CN110438237B - 肉用西门塔尔牛6号染色体上与后腱子、和尚头重相关的snp位点及应用 - Google Patents

肉用西门塔尔牛6号染色体上与后腱子、和尚头重相关的snp位点及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了肉用西门塔尔牛6号染色体上与后腱子、和尚头重相关的SNP位点及应用，所述SNP标记的位点为国际牛参考基因组UMD3.1版本6号染色体上第38576012个核苷酸位点，该位点的碱基是A或G。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，同时提高肉用西门塔尔牛的后腱子、和尚头肉重，加快牛遗传改良进展从而有效提高肉牛育种的经济效益。

Description

肉用西门塔尔牛6号染色体上与后腱子、和尚头重相关的SNP 位点及应用
技术领域
本发明涉及肉用西门塔尔牛6号染色体上与后腱子、和尚头重相关的SNP位点及其用途。
背景技术
近年来，随着人民生活水平的提高，对高品质牛肉消费的需求也在快速增长。肉用西门塔尔牛作为中国主要的牛肉消费贡献群体，占中国肉牛存栏比例的50％以上。因此，提高肉用西门塔尔牛牛肉产量对满足国内牛肉消费市场的的需求具有重要意义。牛腱子肉，是牛大腿部的肌肉，包括前腱子和后腱子。因其硬度适中，纹路规则，是制作卤味佳品，饱受消费者喜爱。牛霖，是位于牛膝盖部位的嫩肉，自然形状为圆形，因此又被称为“和尚头”。腱子肉和“和尚头”因其独特的肉质特点，市场消费需求巨大，因此提高其产量不仅能满足人们的消费需求，更能为肉牛养殖带来巨大的经济效益。而腱子肉和“和尚头”重的表型不易直接观测，仅能在牛屠宰后进行称量，因此采用常规育种方法难以快速实现预期的育种目标。而利用分子生物学的方法，通过先找到同时影响肉牛腱子肉重和“和尚头”重的DNA分子标记，进而筛选优势等位基因用于性状改良，则有望提高二者的产量，从而提高牛肉的生长性能，加快目标性状的遗传改良进展。
过去，人们通过候选基因法(Candidate gene approach)和QTL定位(QTLMapping)进行QTL检测。候选基因法虽然具有方法简单、操作方便等优点，但只能针对生物学功能已知的基因；而QTL定位方法所鉴定的候选位置基因的置信区域同样较大，这极大地限制了复杂性状分子标记在家畜遗传育种中的应用。随着高通量测序技术的发展及全基因组芯片的出现，使得全基因组关联分析(Genome-wide Association Study，GWAS)在复杂性状遗传解析中效果显著，也打破了牛胴体相关性状分子标记鉴别的瓶颈。
发明内容
为了实现上述目标，本发明的首要目的在于提供牛6号染色体上与肉用西门塔尔牛后腱子、和尚头重相关的SNP位点，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是A或G，导致牛后腱子、和尚头重量的不同。
所述分子标记位于肉用西门塔尔牛的6号染色体上的核苷酸序列上，所述分子标记的SNP位点为SEQ IDNO：1序列标注位置为213位的A213-G213的核苷酸突变；所述的分子标记的SNP位点对应于国际牛基因组UMD3.1版本参考序列6号染色体上第38576012位A＞G突变。
本发明的另一目的在于提供上述的分子标记在筛选高后腱子、和尚头重的牛个体的方法，具体为，检测牛6号染色体上权利要求1所述的分子标记，所述分子标记的5’端第213位单核苷酸是A还是G，淘汰G保留A。具体体现在所述牛选自内蒙古锡林郭勒盟乌拉盖管理区牧场的肉用西门塔尔牛资源群体。
本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定上述影响牛后腱子、和尚头重的分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如下所示：
正向引物序列如SEQ ID NO：2所示；
反向引物序列如SEQ ID NO：3所示。
上述的引物对在鉴定影响牛后腱子、和尚头重中的应用。
上述的引物对在牛基因组选择中的应用。
上述的引物对在提高牛后腱子、和尚头重中的应用。
本发明的目的在于提供一种牛的遗传改良的方法，所述方法包括：确定种牛资源群体中的种牛的上述的影响牛后腱子、和尚头重的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种牛资源群体中选择国际牛参考基因组UMD3.1版本6号染色体上第38576012位点为AA和GA、GG基因型的种牛个体，淘汰在第38576012该位点为GG基因型的牛个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代牛的后腱子、和尚头重。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明研究并确定与牛后腱子、和尚头重相关的分子标记，验证其对后腱子、和尚头重的影响效应，最终建立高效准确的基因组选择育种技术，将其应用于种牛提高后腱子、和尚头重的遗传改良中，从而提高后代牛的后腱子、和尚头重，进而增加养殖企业市场竞争力。
附图说明
图1为肉用西门塔尔牛在6号染色体上关于后腱子、和尚头重的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示牛的染色体编号；纵坐标表示-logP值。(a)：后腱子；(b)：和尚头
图2为不同基因型肉用西门塔尔牛的后腱子、和尚头重。(a)：后腱子；(b)：和尚头
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的上述发明目的具体是这样实现的：
实施例1
1、实验动物
本发明所使用的实验牛群群体均来自内蒙古锡林郭勒盟乌拉盖管理区牧场中国肉用西门塔尔牛1224头，为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牛遗传育种创新团队组建的肉用西门塔尔牛资源群体。
本实验共选取该资源群体中1224头肉用西门塔尔牛。肉用西门塔尔牛资源群体每年进行扩群，新增个体一般经历出生、育肥和屠宰3个阶段。每年3-5月出生的犊牛经过一段时间的放养管理后，在同年7月份由牛遗传育种创新团队进行统一初生重和体尺测量，并同时对基础母牛进行测量。同年10月份将5～9月龄的青年牛进行统一集中育肥，并收集生长发育性状的表型数据，同时左右用于Illumina BovineHD芯片基因分型获得基因型数据。当所有个体育肥期达10-12个月时，即来年的11月份左右，对所有肉用西门塔尔牛进行分批屠宰。屠宰过程严格按照《肉类采购规范》执行，屠宰数据、胴体数据和肉质数据严格按照GB/T27643-2011《屠宰后胴体性状和肉质性状测定指南》的要求进行测定。
2、样本采集
用采血管收集上述牛群体所有个体静脉血50ml，置于-80℃冰箱保存备用。
3、牛全基因组770K高密度芯片SNP判型
从上述资源群体中选取的1224头肉用西门塔尔牛中的每个个体采集静脉血50ml，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μl已提取好的待测DNA样品与2μl Loading Buffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。
DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，根据公司标准流程进行牛全基因组Illumina BovineHD芯片770K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用PLINK v1.90软件对所有样本770K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，最终得到671,204个SNP的有效基因型数据。
4、全基因组关联(GWAS)分析
为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与后腱子、和尚头重关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为7.45e-8，即0.05/671,204(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为1.49e-6，即1/671,204(有效SNP数量)。
GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在肉用西门塔尔牛6号染色体中存在显著影响后腱子、和尚头重的位点，最强关联的SNP为g.213A＞G(P＝8.33E-11、P＝1.10E-11)。
5、不同基因型与后腱子、和尚头重表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的SNP位点g.213A＞G与后腱子重极显著相关(P＜0.001)，说明此分子标记显著影响牛的后腱子重，可以通过对牛的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的后腱子重，进而加快目标性状的育种进程。
根据表2可知，分子标记的SNP位点g.213A＞T与和尚头重极显著相关(P＜0.001)，说明此分子标记显著影响牛的和尚头重，可以通过对牛的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的和尚头重，进而加快目标性状的育种进程。
另外根据表1和表2可知，AA型、GA型比GG型的后腱子、和尚头重高，说明GG型牛个体对筛选后腱子、和尚头重高不利。因此，在育种过程中需要逐步淘汰GG型的种牛，优先保留AA、GA型的种牛，以逐代提高该位点的等位基因A的频率。
表1分子标记的SNP位点g.213A＞G与后腱子重的相关性
Figure BSA0000185129840000051
表2分子标记的SNP位点g.213A＞G与和尚头重的相关性
Figure BSA0000185129840000052
6、目的DNA序列扩增及测序
(1)引物设计
通过Ensembl网站(http：//asia.ensembl.org/index.html)下载牛的6号染色体上SEQ ID NO：1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。
设计的引物的DNA序列如下所示：
P001正向：5’-GCACAGAGGACAGTGAGGGA-3’，
P002反向：5’-TCCAGCCTATGAGTTGGCCA-3’；
(2)PCR扩增
10uL的反应体系中加入DNA模板1uL，双蒸水3.4uL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5uL，引物P001和P002各0.3ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
(3)DNA序列测定
DNA序列测序鉴定：在北京生工科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：
Figure BSA0000185129840000061
注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
7、分子标记的SNP位点g.213A＞G效应分析
通过对分子标记辅助选择，对群体内基因型为GG的牛进行淘汰，可以显著提高群体的后腱子、和尚头重，从而提高产肉率，为企业带来更多经济效益。
本发明通过对SEQ ID NO：1序列中的第213个碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与牛的后腱子、和尚头重之间的关联分析的应用，为牛的分子标记辅助选择及基因组选择提供了一个新的分子标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure ISA0000185129860000011

Claims (3)

1.肉用西门塔尔牛6号染色体上SNP标记在提高牛后腱子、和尚头重量中的应用，其特征在于，所述SNP标记的位点为国际牛参考基因组UMD3.1版本6号染色体上第38576012个核苷酸位点，该位点的碱基是A或G；所述SNP标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第213位碱基是A或G。
2.一种提高肉用西门塔尔牛后腱子、和尚头重的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：检测牛的国际参考基因组UMD3.1版本6号染色体上第38576012个核苷酸位点的基因型，选择第38576012个核苷酸位点的AA、GA型个体作为种牛。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测牛的国际牛参考基因组UMD3.1版本6号染色体上第38576012个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：(1)提取待测牛的基因组DNA；(2)采用如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的引物对，将所述待测牛的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；(4)基于所述测序结果，确定所述待测牛的如权利要求1所述的SNP标记的基因型。
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