CN110218798A

CN110218798A - 位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的snp分子标记及应用

Info

Publication number: CN110218798A
Application number: CN201910403273.3A
Authority: CN
Inventors: 杨杰; 吴珍芳; 彭珑珑; 庄站伟; 徐铮; 郑恩琴; 蔡更元
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2039-05-15
Also published as: CN110218798B

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记及应用。所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第30342161位A>G突变。本发明还提供了一种用于鉴定上述分子标记的引物对。通过上述分子标记和引物对，可逐代筛选该SNP的优势等位基因，提高优势等位基因频率，提高猪眼肌面积和眼肌厚度，最终提高肉猪的经济效益，在猪遗传改良进展中有十分重要的意义。

Description

位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记及应用。

背景技术

我国是世界养猪生产和猪肉消费大国，无论是养殖数量还是猪肉消费量均居世界第一，猪肉消费水平在我国总体的肉类消费中占据主导地位。随着人口数量的增长，人们对畜禽农产品的需求越来越大，这要求我们要加快培育产肉更多、肉质更好的种猪品种。如果从营养调控和生产环境等外观因素上进行改善来提高肉质，效果往往不理想。事实上，遗传因素对家畜肉品质才有决定性作用。根据相关研究可知，肉质性状是受数量性状基因座控制。在影响产肉性状的因素中，增加眼肌面积和眼肌厚度可以提高胴体瘦肉率、降低背膘厚，其中眼肌面积与眼肌厚度呈正相关，并且眼肌面积和眼肌厚度均与猪肉产量相关。因此，眼肌面积和眼肌厚度与家畜的产肉性能有直接关系，是评定胴体产肉能力的主要指标。

眼肌面积是指家畜背最长肌的横断面面积，是评价产肉性状的常用指标。眼肌面积的计算方法主要有求积仪法、图像法、坐标纸法和公式法等。但眼肌面积是一个数量性状，受多个微效基因控制。之前，人们采用QTL定位和候选基因法去鉴别其中的主效基因，但是两种方法都有自己的弊端，QTL定位置信区间比较大并且会受到不同家系群体的影响，候选基因法虽然操作简单，应用性比较强，但不能检测功能未知的基因，同样不能满足应用的需求。随着猪基因组测序和高密度SNP的开发，使得全基因组关联分析(GWAS)能够对众多重要性状的候选基因进行鉴定。因此，通过GWAS分析，可以得到眼肌厚度和眼肌面积的分子标记，从而提高种猪瘦肉率，为育种工作提供帮助，提高养殖效益。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述SNP分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第30342161位A>G突变；

所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是A或G，导致猪眼肌面积和眼肌厚度的不同；

所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的SNP位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为72位的G72-A72的核苷酸突变；

所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记在鉴定猪眼肌面积、眼肌厚度相关性状和猪遗传育种中的应用；

利用上述位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记筛选高眼肌面积和眼肌厚度性状的猪品种的方法，包含如下步骤：

检测猪7号染色体上上述位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记，所述的SNP分子标记的5’端第72位单核苷酸是G还是A，淘汰A保留G；

所述的猪优选为加系杜洛克及其合成系；

一种用于鉴定上述位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的引物对，包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’-TTGTCACTGTTCAGCAACCCAC-3’；

P002-R：5’-CCCACAAGCCAAGCCAGA-3’；

所述的引物对在鉴定猪眼肌面积和眼肌厚度相关性状中的应用；

所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对在提高猪眼肌面积和眼肌厚度中的应用；

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的位点，并根据该分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第30342161位点为GG基因型的种猪个体，淘汰在第30342161该位点为AG、AA基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因G的频率，从而提高后代猪的眼肌面积和眼肌厚度；

所述的猪优选为加系杜洛克及其合成系；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响猪眼肌面积和眼肌厚度相关的分子标记位于猪的7号染色体的核苷酸序列上，验证其对眼肌面积和眼肌厚度性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪提高眼肌面积和眼肌厚度的遗传改良中，从而提高后代猪的肉质品质，提高企业利润，增加核心竞争力。具体可以为：通过逐代筛选该SNP的优势等位基因，提高优势等位基因频率，从而提高猪眼肌面积和眼肌厚度，最终提高肉猪的经济效益，在猪遗传改良进展中有十分重要的意义。

(2)本发明提供一种鉴定上述位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对肉质品质进行选育，加快育种进程。

附图说明

图1是加系杜洛克猪在7号染色体上关于眼肌面积性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型猪的眼肌面积的表型比例结果分析图。

图3是加系杜洛克猪在7号染色体上关于眼肌厚度性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图4是不同基因型猪的眼肌厚度的表型比例结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种加系杜洛克2153头，为种猪分公司核心群。

本实验所选取该资源群体中加系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

(2)样本采集

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)猪全基因组50K SNP判型

从上述资源群体中选取的2153头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到35845个SNP的有效基因型数据。

(4)全基因组关联(GWAS)分析

为了消除群体层化效应，本发明采用GEMMA软件中的线性混合模型进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferroni法确定SNP与眼肌面积和眼肌厚度性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.39e-6，即0.05/35845(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.79e-5，即1/35845(有效SNP数量)。

GWAS分析结果如图1和图3所示。从图1和图3可知，在杜洛克中，在7号染色体中存在显著影响眼肌面积和眼肌厚度的位点，最强关联的SNP为g.72A>G(P＝8.40e-6)。

(5)不同基因型与眼肌面积和眼肌厚度表型的关联性分析

根据表1和表2可知，分子标记的SNP位点g.72A>G(SEQ NO.1中第72位核苷酸，即对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第30342161位A>G突变)与眼肌面积和眼肌厚度性状极显著相关(P<0.01)，说明此分子标记显著影响猪的眼肌面积和眼肌厚度性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的眼肌面积和眼肌厚度，进而加快育种进程。

另外根据表1、表2及图2、图4可知，AA型、AG型比GG型的平均眼肌面积、眼肌厚度低，GG型较AA型、AG型显著，而AA型与AG型不显著，说明等位基因A对眼肌面积和眼肌厚度是不利的。眼肌面积和眼肌厚度是衡量猪肉质品质的重要指标，眼肌面积和眼肌厚度更高说明猪的眼肌更大。因此，淘汰AA、AG基因型的猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰AA、AG型的种猪，保留GG型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因G的频率。

表1分子标记的SNP位点g.72A>G与眼肌面积的相关性

表2分子标记的SNP位点g.72A>G与眼肌厚度的相关性

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的7号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。设计的引物的DNA序列如下所示：

P001-F：5’-TTGTCACTGTTCAGCAACCCAC-3’；

P002-R：5’-CCCACAAGCCAAGCCAGA-3’；

(2)PCR扩增

10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min后，95℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的SNP位点g.72A>G效应分析

根据表1、表2分析结果显示，该位点对猪眼肌面积和眼肌厚度的影响达到极显著水平(P<0.01)，并且GG型比AA型的平均眼肌面积大0.76cm²，平均眼肌厚度大1.02mm²。因此通过分子标记辅助选择，对群体内基因型为AA的猪进行淘汰，可以显著提高群体的眼肌面积和眼肌厚度，促进杜洛克种猪的育种进程，增加猪肉的眼肌大小，提高猪肉的瘦肉率，从而生产高品质的猪肉，促进猪肉销量的提升，同时也带动养猪产业经济效益更大化。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第72个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的眼肌面积和眼肌厚度性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记及应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 476

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的核苷酸序列

<400> 1

ttgtcactgt tcagcaaccc actttctgct tatttttggc cacctgcaca ggcagctggt 60

tcactaacca gmtaacttgg tttgacattt atcatcatat aaatgagcca actgtcatcc 120

aggcacatac acttcagtct cctgtgagtt aaactcatgc gaatcttgcc ctggtccatg 180

gaccactagg tttcttggcc cctggtggtg cacagtgggg tccccagagg tcagctgccc 240

tgggtggatg aacacgttca tctgagtgtg ataccccttt tattcttgcc tctctagcct 300

tctcttcatc cccaggccta ctccttgagt ctgcatggct ggcatcacga gcttccagaa 360

ggctcctttc taacctcccc tgctgcctcc tctccaaaca cagcgatttt ccatgatggc 420

cttgctccag aacacgtcac atgtacgcag ccaaactctc tggcttggct tgtggg 476

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P001-F

<400> 2

ttgtcactgt tcagcaaccc ac 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P002-R

<400> 3

cccacaagcc aagccaga 18

Claims

1.一种位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记，其特征在于其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第30342161位A>G突变；

所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是A或G，导致猪眼肌面积和眼肌厚度的不同。

2.权利要求1所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记在鉴定猪眼肌面积、眼肌厚度相关性状和猪遗传育种中的应用。

3.利用位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记筛选高眼肌面积和眼肌厚度性状的猪品种的方法，其特征在于包含如下步骤：

检测猪7号染色体上权利要求1所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记，所述的SNP分子标记的5’端第72位单核苷酸是G还是A，淘汰A保留G。

4.根据权利要求3所述的利用位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记筛选高眼肌面积和眼肌厚度性状的猪品种的方法，其特征在于：

所述的猪为加系杜洛克及其合成系。

5.一种用于鉴定权利要求1所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的引物对，其特征在于包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’-TTGTCACTGTTCAGCAACCCAC-3’；

P002-R：5’-CCCACAAGCCAAGCCAGA-3’。

6.权利要求5所述的引物对在鉴定猪眼肌面积和眼肌厚度相关性状中的应用。

7.权利要求5所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用。

8.权利要求5所述的引物对在提高猪眼肌面积和眼肌厚度中的应用。

9.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的权利要求1所述的位于猪7号染色体上与眼肌面积、眼肌厚度相关的SNP分子标记的位点，并根据该分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第30342161位点为GG基因型的种猪个体，淘汰在第30342161该位点为AG、AA基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因G的频率，从而提高后代猪的眼肌面积和眼肌厚度。

10.根据权利要求9所述的猪的遗传改良的方法，其特征在于：

所述的猪为加系杜洛克及其合成系。