CN112126690B

CN112126690B - 一种影响绵羊胸椎数性状的snp分子标记及应用

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Publication number: CN112126690B
Application number: CN202011080026.3A
Authority: CN
Inventors: 张慧; 王小鹏; 黄思秀; 蔡更元; 黄敏; 杨丽娟; 刘冰冰; 刘少娟; 郑素梅; 余志强; 李德森; 李桂新; 蒋勇闯
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2040-10-10
Also published as: CN112126690A

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记及应用。所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的SNP位点对应于国际绵羊基因组4.0版本参考序列7号染色体上第82509619位G>A突变。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高绵羊的产肉性能，加快绵羊遗传改良进展从而有效提高经济效益。

Description

一种影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记及应用。

背景技术

哺乳动物脊椎从前到后分为颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎等5个部分。大部分哺乳动物种内各部分胸骨数量固定。少部分哺乳动物物种内的胸腰椎总数存在一定范围的变异，如猪、牛、羊等。脊椎数与胴体重及胴体长显著相关，具有较高的遗传力，如在猪里遗传力为0.60～0.62。

绵羊是草原牧民的主要饲养家畜，又号称“草原五畜”之首。绵羊的羊肉及羊毛是主要的畜产品。对于肉用绵羊来说，个体的生长性能是重要的经济性状，直接关乎绵羊的产肉率及牧民的经济收入。在绵羊的群体当中，特别是含蒙古羊血统的群体中存在较高比例的多脊椎个体，是天然的脊椎数变异物种。胸椎数及其衍生的肋骨数与胴体重及胴体长显著相关，是重要经济性状。研究表明每增加1～2根胸椎骨，每只绵羊的净肉量将增加2～4kg。因此，对胸椎数性状的选育十分必要，以提高绵羊的产肉性能。

多脊椎绵羊对肉羊养殖产业的生产效益有着重要的影响，胸椎数是影响绵羊胴体长的主要因素之一。胸椎数增多可直接使胴体长增加，增加产肉性能。因此，绵羊多脊椎性状的选育对发展优质高产肉羊产业、实现牧民增收、推动牧区精准脱贫具有重要意义。在实际生产工作中，胸椎数和肋骨数难以活体测定，常规选育改良难度大、进展较慢，由于多脊椎个体对胴体长较长，育种工作者往往从表型上直接选择体长较长，体型较大的个体，通过这种选育方法，获得的选育群体内通常存在多胸椎或多腰椎，或胸腰椎均增加的个体，导致种群内个体胸腰椎组型较多，群体内多胸椎数个体比例较多脊椎比例较少，且未充分发挥绵羊的生产潜能。因此，采用遗传手段对绵羊种群胸椎数进行性状改良，则能加快目标性状的选育进展，进而提高经济效益，增强商品肉绵羊生产的竞争力。

胸椎数是典型的数量性状。目前国内外尚未鉴别影响胸椎数的分子标记。近年来，随着绵羊全基因组序列的公布和测序技术的提升，使得全基因组关联分析(Genomic-wideassociation study，GWAS)在鉴别影响复杂性状的分子标记和候选基因方面显示出强大的检测能力，并已广泛用到猪、牛及羊重要经济性状的遗传解析中。因此，采用GWAS分析策略可以鉴别到与绵羊胸椎数相关的分子标记，效应大的SNP可以运用到分子标记辅助选择和基因组选择中，从而加快绵羊胸椎数性状选育。此外，绵羊属于蒙古羊血统，而蒙古羊血统绵羊群体一般存在脊椎数的变异，鉴别绵羊影响胸椎数的分子标记对其他多脊椎绵羊群体的胸椎数选育提供了重要的参考价值。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记，该分子标记位于绵羊7号染色体上，与绵羊胸椎数性状相关。

本发明的另一目的在于提供上述影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述SNP分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种绵羊的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际绵羊基因组4.0版本参考序列7号染色体上第82509619位G>A突变；

所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是G或A，导致绵羊胸椎数的不同；

所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记位于绵羊的7号染色体上的核苷酸序列上，其SNP位点为SEQ ID NO：1序列标注位置为240位的G240-A240的核苷酸突变；

所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记在鉴定绵羊胸椎数性状和绵羊遗传育种中的应用；

一种筛选多胸椎数性状的绵羊品种的方法，包含如下步骤：

检测绵羊7号染色体上上述影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记，所述分子标记的5’端第240位单核苷酸是G还是A，淘汰G保留A；

所述绵羊优选为乌珠穆沁羊；

一种用于鉴定上述影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的引物对，包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’-TGCAATTGGCTGTTTGAGTC-3’；

P002-R：5’-ACTTGCATCCCTTCAGCAGT-3’；

所述的引物对在鉴定影响绵羊胸椎数性状中的应用；

所述的引物对在绵羊分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对在提高绵羊胸椎数中的应用；

一种绵羊的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种绵羊核心群中的种绵羊的上述影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种绵羊核心群中选择国际绵羊参考基因组4.0版本7号染色体上第82509619位点为AA基因型的种绵羊个体，淘汰在第82509619该位点为GA和GG基因型的种绵羊个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代绵羊的胸椎总数；

所述绵羊优选为乌珠穆沁羊；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记，验证其对胸椎总数性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种绵羊提高胸椎总数的遗传改良中，从而提高后代绵羊的繁殖性能，提高企业及农户利润，增加核心竞争力。

(2)本发明提供了一种用于鉴定上述影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的引物对，通过该引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对绵羊提高胸椎总数进行降低性选育改良，加快育种进程。

(3)本发明提了一种绵羊的遗传改良的方法，该方法通过优选上述SNP分子标记的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高绵羊的产肉性能，加快绵羊遗传改良进展从而有效提高经济效益。

附图说明

图1是绵羊在7号染色体上关于胸椎总数性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示绵羊的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型绵羊的胸椎总数比例的结果分析图；其中，6.6e-10、6.1e-4、0.45分别为两组基因型个体的表型差异的P值。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、实验动物

本发明所使用的实验绵羊群群体为选自内蒙古自治区东乌珠穆沁旗草原区的乌珠穆沁羊496头。

2、样本采集

收集上述屠宰后的绵羊的肌肉组织浸泡于体积分数为75％的乙醇中，置于-20℃冰箱保存备用。

3、绵羊全基因组10×重测序

利用步骤1中的496头绵羊中的每个个体采集的肌肉组织，采用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品。吸取3μL已提取好的待测DNA样品与1.5μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

DNA样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司，在Illumina平台上根据公司标准流程，利用双末端测序(Paired-End)的方法，进行绵羊全基因组10×深度测序。测序数据经BWA软件比对、GATK软件挖掘全基因组高密度SNP标记和短片段的插入/缺失突变(Indels)，所获得的SNP数量为37,160,280。

4、全基因组关联(GWAS)分析

分别采用PLINK和GEMMA两种软件包，利用上述所获得的全基因组高质量SNP集与胸椎数性状开展全基因组关联分析(GWAS)。采用Bonferrini法确定SNP与胸椎总数性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.35e-9，即0.05/37160280(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为3e-8，即1/37160280(有效SNP数量)。

GWAS分析结果如图1和图2所示。从图1和图2可知，在绵羊中，在7号染色体中存在显著影响胸椎总数的位点，最强关联的SNP为82509619G>A(SEQ NO.1中第240位核苷酸g.240位G>A)(P<5e-15)。

5、不同基因型与胸椎总数表型的关联性分析

根据表1和图1可知，分子标记的SNP位点82509619G>A与绵羊胸椎总数形状极显著相关(P<0.01)，说明此分子标记显著影响绵羊胸椎总数性状，可以通过对绵羊此SNP位点的辅助选择，提高该群体的胸椎总数，进而加快育种进程。

另外根据表1及图2可知，AA型比GA型和GG型的平均胸椎总数高，AA型较GA型、GG型显著，GA型与GG型不显著，说明AA对胸椎总数是有利的。胸椎总数直接关系多脊椎绵羊群体的胴体长进而影响个体的产肉性能。因此，淘汰GA及GG基因型的绵羊可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰GA及GG型的种绵羊，保留AA型种绵羊，以逐代提高AA型个体在群体所占比例。

表1分子标记的SNP位点82509619G>A与绵羊胸椎总数的相关性

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)下载绵羊的7号染色体上SEQ ID NO：1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 3.0设计引物。

设计的引物的DNA序列如下所示：

P001-F：5’-TGCAATTGGCTGTTTGAGTC-3’；

P002-R：5’-ACTTGCATCCCTTCAGCAGT-3’；

(2)PCR扩增

25μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水10.5μL，2×Dream Taq Green PCRMaster mix(Thermofisher)12.5μL，引物P001-F和P002-R各0.5μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在生工生物工程股份有限公司进行，基因片段测正向单个反应。将所测得的序列与UCSC基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

TGCAATTGGCTGTTTGAGTCTGGAGCTCAGGGAAGATGTCTGAACTGGAAGCTCTAGATGTTTGGTCATCAGAAGAAAGGCAGAATTTTAAGTCAGCAGATTGCAAGAGATCATCTAAGGAGTGAATGTAGATTGAAAGAAGAGGTCAGAGGACTGAGCTCGACGGGAATCCCACATTCAGTTGAGGAACCTGGAGAGGGAGAGGGAGAGCCAGCCACTGAGTTGGAGAAGGAGCAGGAM(G>A)GGAGGTAGAACCAGGTGAGCCTGGGGTCCTGGAAGCCAAGGAAAGCAAGCCCTTCCAGAAGCATGGCTGGACCAGCTGCATTGAATACTGCTGAAGGGATGCAAGT

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的SNP位点82509619G>A效应分析

通过对分子标记辅助选择，对群体内基因型为GA和GG的绵羊进行淘汰，我们显著提高了群体的总胸椎数，促进了绵羊的育种进程，增加绵羊群体的产肉性能，带动肉羊产业经济效益更大化。

本发明通过对SEQ ID NO：1序列中的第240个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与绵羊的总胸椎数性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

若本发明将影响绵羊胸椎数性状的分子标记的GG和GA型个体全部选育成AA型个体，则每头绵羊其胴体长可以提高1.41cm，由于胴体长和胴体重呈有利的正相关关系，育种工作者可以通过增加绵羊的胸椎数来提高胴体重。由此可见增加胸椎数为绵羊养殖产业提供收益的潜力是巨大的。本SNP分子标记个体中，通过优选绵羊的该SNP的优势等位基因(A)，可最终实现提高绵羊的经济效益，从而增加牧民或企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记及应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 346

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的核苷酸序列

<400> 1

tgcaattggc tgtttgagtc tggagctcag ggaagatgtc tgaactggaa gctctagatg 60

tttggtcatc agaagaaagg cagaatttta agtcagcaga ttgcaagaga tcatctaagg 120

agtgaatgta gattgaaaga agaggtcaga ggactgagct cgacgggaat cccacattca 180

gttgaggaac ctggagaggg agagggagag ccagccactg agttggagaa ggagcaggam 240

ggaggtagaa ccaggtgagc ctggggtcct ggaagccaag gaaagcaagc ccttccagaa 300

gcatggctgg accagctgca ttgaatactg ctgaagggat gcaagt 346

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P001-F

<400> 2

tgcaattggc tgtttgagtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P002-R

<400> 3

acttgcatcc cttcagcagt 20

Claims

1.一种影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记，其特征在于其SNP位点对应于国际绵羊基因组4.0版本参考序列7号染色体上第82509619位G>A突变；

所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是G或A，所述序列中的M对应所述SNP位点，导致绵羊胸椎数的不同；

所述的绵羊为乌珠穆沁羊。

2.权利要求1所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记在鉴定绵羊胸椎数性状和绵羊遗传育种中的应用，其特征在于：

所述的绵羊为乌珠穆沁羊；

所述的绵羊遗传育种为提高胸椎数或提高产肉性能的遗传育种。

3.一种筛选多胸椎数性状的绵羊品种的方法，其特征在于包含如下步骤：

检测绵羊7号染色体上权利要求1所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记，所述分子标记的5’端第240位单核苷酸是G还是A，淘汰G保留A；

所述的绵羊为乌珠穆沁羊。

4.一种用于鉴定权利要求1所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的引物对，其特征在于包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’- TGCAATTGGCTGTTTGAGTC -3’；

P002-R：5’- ACTTGCATCCCTTCAGCAGT -3’；

所述的绵羊为乌珠穆沁羊。

5.权利要求4所述的引物对在鉴定影响绵羊胸椎数性状中的应用，其特征在于：

所述的绵羊为乌珠穆沁羊。

6.权利要求4所述的引物对在绵羊分子标记辅助育种中的应用，其特征在于：

所述的绵羊为乌珠穆沁羊；

所述的绵羊分子标记辅助育种为提高胸椎数或提高产肉性能的分子标记辅助育种。

7.权利要求4所述的引物对在提高绵羊胸椎数中的应用，其特征在于：

所述的绵羊为乌珠穆沁羊。

8.一种绵羊的遗传改良的方法，其特征在于包含如下步骤：

确定种绵羊核心群中的种绵羊的权利要求1所述的影响绵羊胸椎数性状的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种绵羊核心群中选择国际绵羊参考基因组4.0版本7号染色体上第82509619位点为AA基因型的种绵羊个体，淘汰在第82509619该位点为GA和GG基因型的种绵羊个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代绵羊的胸椎总数；

所述的绵羊为乌珠穆沁羊。