CN108330197B - 一种与杜洛克种猪背膘厚相关的snp标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，涉及一种影响杜洛克猪背膘厚的SNP分子标记，所述SNP标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本2号染色体上第81306158个核苷酸位点，该点的碱基是A或C。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够加速杜洛克背膘厚的遗传进展，从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种与杜洛克种猪背膘厚相关的SNP标记及其用途

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，本发明涉及一种影响杜洛克种猪背膘厚的分子标记及其用途。

背景技术

猪的背膘厚指的是猪的皮下脂肪厚度，皮下脂肪是位于真皮层以下、筋膜层以上的皮下脂肪组织。养殖企业通常在种猪达100kg体重时进行背膘厚测定，测定位置位于倒数第3-4肋间、左侧距背中线5cm处，通过B型超声仪形成声像图，再通过计算机测算背膘厚度。

背膘厚是衡量猪生长性能的一个重要指标，背膘厚度过高或过低，对种猪生长性能和繁殖性能都产生较大影响；另外，背膘厚往往作为反映瘦肉率的间接指标，背膘越厚瘦肉率越低，反之越高。近年来由于消费水平的提高，消费者对高瘦肉率的不断追求，对猪薄背膘的选择被广泛应用于遗传改良。

然而，背膘厚属于中等遗传力的性状，传统的选育方法仅仅单纯的对表型进行选择如人为将背膘过厚的个体本身进行淘汰或者尽量不选择将其同胞和半同胞留种，实际效果不佳。分子标记辅助育种成为改良这一性状的不错选择。

目前，利用候选基因法和QTL定位两种方法已经确定了不少与背膘厚度相关的候选基因和QTL。候选基因有二酰基甘油转酰基酶(Diacyl Glycerol Acyl Transferase-1,DGAT1),脂肪肥胖相关基因(Fat-mass and Obesity-associated Gene,FTO),脂肪细胞分化和决定因子1(Adipocyte Determination and Differentiation factor-1,ADD1)等，QTL数量更是超过200个。但是，候选基因法的由于候选基因的选择具有一定的随机性，可能是主效基因，也可能是与实际QTL处于紧密连锁不平衡状态中间接对性状起作用的基因，这给家畜育种带来了部分风险，此外候选基因法的选择还具有群体异质性；而QTL定位获得的QTL遗传距离跨度很大，往往包含上百个基因，这极大地限制了QTL定位方法在家畜重要经济性状的遗传改良中的应用。如今，全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)已经逐步在复杂性状的遗传改良方面显示出独特的优势。如提高奶牛产奶量等。相对候选基因法和QTL定位，GWAS可以更准确的定位和识别新基因，且能直接运用到家畜动物的遗传改良中。

此外，不少研究均表明，背膘厚度与生长速度存在着负相关,因此背膘厚度的遗传规律改良对改善猪肉质性状和提高生产效率同样具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与猪背膘厚相关的SNP标记及其用途。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：

一方面，本发明提供了一种与种猪背膘厚相关的SNP标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是A或C，导致猪背膘厚的不同。

进一步地，所述SNP标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本2号染色体上第81306158个核苷酸位点A>C突变。。

所述分子标记的SNP位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为217的A217-C217的核苷酸突变；进一步地，所述的分子标记的SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列2号染色体上第81306158个核苷酸位点A>C突变。

另一方面，本发明还提供了一种用于鉴定上述影响猪背膘厚性状的分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物序列如SEQ ID NO：2所示；

反向引物序列如SEQ ID NO：3所示。

另一方面，本发明还提供了上述引物对在研究/检测/鉴定/调节/降低猪背膘厚或者是猪繁殖育种中的应用。进一步地，所述的繁殖育种为分子标记辅助育种。

另一方面，本发明还提供了一种检测猪背膘厚性状的方法，具体为，检测猪2号染色体上，SEQ ID NO:1所示序列中，M(即5’端第217位单核苷酸)标记的单核苷酸是A还是C，如果是C，则猪的背膘厚度较大，瘦肉率较低，如果是A，则猪的背膘厚度较小，瘦肉率较高。

另一方面，本发明还提供了一种筛选低猪背膘厚性状的猪品种的方法。具体为，检测猪2号染色体上猪SEQ ID NO:1所示序列中，M标记的单核苷酸是A还是C，淘汰C保留A。

作为本发明一种优选的实施方式，采用上述的引物对进行检测或筛选。

另一方面，本发明还提供了一种降低猪背膘厚对种猪的进行遗传改良的方法，具体为，检测猪2号染色体上，SEQ ID NO:1所示序列中，5’端第217位单核苷酸是A还是C(即M是A还是C)，淘汰C保留A。

或者，确定种猪核心群中种猪的上述的分子标记位点，并根据所述分子标记做出相应的选择对种猪的继代选育为国际猪参考基因组11.1版本2号染色体上第81306158bp处的AA型个体，淘汰该点的AC型和CC型个体。

上述方法具体包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示所述的引物对，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的上述所述的SNP标记的基因型，淘汰在位点为AC型和CC型的种猪个体，以逐代提高该位点的纯合基因AA型的频率，从而降低后代猪背膘厚。

需要说明的是，本发明中，所述的猪包括杜洛克及其合成系。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定与猪背膘厚相关的分子标记，提供一种用于鉴定影响猪背膘厚度性状的分子标记引物对，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪背膘厚遗传改良中，从而降低猪背膘厚，提高后代猪瘦肉率，提高企业利润，增强核心竞争力。

(2)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，能够降低猪背膘厚度的遗传进展，从而有效提高种猪育种的经济效益，其中，通过该分子标记，本发明将AC型和CC型个体全部选育成AA型个体，则猪背膘厚度可以降低4％。

附图说明

图1为美系杜洛克猪在2号染色体上关于背膘厚的全基因组关联分析(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2为不同基因型猪的背膘厚。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明的上述发明目的具体是这样实现的：

1.实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种美系杜洛克种2312头，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

2.表型数据采集

通过B超仪，测定每头猪达100kg体重时的背膘厚度作为背膘性状的表型值。

3.样本采集

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于75％乙醇中，置于-20℃冰箱保存备用。

4.猪全基因组50K SNP基因型检测

从上述资源群体中选取的2312头杜洛克种公猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μl已提取好的待测DNA样品与2μl Loading Buffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到32464个SNP的有效基因型数据。

5.全基因组关联(GWAS)分析

为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与有效总乳头数性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.54×10^-6，即0.05/32464(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为3.08×10^-5，即1/32464(有效SNP数量)。

GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在实验猪群中2号染色体中存在显著影响背膘厚的位点，最强关联的SNP为g.217A>C(P＝3.5E-8)。

6.不同基因型与背膘厚的关联性分析

根据表1可知，分子标记的SNP位点g.217A>C与背膘厚极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的背膘厚度，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而改善该群体背膘厚度，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，AA型比AC和CC型的背膘厚度小，说明纯合子CC对背膘厚度是最不利的。背膘是猪生产性能的重要指标，背膘薄说明猪的瘦肉率高，符合现代饮食需求。因此，淘汰CC基因型的猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC型和AC型的种猪，保留AA的种猪，以逐代提高该位点的等位基因A的频率。

表1分子标记的SNP位点g.217A>C与背膘厚的相关性

7.检测SNP标记的发明过程

(1)引物设计

含有与杜洛克背膘厚显著相关SNP位点的目的片段的扩增目的片段为2号染色体中的一段364bp的核苷酸序列，利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物，序列扩增的上下游引物序列为：

SEQ ID NO：2

上游引物：5’-TCTCACCCTATTTGGTCTAT-3’，

SEQ ID NO：3

下游引物：5’-GAAGGCCGTATCAGTTGT-3’；

(2)PCR扩增

10uL的反应体系中加入DNA模板1uL，双蒸水3.4uL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5uL，引物P001和P002各0.3ul。PCR反应条件为：94℃预变性2min后，94℃变性30s、55℃退火20s、72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。

(3)DNA序列测定

最后对PCR扩增后的产物进行测序，序列测定由华大科技公司完成，基因片段测序要求为双向测通，将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。

测序结果如下所示：

SEQ ID NO：1

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

8.分子标记的g.217A>C位点与背膘厚的效应分析

本发明提供一个能显著降低杜洛克种猪背膘厚度的SNP标记，使用该SNP进行标记辅助选择，能够极大地加快杜洛克猪在背膘选择上的育种进程。若本发明将影响猪背膘性状的分子标记的CC型个体全部选育成AA型个体，则每头猪100kg体重背膘可以降低0.44mm，在对生长速度和背膘厚性状表型相关分析结果显示,达100kg体重日龄与背膘厚呈正相关,达到极显著水平，也就是说，猪生长至100kg时日龄越小，背膘越薄，瘦肉率越高，这将极大的提升猪肉经济价值，为企业创造财富。本SNP标记个体中，通过优选美系杜洛克该SNP的优势等位基因(A)，可最终实现提高商品猪的经济效益，从而增加企业的收益。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第217个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的背膘性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种与杜洛克种猪背膘厚相关的SNP标记及其用途

<141> 2018-06-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 364

<212> DNA

<213> 猪(swine)

<400> 1

tctcacccta tttggtctat actttcccct cttgcactag cacccttctt gtaacttcca 60

tcaccagctc cctggtctgt ctccagtctt ggccacttca gactctgttt tggattcata 120

tgtctcagtg tcactgttcc cttctttccc caggctcatc cgcatctgtc ctccatccat 180

ttggctcctc aaggcagaat ctcagagaag cagcagmatc ctctctgctt tcactctcac 240

atcccaccgc atgaccaaga tttgttgact ttacccctaa ataggtacca aatctgaccc 300

tccctctcca tcccaatggt tcaggtaaca tttttctctc acctggacaa ctgatacggc 360

cttc 364

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctcacccta tttggtctat 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggccgta tcagttgt 18

Claims (5)

1.一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其序列中的M是A或C，导致猪背膘厚出现多态性。

2.一种检测杜洛克猪背膘厚的方法，其特征在于，检测杜洛克猪SEQ ID NO:1所示序列中，M标记的单核苷酸是A还是C，如果是C，则猪的背膘厚度较大，如果是A，则猪的背膘厚度较小。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行检测。

4.一种降低杜洛克猪背膘厚的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

检测杜洛克猪SEQ ID NO:1所示序列，选择SEQ ID NO:1所示序列中第217位核苷酸位点的AA型个体作为种猪。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法具体包括以下步骤：

(1)提取待测杜洛克猪的基因组DNA；

(2)采用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对，将所述待测杜洛克猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测杜洛克猪的如权利要求1所述的SNP分子标记的基因型，淘汰该位点的AC型和CC型个体，以逐代提高该位点的纯合基因型AA型的频率，从而降低后代的杜洛克猪背膘厚。