的达100kg体重日龄和猪眼肌面积存在显著差异。纯合GG基因型与纯合GA基因型的猪的达100kg体重日龄小于杂合AA基因型的猪的达100kg体重日龄，纯合AA基因型的猪的达100kg体重日龄大于纯合AG基因型的猪的达100kg体重日龄，AA基因型与AG基因型的猪的猪眼肌面积小于GG基因型的猪的猪眼肌面积，AA基因型的猪的猪眼肌面积小于AG基因型的猪的猪眼肌面积。
实施例3、ASGA0040345位点的注释及利用
对ASGA0040345位点进行SnpEff进行注释
试验利用SnpEff软件(http://snpeff.sourceforge.net/)和Sscrofa10.2版本猪的全基因组注释数据，在Linux环境下对显著性的SNP位点进行注释。
对ASGA0040345位点进行QTL定位分析
动物数量性状位点(QTL)数据库(AnimalQTLdb)是储存动物相关性状QTL的数据库，我们对ASGA0040345位点利用AnimalQTLdb(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index)中的pigQTL进行QTL定位分析。
实验结果
ASGA0040345是在多品种猪全基因组关联分析发现的与眼肌面积和达100kg体重日龄性状显著相关的位点，该位点位于猪8号染色体上，ENSSSCG00000009231和ENSSSCG00000009232的基因间区，距离两个基因均在20kb以上。QTL定位发现该位点处于已知的氧饱和度、钠含量、青春期年龄和卵巢重量等性状相关的QTL区间内。定位的这些QTL区间大多与细胞发育和肉质性状相关。ASGA0040345位点可用于以分子标记辅助选择为中心的分子育种实践中，有效提高猪育种效率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 一种与猪达100kg日龄和眼肌面积相关的SNP
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agggaggagt agtttattag cctcttcaga taattgtgta tttcgtcttt gatagtgaaa 60
ctgacagcac taacagcctg aacccagtca gaacccagac tgggacatga acccatatgc 120
cgggrctcga gctcagccta aagccagatc aggacttaaa cccacaggtt taaattagaa 180
tcactcaccc tgtgtgtgga ctcactgagg ttcaggttct ttacgcctcc acacagaagg 240
aattcagcaa gagacaaagt gataggcaag aatcagattt atcaggatag gatgcttgtg 300
agagatgcaa gtgggcaggc aaggaagctc tgccccagga ttcgcagttt tatcatccaa 360
ggggcgtggg ggtaggaaag gcccgcctct tcctttctgg 400
Claims (8)
1.一种鉴定或辅助鉴定猪生长性状的方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测猪基因组中SNP标记ASGA0040345的基因型，所述SNP标记ASGA0040345为位于10.2版猪参考基因组的第8号染色体第143,777,724位核苷酸，其为A或G。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述生长性状为猪的猪眼肌面积，其中，AA基因型与AG基因型的猪的猪眼肌面积小于GG基因型的猪的猪眼肌面积，AA基因型的猪的猪眼肌面积小于AG基因型的猪的猪眼肌面积；
所述AA基因型为SNP标记ASGA0040345为A的纯合型；
所述AG基因型为SNP标记ASGA0040345为A和G的杂合型；
所述GG基因型为SNP标记ASGA0040345为G的纯合型。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述生长性状为猪的达100kg体重日龄，其中，GG基因型与GA基因型的猪的达100kg体重日龄小于AA基因型的猪的达100kg体重日龄，AA基因型的猪的达100kg体重日龄大于AG基因型的猪的达100kg体重日龄；
所述AA基因型为SNP标记ASGA0040345为A的纯合型；
所述AG基因型为SNP标记ASGA0040345为A和G的杂合型；
所述GG基因型为SNP标记ASGA0040345为G的纯合型。
4.检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的试剂和/或芯片在如下A1-A3中的应用；所述SNP标记ASGA0040345为位于10.2版猪参考基因组的第8号染色体第143,777,724位核苷酸，其为A或G：
A1，在鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄中的应用；
A2，在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积中的应用；
A3，在猪育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述A3中的猪育种为培育猪达100kg体重日龄小和/或猪眼肌面积大的猪品种。
6.根据权要求4或5所述的应用，其特征在于：所述检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的试剂和/或芯片如下B1)或B2)或B3)或B4)：
B1)用于扩增含有SNP标记ASGA0040345的DNA片段的成套引物；
B2)含有B1)的PCR试剂；
B3)含有B1)或B2)的试剂盒；
B4)用于检测SNP标记ASGA0040345的多态性或基因型的SNP芯片。
7.一种猪的育种方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测猪基因组中权利要求1-4中任一所述SNP标记ASGA0040345的基因型，选择纯合GG基因型的猪进行育种。
8.权利要求1-3或7所述方法在猪育种中的应用。
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