CN108410994A - 一种影响湖羊产羔性状的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，涉及一种羊SNP分子标记在羊产羔性状研究和羊育种中的应用。所述的羊SNP分子标记位点如SEQ ID NO.1所示，位于该序列片段的第193位核酸单碱基突变，命名为：G765A。该SNP分子标记对应于GeneBank上已经发布的绵羊6号染色体上BMPR‑IB基因(登录号：NC_019463.2)的编码区序列的第765bp处的G>A突变。本发明通过优选该SNP分子标记的优势等位基因型，能够加快湖羊产羔性状的遗传进展，缩短湖羊的繁殖性状的育种时间，从而降低繁殖成本，有效地提高肉羊养殖业的经济效益。

Description

一种影响湖羊产羔性状的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别涉及到一种湖羊SNP分子标记在羊产羔性状研究和羊育种中的应用。

背景技术

对于种畜而言，繁殖力就是生产力，繁殖性能直接关系到肉羊产业的经济效应。繁殖性能主要包括总产羔数、产活羔数、初生重、初生窝重、断奶窝重等指标。产羔率低是制约优质高效养羊业发展的主要瓶颈，采取常规的育种方法，很难迅速地改善肉羊群体的繁殖性能，而从遗传本质上研究提高产羔率的育种方法是国内外养羊科技工作者努力寻求破解的技术难题。以分子标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)为核心的育种技术能直接在分子水平上对产羔性状的基因型进行选择，从而克服了常规育种耗时长，效果差的缺点，可快速提高育种效率。MAS方法可用于提高抗病能力(如抗痢疾)和改善肉质(如大理石纹)等活体很难度量或活体测量花销很大(如体尺、日增重)的性状，以及繁殖(如产羔数)等在生命活动中表达相对较晚的限性性状。而MAS能对这些性状进行早期选择，从而能起到缩短世代间隔、加快育种进度的目的。因此，如能利用MAS技术改良种羊的产羔性状，将具备较广阔的应用前景。可见，寻找与产羔性状紧密连锁的分子辅助标记基因，筛选调控产羔性状的功能基因，是实现现代分子育种技术与常规育种技术有机结合，提高繁殖效率的有益手段。但找到与这些数量性状基因座相关联的分子遗传标记，是实现MAS的先决条件。

湖羊是世界著名的多胎绵羊品种，也是我国一级保护地方畜禽品种。湖羊为稀有白色羔皮羊品种，以早熟、繁殖力高、泌乳性能好、生长发育快、产肉性能好、耐高温高湿等优点著称。因此，对湖羊的产羔性状进行改良，可以有效地缩短肉羊的育种进程，快速选育出高繁的种母羊，从而扩大养殖的经济效益。

专利CN105950638A中公开了绵羊(湖羊和小尾寒羊)的TrkA基因片段的432位发生等位基因突变，影响绵羊的产羔数量。该SNP标记位点可以用于绵羊产羔数的分子标记辅助育种。专利CN104099330A中公开了绵羊(品种包含杜泊和湖羊)LHβ基因片段的713位发生等位基因突变，影响绵阳的产羔数量。

但是，目前分子育种中还存在一些问题，主要有：标记遗传图谱的局限性；与育种目标性状连锁分子标记的多态性频率较低；在DNA提取、定量和PCR扩增以及数据处理等方面的自动化程度较低，所需仪器设备及试剂价格昂贵。而在基因定位中，由于现用定位材料的局限性，常常存在定位不准确的问题，而且在数量性状基因座QTL定位的技术中，并不是所有的目标QTL都可以被检测出来，且QTL与环境存在互作、以及大效应的QTL对小效应的QTL的掩盖等问题。此外，本研究中所采用的RFLP标记方法也存在DNA需要量大、检测技术繁杂以及难以应用于大规模的育种实践中等技术缺陷。而这些因素都增加了寻找一个新的SNP分子标记的难度。

此外，某些现有的产羔性状的分子标记，其等位基因中不同的基因型，产羔数量差异不是特别显著，对于产羔数量的提升不是特别理想。如专利CN104099330A中公开的绵羊LHβ基因片段的713位发生的C/T等位基因突变，其优势等位基因型CC较杂合型TC的产羔数仅增加了0.15只。又如发明人在先研究湖羊的SNP分子标记，优势等位基因型CC比TC型的产羔数也仅多了0.27只。因此，寻找新的、且差异显著的羊产羔性状的SNP分子标记，具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术对产羔性状遗传选育的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种SNP分子标记在羊产羔性状研究和羊繁殖育种中的应用，尤其是在湖羊产羔性状研究和羊繁殖育种中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案得以实现：

一方面，本发明提供了一种影响羊产羔性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点如SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M是G或A，其差异导致了羊产羔性状的不同。该SNP分子标记位点对应于GeneBank上已经发布的绵羊6号染色体上BMPR-IB基因(登录号：NC_019463.2)的编码区序列的第765bp(以编码区序列的第一位碱基为+1位计算)处的G>A突变。

另一方面，本发明还提供了用于鉴定上述羊SNP分子标记的引物，其含有如下所示的核酸序列：

SEQ ID NO：2

上游引物PCR-F：5'-GTCTGCTGTATTGGCACACACAT-3'；

SEQ ID NO：3

下游引物PCR-R：5'-ACCATCTGAATTTGCTTTGCAAT-3'。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如SEQ ID NO：2(上游引物)和SEQ ID NO：3(下游引物)所示的引物对。

另一方面，本发明还提供了上述的SNP分子标记、以及引物对，以及试剂盒在研究/鉴定/检测/调节的羊产羔数性状，或者是羊繁殖育种中的应用。

进一步地，所述的繁殖育种优选为分子标记辅助选择；

另一方面，本发明还提供了一种检测羊产羔性状的方法，其包含如下步骤：检测羊6号染色体上SEQ ID NO:1所示序列中，M标记的单核苷酸是G还是A。

作为一种优选的实施方式，采用上述的引物对或试剂盒进行检测。

另一方面，本发明还提供了一种羊的遗传育种改良的方法，包含以下步骤：

确定羊核心群中种羊的上述SNP分子标记，并根据羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育参照GeneBank中6号染色体上BMPR-IB基因编码序列的765bp处的GG型和AA型个体，淘汰该位点的杂合GA型个体；以逐代提高该位点的纯合基因型，从而提高后代羊的产羔性能。

作为本发明一种优选的实施方式，采用上述的引物对或试剂盒进行确定羊核心群中种羊的SNP分子标记。

本发明中的，所述羊为绵羊；作为优选的实施方式，所述的羊为湖羊。在湖羊以外的川中黑山羊、东山羊、努比亚黑山羊以及重庆黑山羊4个山羊品种中，均未发现该SNP分子标记位点。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响产羔数相关的分子标记，使用该分子标记进行标记辅助选择，能够极大地增加湖羊的产羔数，加快育种进程。

(2)本发明提供一种用于鉴定影响羊产羔性状分子标记的引物对，通过该分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助选择育种技术，将其应用于羊繁殖性状的遗传改良中，从而提高羊的产羔数，挖掘羊的繁殖潜力，进而提高企业肉羊养殖的经济效益，增加其核心竞争力。

(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，能够增加湖羊产羔性状的遗传进展，减少湖羊繁殖性状的育种时间，从而有效提高种羊育种的经济效益，其中，通过该分子标记，本发明将GA型个体全部选育成GG型或AA型纯合个体，则每只羊平均产羔数可以分别增加0.38只和0.39只，相比于发明人在先研究湖羊的SNP分子标记，其优势等位基因型CC比TC型的产羔数仅多了0.27只，本发明的分子标记具有显著的差异，由此可见，优良的繁殖性能在养羊产业中发挥着巨大的收益潜力。

附图说明

图1是所述SNP分子标记G765A位点的PCR扩增产物凝胶电泳图。

图2是所述SNP分子标记G765A位点的PCR-RFLP凝胶电泳图(基因分型结果)。

图3是湖羊突变纯合型AA基因型的测序结果图。

图4是湖羊野生纯合型GG基因型的测序结果图。

图5是湖羊突变杂合型GA基因型的测序结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

实施例中，选取有完整产羔记录的湖羊母羊811只，颈静脉抽血2mL并做抗凝处理，于-20℃保存备用。本研究所使用的湖羊均来自广东省云浮市新兴县温氏新旺羊业有限公司的良洞种羊场，该场全年实行高床舍饲饲养，按统一饲养标准饲喂日粮，自由采食饮水。

(1)湖羊血液基因组DNA的抽提是参照血液基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)，以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，无弥散或拖尾现象；并用紫外分光光度计对抽提的DNA进行质量检测和浓度测定。将A260/280比值在1.8～2.0，A260/230比值在1.7～1.9的DNA样判为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释成50ng/μL，并于-20℃冰箱内进行低温保存。

(2)DNA pool测序：分别抽取20个和50个不同湖羊个体的DNA样品，按等量混合的原则做成两个DNA池，并以此为模板进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。利用DNAMAN软件对测序结果进行序列整理并与NCBI上基因组序列进行比对，发现在该扩增序列的第193bp处存在G→A的突变，即为所述SNP位点，如图1所示。

(3)湖羊PCR-RFLP基因型检测：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术是在PCR技术的基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶的识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常PCR产物进行比较来确定是否变异。

(4)引物诱导酶切分析技术(CRS-PCR-RFLP)：CRS-PCR-RFLP方法是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中1条引物根据突变位点临近序列设计，人为引入错配碱基，使得引物3’端和单碱基突变的1种突变型在PCR扩增后形成1个酶切位点，然后应用相应的内切酶进行酶切鉴定。该方法可用于内切酶价格昂贵或者无内切酶识别的情况。本研究通过在下游引物中引入错配碱基(如SEQ ID NO.1序列中标记下划线的碱基)，形成MunI(C↓AATTG)酶切识别位点。

本研究以湖羊血液基因组DNA为模板，PCR扩增BMPR-IB基因外显子8的216bp特异性片段产物，通过在线软件NEBcutter V2.0(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)和PrimerPremier 5.0软件对酶切位点进行分析，运用引物诱导酶切分析技术使该特异性片段产物含有MunI限制性内切酶多态位点，经MunI酶切后，以3％的琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度(216bp、216bp+192bp或216bp+192bp+24bp，如图1)，并以此为遗传标记进行相关联分析，从而判断此分子标记是否影响湖羊的产羔数。

(5)统计分析：数据采用SPSS 20.0统计分析软件中的GLM(General LinearModel)程序配合构建的单位点效应模型对所述分子标记位点进行统计分析，采用LSD和Dunnett’sT3法进行均数间的多重比较，研究胎次和基因型对多胎性状(产羔数)的影响，统计分析所用的线性模型如下：

y_jkl＝μ+P_j+G_k+e_jkl

其中：y_jkl为个体产羔数记录值；μ为群体平均值；P_j为第j个胎次的固定效应；G_k为第k种基因型的固定效应；e_jkl为随机残差效应。所有数据均用平均值±标准差(Mean±SD)的形式呈现。

(6)不同基因型与产羔数表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的SNP位点G765A与产羔性状显著相关(P<0.05)，说明此分子标记显著影响湖羊的繁殖性状，可以通过对湖羊的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体产羔数，进而加快育种进程。另外根据表1可知，在胎次1中AA型和GG型的产羔数分别比突变杂合GA型多0.39只和0.35只；在胎次2和胎次3中的纯合型产羔数与杂合型产羔数差异不显著(p>0.05)，但较之突变杂合型，纯合型的母羊均有更高的产羔数；就羊群的整体平均产羔数而言，AA型和GG型的平均产羔数分别比GA型多0.38只和0.39只，说明较杂合子而言，纯合子AA和GG对提高湖羊的产羔数是有利的。产羔数是繁殖性状的重要指标，产羔数越高说明种羊的繁殖成本越低，经济效益越显著。因此，AA和GG基因型的羊的繁殖性能是较好的，我们在进行育种的过程中可以予以保留，以逐代提高该位点的纯合基因型。

表1 G765A位点的不同基因型与湖羊产羔数的关联性分析

注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

实施例2

(1)含有与湖羊产羔性状显著相关SNP位点的目的片段的扩增：目的片段为6号染色体上一段261bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物是根据GenBank上报道的绵羊BMPR-IB基因序列(登录号为：NC-019463.2)，利用Primer Premier 5.0软件对BMPR-IB基因的外显子8进行引物设计，扩增绵羊BMPR-IB基因的部分序列。引物由华大生物科技有限公司合成，具体序列如下：

SEQ ID NO.2

上游引物PCR-F：5'-GTCTGCTGTATTGGCACACACAT-3'；

SEQ ID NO.3

下游引物PCR-R：5'-ACCATCTGAATTTGCTTTGCAT-3'。

(2)PCR扩增体系和程序设置

PCR反应体系：10μL体系中含基因组DNA模板1μL，上、下游引物各0.2μL，5μLTaqDNA聚合酶，以去离子双蒸水补充至终体积。

PCR反应程序：94℃预变性2min，35个循环(94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃后延伸5min，4℃保存。

(3)PCR-RFLP基因分型

PCR反应结束后即进行分子标记G765A位点扩增产物的酶切。酶切体系：15μL体系中含10×buffer 1μL，双蒸水8.5μL，限制性内切酶MunI(10U/μL)0.5μL，PCR反应产物5μL，震荡混匀，37℃水浴30min。酶切产物使用3％的琼脂糖凝胶电泳分型。

(3)不同基因型测序结果判定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段进行正反两个方向的测序。将分子标记G765A位点的三种不同基因型的PCR产物送测，结果如图3和图4所示。

测序结果如下SEQ ID NO.1所示：

注：序列表中标注的M为突变位点(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示的为引物序列，在下游引物序列中用下划线标记的碱基是通过引物诱导酶切分析技术引入的错配碱基。

实施例3分子标记的SNP位点G765A效应分析

本发明提供一个能显著增加湖羊产羔数的SNP标记，使用该SNP进行标记辅助选择，能够极大地增加湖羊繁殖性能的育种进程。

本发明中影响羊产羔数的分子标记SNP位点全部选育成AA型或GG型个体，则每只种母羊的平均产羔数可以分别增加0.38只和0.39只，由此可见繁殖性能高的种母羊的选育，对降低繁殖成本，提高养羊业经济效益及促进我国肉羊产业的快速发展具有重要的意义。本SNP标记的个体中，AA型和GG型个体与GA型个体之间的产羔数存在显著差异(P<0.05)，通过优选湖羊该SNP位点的优势等位基因型AA和GG，可最终实现提高养殖效益的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、简化、组合、修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种影响湖羊产羔性状的SNP 标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 216

<212> DNA

<213> 湖羊(hu sheep)

<400> 1

gtctgctgta ttggcacaca cattctttac cactagcgcc acctcggaaa cccatataaa 60

gaaaaactac tggctaaata tattttacat gcagttgttt tcttctctga aggaaaaaag 120

aaaacattaa acaatctgta gtgccgtgaa cgcactaaca gtgtgttggg ggatttaaca 180

ggtccagagg acmatagcaa agcaaattca gatggt 216

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctgctgta ttggcacaca cat 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accatctgaa tttgctttgc aat 23

Claims (10)

1.一种影响羊产羔性状的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其序列中的M是G或A，导致羊产羔数量出现多态性。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP分子标记的位点对应于GeneBank上绵羊6号染色体上BMPR-IB基因的编码区序列的第765bp处的T>C突变。

3.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对的核酸序列如下所示：

上游引物如SEQ ID NO：2所示；

下游引物如SEQ ID NO：3所示。

4.一种试剂盒，其特征在于含有权利要求3所述的引物对。

5.权利要求1-4所述的SNP分子标记/引物对/试剂盒在羊产羔性状检测或羊育种中的应用。

6.一种检测羊产羔性状的方法，其特征在于，检测羊的SEQ ID NO:1所示序列中，M标记的单核苷酸是C还是T。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒进行检测。

8.一种羊的遗传改良方法，其特征在于,确定羊核心群中种羊的如权利要求1中所述的SNP分子标记，并根据羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育参照GeneBank中绵羊6号染色体上BMPR-IB基因编码序列的765处的AA型和GG型个体，淘汰该位点的GA型个体，以逐代提高该位点的纯合基因型AA型和GG型的频率，从而提高后代羊的产羔性能。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒对进行确定羊核心群中种羊的SNP分子标记。

10.根据权利要求1-2、5-9任一所述的分子标记或方法，其特征在于，所述的羊为绵羊；优选地，所述的绵羊为湖羊。