CN117385061B - 一种与湖羊生长性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents
一种与湖羊生长性状相关的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物遗传学技术领域，具体提供一种与湖羊生长性状相关的分子标记及其应用。本发明发现8号染色体第15117681bp的碱基处存在的rs413863467 G>A突变位点与湖羊生长性状显著相关；进一步地，本发明提供与湖羊生长性状相关的分子标记及引物。基于本发明所提供的分子标记及引物组合，可以保留基因型为GG的个体，淘汰基因型为AA或GA的个体，来提高湖羊生长性能，改善湖羊的生长性状，有助于增加经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物遗传学技术领域，具体提供一种与湖羊生长性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
分子标记是畜禽遗传改良中应用最广泛、最有效的育种技术之一，具有不受外界环境影响、鉴别简单准确，可以缩短时间间隔，实现早期选育大幅度提高选择效率等优势。在家畜育种中，生长性状是畜禽最具价值的经济性状之一，通过候选基因确定遗传标记或单核苷酸多态性（SNP）与生长性状之间的关系具有重要研究意义，因此分子标记辅助选择技术被广泛用于家畜遗传改良，为改善绵羊中等遗传力的生长性状提供了快捷的方法。
湖羊是重要家畜之一，其祖先来自蒙古羊。湖羊是多胎绵羊品种，具有高繁早熟、常年发情、早期生长快、耐粗饲、环境适应性强等优良特性。
但湖羊生长速度参差不齐，想要提高湖羊生长速度究其根本要从基因组遗传物质中进行研究，挖掘与湖羊生长性状显著相关的分子标记，以期为湖羊的现代化科学选育提供资源依据。
TRDN基因在家畜生长发育中的作用机制尚不明确，现有研究中认为TRDN基因与西门塔尔牛的肉质性状和肌肉收缩有关，与猪最长背部肌肉的肌内脂肪沉积有关。TRDN基因与湖羊生长性状的相关性未见报道。
发明内容
本发明提供与湖羊生长性状相关的分子标记及其应用以解决现有技术中湖羊生长发育缓慢等问题，所提供的分子标记可以实现湖羊生长性状的早期选择，培育出高生长性能的品系，加快选育进展具有重要的经济应用价值。
第一方面，本发明提供与湖羊生长性状相关的分子标记，所述分子标记位于湖羊第8号染色体第15117681bp位点的碱基处，碱基突变为G或A。
本发明首次发现8号染色体第15117681bp的碱基处存在rs413863467 G>A突变位点与湖羊生长性状显著相关，碱基突变位点的基因型包括GG、GA或AA，本发明所用湖羊基因组版本为ARS-UI_Ramb_v2.0。
更具体地，本发明提供的分子标记为SEQ ID NO.4片段第501位上的G>A。
第二方面，本发明提供扩增上述的分子标记的引物组合，所述引物组合的序列如SEQ ID NO .1-3所示。包括正向引物F、反向引物R和延伸引物C，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，延伸引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
正向引物F为：5´-ACGTTGGATGTAGCTCATCACTTACTAGTC-3´（SEQ ID NO.1）；
反向引物R为：5´-ACGTTGGATGTTTACTTCCCTAGGCATGGC3´（SEQ ID NO.2）；
延伸引物C为：5´-GCCCTCCTCCTGGCA-3´（SEQ ID NO.3）。
第三方面，本发明提供辅助鉴定湖羊生长性状的试剂盒，含有上述引物组合。
第四方面，本发明提供上述分子标记或上述引物组合或上述试剂盒在以下的应用：
（1）湖羊生长性状检测；
（2）湖羊生长性状选育；
（3）湖羊生长性状遗传改良。
在本发明所提供的应用中，利用上述的引物组合或上述的试剂盒对湖羊的基因组DNA进行检测，获得扩增产物，基于所述扩增产物对所述分子标记进行分型鉴定。
在本发明所提供的应用中，所述分型鉴定包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。
第五方面，本发明提供一种湖羊生长性状选育方法，包括：
以湖羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的引物组合进行PCR扩增和延伸，获得上述分子标记rs413863467的基因型。
在本发明提供湖羊生长性状选育方法中，保留基因型为GG的个体，淘汰基因型为AA或GA的个体，来提高湖羊生长性能。
第六方面，本发明提供一种湖羊生长性状遗传改良的方法，以湖羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的引物组合进行PCR扩增，获得上述分子标记rs413863467的基因型，保留基因型为GG的湖羊个体，淘汰基因型为AA或GA的湖羊个体进行湖羊繁殖选育。
本发明所提供的分子标记rs413863467与湖羊生长性状管围和腰角宽显著相关，因此，本发明提供提高湖羊断奶重、2月龄体重、5-6月龄体重以及管围或腰角宽等的方法，以湖羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ IDNO.3所示的引物组合进行PCR扩增，获得上述分子标记rs413863467的基因型，保留基因型为GG的湖羊个体进行育种或饲喂。
本发明的有益效果在于：
本发明通过分析湖羊TRDN基因，发现一个与湖羊生长性状相关联的SNP位点，即基因组8号染色体上TRDN基因中第15117681bp位点的碱基处出现点突变，SNP突变位点rs413863467 G>A，通过检测384只湖羊多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与湖羊生长性状相关的分子标记，为快速生长型湖羊的选育提供有效的检测手段，以提高湖羊的生长性状，有助于提高湖羊养殖业的经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例。
图1为本发明中湖羊rs413863467突变位点MassArray SNP分型结果；图中，Other为No Call；G代表基因型GG；GA代表基因型GA；A代表基因型AA。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例中384只湖羊生长性状数据均在甘肃中盛华美羊产业发展有限公司测定收集。湖羊生长性状包括初生重、断奶重、2月龄体重、3月龄至6月龄体重、体高、体长、胸围、管围、胸宽、胸深、腰角宽、十字部高、背膘厚、眼肌面积。
实施例1
1、引物序列设计
针对SEQ ID NO.4中所示的G/A多态性位点设计MassArray引物组合，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计的MassArray引物组合的核苷酸序列为：
用于检测突变位点的正向引物F如SEQ ID NO.1所示：
5’-ACGTTGGATGTAGCTCATCACTTACTAGTC-3’；
用于检测突变位点的反向引物R如SEQ ID NO.2所示：
5’-ACGTTGGATGTTTACTTCCCTAGGCATGGC3’；
用于检测突变位点的延伸引物C如SEQ ID NO.3所示：5’-GCCCTCCTCCTGGCA-3’。以上引物委托博淼生物科技（北京）有限公司完成。
2、DNA质控
对湖羊的全血进行基因组DNA的提取，可采用DNA提取试剂盒进行。对所有DNA样本使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测，1.25%琼脂糖凝胶电泳检测，进行质检评估，符合Massarray SNP分型DNA质量要求要达到的标准有：（1）DNA电泳结果条带单一，gDNA完整无严重降解。（2）OD260/280值介于1.8-2.0之间，OD260/230值介于1.8-2.0之间。
3、基因分型检测
首先制备4 μL PCR master mix置于1.5 mL EP管中，其中包括Water 1.850 μL，PCR Buffer 0.625 μL，MgCl20.325 μL，dNTP Mix 0.100 μL，Primer Mix 1.000 μL，HotStar Taq 0.100 μL。向384孔板的每个孔中加入4 μL PCR master mix，再加入1 μL模板DNA，用384孔封板膜压紧混匀，1000 rpm离心1 min。
将上述反应板置于PCR仪上，根据以下PCR扩增反应程序进行反应：
94℃预变性，5分钟；
94℃，20秒（变性），56℃，30秒（退火），72℃，1分钟（延伸），共45个循环。
72℃，3分钟（延伸），4℃，∞。
在PCR反应结束后，对PCR产物进行虾碱性磷酸酶（SAP)反应，以去除体系中游离的dNTPs。在新1.5ml EP管中配制碱性磷酸酶处理反应液，其中包括：Water 1.53 μl，SAPBuffer 0.17 μl，SAP Enzyme 0.30 μl。将SAP mix加入384孔PCR反应板，其中每个孔中PCR产物5 μl，SAP mix 2 μl，封膜离心。设置SAP反应程序：37℃ 20 min； 85℃ 5 min ；4℃∞。
之后在ddNTP体系中进行单碱基延伸反应，形成与待检测SNP基因型互补的单碱基延伸产物，经树脂纯化后、上机点样后使用MALDI-TOF质谱仪分析。检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图。靠近纵轴的三角代表AA基因型，中间正方形代表GA基因型，靠近横轴的三角代表GG基因型，见图1，其中横坐标为低分子量高度(Low MassHeight)，纵坐标为高分子量高度(High Mass Height)。
结果发现，GG基因型64例，GA基因型159例，AA基因型143例，基因缺失（No Call）18例。
实施例2 分子标记在湖羊生长性状关联分析中的应用
本实施例将384只湖羊在相同实验条件下饲养。记录湖羊初生至6月龄的生长性状数据。
采用实施例1建立的质谱分型技术进行基因分型，采用SPSS 26.0统计软件中的一般线性模型GLM进行统计分析。所采用模型为：Yijkl=μ+Gi+Dj+Yk+Sl+eijkl，其中Yijkl表示性状测定值，μ代表群体均值，Gi为基因型效应，Dj为日龄效应，Yk为出生年份效应，Sl为季节效应，eijkl为随机残差。结果以最小二乘均值±标准误表示，P<0.05判定为差异显著；P<0.01判定为差异极显著。统计结果见表1、表2和表3。
表1 SNP位点与湖羊初生-2月龄体重关联结果
表1注：同列肩标不同小写字母表示数据之间差异显著，P<0.05；同列肩标字母相同或无字母表示数据之间差异不显著，P>0.05。
表2 SNP位点与湖羊3月龄和4月龄体重体尺关联结果
表3 SNP位点与湖羊5月龄和6月龄体重体尺关联结果
关联结果显示，携带GG基因型湖羊的断奶重和2月龄体重、4月龄管围、5月龄体重、6月龄体重、胸围、管围和胸宽优于携带AA基因型的湖羊（P<0.05）。携带GG基因型湖羊的5月龄管围、腰角宽、6月龄眼肌面积优于携带GA和AA基因型（P<0.05）。因此G等位基因为该位点的优势等位基因，选择GG基因型进行选种，并与其他羊进行杂交。尤其是采用GG基因型种公羊精液进行人工授精，可以极大提升繁育效率，得到生长发育速度快的群体。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.一种检测分子标记的引物组合或试剂盒在以下的应用：
（1）湖羊生长性状检测；
（2）湖羊生长性状选育；
（3）湖羊生长性状遗传改良；
所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述分子标记位于湖羊第8号染色体第15117681bp位点的碱基处，碱基突变为G或A；
所述引物组合的序列如SEQ ID NO.1-3所示；
所述试剂盒包含所述引物组合；
所述生长性状包括体重和体尺性状。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用所述的引物组合或所述的试剂盒对湖羊的基因组DNA进行检测，获得扩增产物，基于所述扩增产物对所述分子标记进行分型鉴定。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分型鉴定包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。
4.一种湖羊生长性状选育方法，其特征在于，包括：
以湖羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQID NO.3所示的引物组合进行PCR扩增和延伸，获得分子标记的基因型；
所述分子标记位于湖羊第8号染色体第15117681bp位点的碱基处，碱基突变为G或A；
所述生长性状包括体重和体尺性状。
5.根据权利要求4所述的湖羊生长性状选育方法，其特征在于，保留基因型为GG的个体，淘汰基因型为AA或GA的个体，来提高湖羊生长性能。
6.一种湖羊生长性状遗传改良的方法，其特征在于，以湖羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的引物组合进行PCR扩增，获得分子标记的基因型，保留基因型为GG的湖羊个体，淘汰基因型为AA或GA的湖羊个体进行湖羊繁殖选育；
所述分子标记位于湖羊第8号染色体第15117681bp位点的碱基处，碱基突变为G或A；
所述生长性状包括体重和体尺性状。
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