CN104774836A - 一种提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家畜分子育种领域，涉及一种提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种的方法。从FecB、BMP15和FSHR基因中克隆得到三个关联的基因片段，它们的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-3所述。在SEQ ID NO：1的第111bp处有1个A111-G111的碱基替换，导致Ava Ⅱ-RFLP酶切多态性；在SEQ ID NO：2的第35bp处有1个C35-T35的碱基替换，导致Hinf Ⅰ-RFLP酶切多态性；在SEQ ID NO：3的88bp处有1个C88-T88的碱基替换，导致BsiE Ⅰ-RFLP酶切多态性。所述分子标记组合可显著提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种效率。
Description
技术领域
本发明属于绵羊分子育种技术领域，具体涉及一种提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种的方法，本发明通过克隆得到与绵羊产羔数性状相关的分子标记。通过将所述的分子标记组合使用提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种中的应用。所述的分子标记从FecB、BMP15和FSHR基因中克隆得到。
背景技术
根据FAO(2012)的统计数据，我国现有绵羊1.87亿只，占世界饲养量(11.69亿只)的16％，居世界首位(http://www.fao.org/home/en/)，是最大的羊肉生产和消费国。但我国养羊业整体生产水平与国外发达国家仍有一定的差距。自1970年以来，养羊业发达国家逐步建立和形成了较为完善的肉羊繁育体系，在广泛应用经济杂交的基础上培育专门化早熟肉用和适于羔羊肉生产的新品种，具有产羔率较高、泌乳性能好、羔羊生长发育快、肉用性能好、饲料报酬高等优点。我国肉羊育种工作落后于发达国家，与生产的实际需求差距巨大。主要用引入品种与本地品种杂交进行杂交育种，选育的技术和方法不先进，尚未培育出拥有自主知识产权的优质肉羊品种。
绵羊的群体遗传改良对保障羊肉供给，促进国民经济发展和提高人们生活水平具有重要意义。绵羊的繁殖性状，尤其产羔数是现代养羊生产中最重要的经济性状之一。而我国绵羊群体的繁殖性能总体仍然比较低，在舍饲养羊比重不断增大的大背景下，繁殖性能和产肉性能的遗传改良是当前乃至今后一段时间内我国绵羊群体遗传改良的重点，而繁殖性能遗传改良的重点应放在产羔数性状上。繁殖性状属阈性状，是一种低遗传力(平均0.1)的性状，并且在不同环境和不同饲养条件下产羔数也受到一定影响，因此常规育种方法遗传改良进展缓慢，亟需人们加深对繁殖性状遗传机制的了解，以促进绵羊繁殖性状的遗传改良。随着现代分子生物技术的发展，分子标记已在绵羊生产中广泛应用，并取得了一定成绩。然而繁殖性状受微效多基因控制，而且为加性-显性基因作用模式，单分子标记的选择并不能充分挖掘高繁殖力个体的遗传潜能，同时也会影响选种的准确性。多基因聚合育种技术可将对目标性状的多个有利基因型聚合到同一个基因组中，其技术优势在于可提高选择的准确性，加大选择强度，培育出目标性状突出、育种应用价值高的优势种群。
对于绵羊繁殖性状候选基因的研究，最早且作用机制相对最清楚的是FecB基因，它是于1980年由Davis在Booroola绵羊的常染色体上发现的，具有提高排卵率和产羔数等生物学作用(Davis GH等，Segregation of a major gene influencing fecundity in progeny of Booroola sheep.NZJ Agric Res,1982,25:525-529；C.J.H.Souza等，Secretion of Inhibin A and Follicular Dynamics throughout the Estrous Cycle in theSheep with and without the Booroola Gene(FecB).Endocrinology,1997,138(12):5333-5340)。之后，Mulsant等和Wilson等几乎同时报道了将FecB基因定位于绵羊6号染色体6q23-31，并发现该基因是由于BMPR-IB基因高度保守的胞内激酶信号区域一个突变(Q249R)的结果(Wilson T等，Highly prolific Booroola sheephave a mutation in the intracellular(ALK-6)that is expressed in both oocyte sand granulosa cells.Biol Reprod,2001,1225-1235；Mulsant P等，Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increasedovulation rate in Booroola Merino ewes.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:5104-5109)。Souza等将Booroola羊与普通绵羊的cDNA进行比对时发现830bp处有一个A>C突变，使BMPR-IB的胞内信号区第249位氨基酸由Glu变成Arg(Q249R)，从而导致Booroola母羊出现超多产羔数基因型(Souza C J等，The Booroola(FecB)Phenotype is assoeiated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type IB(BMPR-IB)gene.JEndoerinol,2001,169(2):1-6)。
绵羊骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP15)基因是影响产羔数的主效基因之一(Galloway S M等，Mutations in an oocyte-derived growth factor gene(BMP15)cause increased ovulation rateand infertility in a dosage-sensitive manner.Nat Genet,2000,25(3):279-283)。该基因BMP15基因有2个外显子和1个内含子，外显子1长324bp，外显子2长855bp，中间隔着5400bp的内含子，编码393个氨基酸残基前蛋白，其成熟活性肽为125个氨基酸(Hanrahan J P等，Mutations in the genes for oocyte-derived growthfactors GDF9and BMP15are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge andBelcare sheep.Biol Reprod,2004,70:900-909)。1991年首先在Romney羊上发现的BMP15被称为GDF-9B(growth differentiation factor 9B)，是TGF(transforming growth factor)家族成员之一，位于绵羊X染色体上，在卵巢内仅在卵母细胞中特异性表达，其编码产物在卵母细胞发育过程中起着重要作用(Davis D H等，Evidence for the presence of a major gene influencing ovulation rate on the X chromosome of sheep.BiolRepord.1991,44(4):620-624)。BMP15是由卵母细胞分泌的生长因子，对早期卵泡的生长和分化起着重要的调节作用(Juengel J L等，Effects of immunization against bone morphogenetic protein 15and growthdifferentiation factor 9an ovulation rate,fertilization,and pregnancy in ewes.Biol Reprod,2004,70(3):557-561)。BMP15基因编码区外显子Ⅱ第718bp处发生了C→T突变，这一突变在卵巢内通过使颗粒细胞早熟及卵泡体积变小增加排卵数，是造成产羔数增加的一个重要基因。
FSHR(促卵泡素受体)属G蛋白偶联受体超家族中的糖蛋白亚家族成员，由胞外区、跨膜区和C-末端区构成。它包括至少10个亮氨酸丰富的重复单位(LPR)，每个约有24个氨基酸残基。与FSH产生特异性结合的位点位于LPR5-LPR10之间；7个α螺旋构成的跨膜结构是G蛋白偶联受体家族的特征性基序。FSHR基因的cDNA于1990年首次被克隆(Sprengel R等，The testicular receptor for follicle-stimulatinghormone:structure and functional expression of cloned cDNA.Mol Endocrinol,1990,4(4):525-530)，FSHR突变对生殖表型具有深刻的影响(Aittomaki K等，Mutation in the folliclestimulating hormone receptor gene causeshereditary hypergonadotropic ovarian failure.Cell,1995,82(6):959-968)。FSHR在动物繁殖活动中具有传递促卵泡生长发育生物学信息的作用，其基因突变可能增强或削弱转导FSH信息的功能，对生殖表型具有深刻的影响。人的FSHR基因位于2号染色体短臂2区1带，包括10个外显子和9个内含子(Gmmoll J等，Localization of the human FSH receptor to chromosome 2 p21using a genomic probe comprising exon10,Mol.EndocrinoL,1994(12):265-271；Rousseau-Merck等，The chromosomal localization of the humanfollicle-stimulating hormone receptor gene on 2p21-p16 is similar to that of the luteinizing hormone receptorgene,Genomics,1993(15):222-224)。Satoko Sudo等(2002)用PCR-SSCP分析FSHR基因多态性，检测其基因型频率，研究表明激素水平及一些妇科病与FSHR基因多态性相关。国内在二花脸猪上检测到了FSHR基因座位的多态性，研究结果表明，在FSHR基因座位发现的这个PCR-SSCP标记与二花脸猪的产活仔数显著相关，基因型的不同可导致猪的产活仔数有显著差异(陈杰等，二花脸猪足嗍位PCR-SSCP标记与产活仔数的关系.南京农业大学学报，2002，25(3)：53-56)。Rahal等报道，牛FSHR基因的第10外显子存在多态性(Rahal P等，Polymorphisms in the bovine follicle—stimulating hormone receptor gene.AnitaGenet,2000，31(4)：280-281)。雷雪芹等以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛和单胎母牛为实验材料，以牛的FSHR基因的第10个外显子作为标记牛双胎性状的候选基因，用SNP法进行了多态检测，得出FSHR基因的第10个外显子有可能作为双胎性状的候选基因的这一结论(雷学芹等，牛FSHR基因第l0外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系.中国生物化学与分子生物学报.2004，10(1)：34-37)。
通过以上资料我们可以得出上述3个基因可能参与动物繁殖调控过程并发挥着重要的作用。而绵羊繁殖性状受微效多基因控制，且呈加性-显性基因作用模式，现有的单分子标记对高繁殖力个体的选择效果有限，因此，需结合影响绵羊繁殖力的多个关键基因，设计多基因聚合选择模型用的分子标记或其组合，将提高绵羊产羔数的优势基因型聚合到同一个基因组中，以提高选择强度和准确性，加快高繁殖力优质绵羊新品种的培育进程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种的方法，该方法的核心技术在于一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记，以克服常规育种方法周期长、选择准确性低和单基因分子标记对于复杂经济性状选择效果有限的技术不足，通过PCR-RFLP的方法对候选个体的FecB、BMP15和FSHR进行基因型判型，分析单基因效应与多基因效应，利用分子标记组合效应提高绵羊产羔数的多基因聚合早期选中种方法的效率，利用构建的分子标记模型进行提高产羔数性状的标记辅助选择关联分析和高繁殖力绵羊新品种培育中的应用。本发明可以解决现有高繁殖力绵羊新品种培育方法的主要缺陷，如育种周期长和性状测定耗时且工作量大，加速高繁殖力绵羊新品的培育进程。
本发明的技术方案如下所述：
采集湖羊和小尾寒羊全血(这些品种为中国养殖的常规品种)，提取基因组DNA(按常规方法)，在位于绵羊FecB、BMP15和FSHR基因突变位点附近分别设计引物，扩增获得如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的序列。通过上述序列进行SeqMan比对提供了位于上述3个片段的111bp、35bp和88bp处的A/G、C/T和C/T突变，这些突变分别导致PCR-Ava Ⅱ-RFLP、PCR-Hinf Ⅰ-RFLP和PCR-BsiEⅠ-RFLP多态性(具体见后所述)。将上述3个基因的PCR产物分别用Ava Ⅱ、Hinf Ⅰ和BsiE Ⅰ限制性内切酶进行酶切分型及检测。运用上述检测方法在1630只具有详细产羔数记录的湖羊(869只)和小尾寒羊(761只)群体中进行基因型检测，利用SAS软件GLM程序进行单基因和多基因效应分析。实验结果显示上述3个基因的单基因效应对产羔数性状具有显著的影响，而多基因效应对产羔数性状也有显著的影响，且多基因效应远强于单基因效应，表明通过多基因联合效应选择能够大大提高母羊的产羔数性状，说明本发明的实用性和可靠性很好。
申请人通过克隆技术得到一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：
序列表SEQ ID NO：1所述的序列，在该序列的第111bp处有1个A110-G110的碱基替换(该序列表中111bp处的碱基是突变后的碱基)，导致Ava Ⅱ-RFLP酶切多态性；
2)序列表SEQ ID NO：2所述的序列，在该序列的第35bp处有1个C30-T30的碱基替换(该序列表中35bp处的碱基是突变后的碱基)，该突变导致PCR-Hinf Ⅰ-RFLP多态性；
3)序列表SEQ ID NO：3所述的序列，在该序列的第88bp处有1个C88-T88的碱基替换(该序列表中88bp处的碱基是突变后的碱基)，该突变导致PCR-BsiE Ⅰ-RFLP多态性。
申请人提供了一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记在提高绵羊产羔数性状标记辅助选择中的应用方法，该方法的要点在于，利用上述克隆的3个分子标记检测绵羊个体基因型，其中所述3个分子标记中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的两两组合使用，选择BBCC基因型个体作为种用。
进一步的利用包括，利用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的3个分子标记同时组合使用，选择BBG+CC基因型个体作为种用。
本发明的具体步骤如下所述：
一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记的制备方法，以具有完整产羔数性状记录的湖羊和小尾寒羊经产母羊为试验动物，采用颈静脉采血，提取基因组DNA，设计3对PCR扩增引物分别从绵羊基因组中分离FecB、BMP15和FSHR基因片段，通过PCR-RFLP的方法判断受测个体的基因型；利用SPSS16.0软件分别对FecB、BMP15和FSHR基因的单基因效应和FecB-BMP15、FecB-FSHR、BMP15-FSHR的双基因效应以及FecB-BMP15-FSHR三基因效应，比较上述单基因和多基因效应，确定最优基因型组合，建立一种提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种的方法；获得如下所述的分子标记：
其中：
从FecB基因中克隆得到一个基因片段，其核苷酸序列如下所示；
GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATGGGAAAGTGGCGTGGCGAAAAGGTAGCTGTGAAAGTGTTCTTCACTACAGAGGAGGCCAGCTGGTTCCGAGAGACAGAAATATATCAGR(A/G)CCGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTG
该序列中的111位的R为A或G，该突变导致PCR-Ava Ⅱ-RFLP多态性。
通过上述序列进行SeqMan比对提供了位于该扩增片段内部111bp处的A/G碱基变异，该变异导致PCR-Ava Ⅱ-RFLP多态性(见图4)
从BMP15基因中克隆得到一个基因片段，其核苷酸序列如下所示；
CACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGACTY(C/T)AGAGTGTTCAGAAGACCAAACCTCTCCCTAAAGGCCTGAAAGAGTTTACAGAAAAAGACCCTTCTCTTCTCTTGAGGAGGGCTCGTCAAGCAGGCAGTATTGCATC
该序列中的35位的Y为C或T，该突变导致PCR-Hinf Ⅰ-RFLP多态性。
通过上述序列进行SeqMan比对提供了位于该扩增片段内部35bp处的C/T碱基变异，该变导致PCR-Hinf Ⅰ-RFLP多态性(见图5)
从FSHR基因中克隆得到一个基因片段，其核苷酸序列如下所示；
CGTATCTTTCCACGCCCTCTACTTTTCCCACCCCACCCCCCCCAAAGCCACTGCGGCCATTCGGAAATTTTGTTATTTTTTTGGAAGY(C/T)GACGGATAAAAAAGGAAAAAAAGGAAAGCGGCCCTGGGCGGGTCACGTGACCCTACCAGCTCCCAATGCAGACCTCTTCTCAAAAGGGCTCAGTGTGGAGCCTCAGAAATCCGGGCAGGATTGTGTCTGCCAAAACCAAAGCAATCGGGTGGATGG
该序列中的88位的Y为C或T，该突变导致PCR-BsiE Ⅰ-RFLP多态性。
通过上述序列进行SeqMan比对提供了位于该扩增片段内部88bp处的C/T碱基变异，该变异导致PCR-BsiE Ⅰ-RFLP多态性(见图6)。
扩增这三个基因片段的引物对如下所示：
扩增FecB基因的引物F(正向引物)：GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG，
扩增FecB基因的引物R(反向引物)：CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC；
扩增BMP15基因的引物F(正向引物)：CACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC，
扩增BMP15基因的引物R(反向引物)：GATGCAATACTGCCTGCTTG；
扩增FSHR基因的引物F(正向引物)：CGTATCTTTCCACGCCCTCT，
扩增FSHR基因的引物R(反向引物)：CCATCCACCCGATTGCTT。
本发明的优点在于：
(1)利用本发明，可以在羔羊出生后利用少量血液或毛发提取的DNA来快速检测目的基因的基因型，筛选携带高繁殖力优势基因型的个体。
(2)本发明可以解决现有常规育种方法的主要缺陷，如需在母羊产羔后才能收集相关的产羔信息，而母羊一般在1.5岁时才会产头胎，且需要大量的、准确的产羔数数据才能进行常规选种，这样耗时长、工作量大。我们采用多基因聚合育种的方法即提高选择强度和准确性，又能缩短育种进程。
(3)本发明所用的多基因聚合育种的方法，其选择效果和选择强度远高于单基因分子标记辅助选择。因此，能够显著的提高选种的选择强度和准确性。
(4)本发明所用的群体数量大，达到了1630只，保证了实验数据的可靠性。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明制备的分子标记之一，该标记涉及的绵羊产羔数性状相关基因FecB包含酶切位点的部分序列。
序列表SEQ ID NO：2是本发明制备的分子标记之二，该标记涉及的绵羊产羔数性状相关基因BMP15包含酶切位点的部分序列。
序列表SEQ ID NO：3是本发明制备的分子标记之三，该标记中涉及的绵羊产羔数性状相关基因FSHR包含酶切位点的部分序列。
序列表SEQ ID NO：4是扩增FecB基因的正向引物序列。
序列表SEQ ID NO：5是扩增FecB基因反向引物序列。
序列表SEQ ID NO：6是扩增BMP15基因的正向引物序列。
序列表SEQ ID NO：7是扩增BMP15基因的反向引物序列。
序列表SEQ ID NO：8是扩增FSHR基因的正向引物序列。
序列表SEQ ID NO：9是扩增FSHR基因的反向引物序列。
图1：是本发明中绵羊FecB基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段的电泳图。
图2：是本发明中绵羊BMP15基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段的电泳图。
图3：是本发明中绵羊FSHR基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段的电泳图。
图4：是本发明中绵羊FecB基因Ava Ⅱ-RFLP的三种基因型(BB，B+，++)电泳结果。图中标记说明：M：DNA分子量标准(DL2000ladder)，其中1、2泳道为++型，3、4泳道为B+型，5、6泳道为BB型。
图5：是本发明中绵羊BMP15基因Hinf Ⅰ-RFLP的两种基因型(G+，++)电泳结果。图中标记说明：M：DNA分子量标准(DL2000ladder)，其中1、2、3泳道为G+型，4、5、6泳道为++型。
图6：是本发明中绵羊FSHR基因BsiE Ⅰ-RFLP的三种基因型(CC，TC，TT)电泳结果。图中标记说明：M：DNA分子量标准(DL2000ladder)，其中1、2泳道为TC型，3、4泳道为TT型，5、6泳道为CC型。
具体实施方式
实施例1、FecB基因PCR-RFLP诊断方法的建立
(1)引物设计
根据绵羊FecB基因序列(GenBank收录号：NC_019463.1)，利用Primer5.0软件设计一对引物M-F和M-R，序列如下：
FecB：M-F：5＇-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3＇，
M-R：5＇-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3＇。
(2)PCR扩增条件
PCR反应总体积20μL，其中绵羊基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，59℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到140bp特异扩增片段(如图1)。
(3)PCR-RFLP检测条件
用限制性内切酶Ava Ⅱ酶切位点(G↓GWCC)，其中该基因第110位为多态性切点。PCR产物酶切反应体积是10μL，其中1×buffer 1μL，PCR产物3～5μL，限制性内切酶Ava Ⅱ为0.3μL(10U)，用H2O补足10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第110bp位置是G时，则该Ava Ⅱ酶切位点不存在，Ava Ⅱ酶切后检测结果只有1个片段，长度是140bp(定为等位基因G或称为+)；但存在G140→A140的替换时，其结果导致第110bp处一个Ava Ⅱ酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为110bp和30bp(定为等位基因A或B)，三种基因型BB(AA)，B+(AG)，++(GG)如图4所述。
(4)绵羊FecB基因产羔数性状关联分析中的应用
试验共检测了1630只母羊，包括761只湖羊和869只小尾寒羊多态性，确定其基因型，并进行基因型与产羔数的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yijkl＝μ+Genotypei+Breedi+Sl+Combinationm+εijl。
其中，Yijkl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Breedj为品种效应，Si为季节效应，Combinationl为组合的效应，εijl为随机误差，假定εijl相互独立，服从N(0，σ2)分布。基因型检测结果表明在1630个个体中BB基因型，有142个，B+基因型有1450个个体，++基因型有38个个体。基因型与性状关联分析的结果是：FecB基因与产羔数呈显著相关。
由表1可知，FecB基因SNP位点对产羔数有极显著影响(P<0.01)，在总群体中BB基因型个体的产羔数极显著显著高于B+和++基因型个体的对应值，B+基因型个体的对应值居中，++基因型个体的对应值最低。在小尾寒羊和湖羊中群体中结果相同。
表1绵羊FecB基因Ava Ⅱ-RFLP酶切位点的多态性对产羔数性状的影响
注：数值以平均值±标准误示出，同列数值上标不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
实施例2、BMP-15基因PCR-RFLP诊断方法的建立
(1)引物设计
根据绵羊BMP-15基因序列(GenBank收录号：NC_019484.1)，利用Primer5.0软件设计一对引物M-F和M-R，序列如下
BMP-15：M-F：5＇-CACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC-3＇，
M-R：5＇-GATGCAATACTGCCTGCTTG-3＇。
(2)PCR扩增条件
PCR反应总体积20μL，其中绵羊基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，63℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到141bp特异扩增片段(如图2)。测序的结果发现在该141bp片段中存在一个Hinf Ⅰ酶切位点(G↓ANTC)，其中第30bp处为多态性切点。
(3)PCR-RFLP检测条件
PCR产物酶切反应体积是10μL，其中1×buffer 1μL，PCR产物3～5μL，限制性内切酶Hinf Ⅰ为0.3μL(10U)，用H2O补足10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第30bp位置是C(或者称为+)时，则该Hinf Ⅰ酶切位点不存在，Hinf Ⅰ酶切后检测结果只有1个片段，长度是141bp(定为等位基因C或者称为+)；但存在C30→T30的替换时，其结果导致第30bp处一个Hinf Ⅰ酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为111bp和30bp(定为等位基因T或者称为G)，检测出两种基因型G+和++如图5所述。
(4)绵羊BMP15基因产羔数标记性状关联分析中的应用
试验共检测了1630只母羊，包括761只湖羊和869只小尾寒羊多态性，确定其基因型，并进行基因型与产羔数的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yijkl＝μ+Genotypei+Breedi+Sl+Combinationm+εijl。
其中，Yijkl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Breedj为品种效应，Si为季节效应，Combinationl为组合的效应，εijl为随机误差，假定εijl相互独立，服从N(0，σ2)分布。基因型检测结果表明在1630个个体中G+基因型，有479个，++基因型有1151个个体。基因型与性状关联分析的结果是：BMP15基因与产羔数呈显著相关。
由表2可知，BMP15基因SNP位点对产羔数有显著影响(P<0.05)，在总群体中G+基因型个体的产羔数极显著显著高于++基因型个体的对应值。在小尾寒羊和湖羊中群体中结果相同。
表2绵羊BMP15基因Hinf Ⅰ-RFLP酶切位点的多态性对产羔数性状的影响
注：数值以平均值±标准误示出，同列数值上标不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
实施例3、FSHR基因PCR-RFLP诊断方法的建立
(1)引物设计
根据绵羊FSHR基因序列(GenBank收录号：NC_019460.1)，利用Primer5.0软件设计一对引物M-F和M-R，序列如下
FSHR：M-F：5＇-CGTATCTTTCCACGCCCTCT-3＇，
M-R：5＇-CCATCCACCCGATTGCTT-3＇。
(2)PCR扩增条件
PCR反应总体积20μL，其中绵羊基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，58℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到244bp特异扩增片段，该片段位于5’-UTR(如图1)。测序的结果发现在该244bp片段中存在一个BsiE Ⅰ酶切位点(CGRY↓CG)，其中第88bp处为多态性切点，位于5’-UTR中。
(3)PCR-RFLP检测条件
PCR产物酶切反应体积是10μL，其中1×buffer 1μL，PCR产物3～5μL，限制性内切酶BsiE Ⅰ为0.3μL(10U)，用H2O补足10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第88bp位置是T时，则该BsiEⅠ酶切位点不存在，BsiE Ⅰ酶切后检测结果只有1个片段，长度是244bp(定为等位基因T)；但存在T88→C88的替换时，其结果导致第88bp处一个BsiE Ⅰ酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为154bp和90bp(定为等位基因C)，三种基因型CC，TC，TT如图6所述。
(4)绵羊FSHR基因产羔数标记性状关联分析中的应用
试验共检测了1630只母羊，包括761只湖羊和869只小尾寒羊多态性，确定其基因型，并进行基因型与产羔数的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yijkl＝μ+Genotypei+Breedi+Pk+Sl+Combinationm+εijklm。
其中，Yijkl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Breedj为品种效应，Pk为胎次效应，Si为季节效应，Combinationl为组合的效应，εijkl为随机误差，假定εijkl相互独立，服从N(0，σ2)分布。基因型检测结果表明在1630个个体中CC基因型，有39个，TC基因型有1000个个体，TT基因型有591个个体。基因型与性状关联分析的结果是：FSHR基因与产羔数呈显著相关。
由表3可知，FSHR基因SNP位点对产羔数有极显著影响(P<0.01)，其中CC基因型个体的产羔数极显著显著高于TC和TT基因型个体的对应值，TC基因型个体的对应值居中，TT基因型个体的对应值最低。
表3绵羊FSHR基因BsiE Ⅰ-RFLP酶切位点的多态性对产羔数性状的影响
注：数值以平均值±标准误示出，同列数值上标不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
实施例4、分子标记的应用-1：双基因联合效应分析模型的建立
首先运用实施例1、2和3中所述方法分别检测出FecB、BMP15和FSHR 3个基因的多态位点，并分析其单基因效应，上述结果显示这3个基因的多态位点均对绵羊产羔数具有显著影响。为研究上述三个基因两两之间的互作效应以及进一步提高绵羊产羔数性状，建立绵羊产羔数多基因联合效应分析分析模型。
(1)双基因联合效应分析模型
试验共检测了1630只母羊，包括761只湖羊和869只小尾寒羊多态性，通过PCR-RFLP方法确定FecB-BMP15、FecB-FSHR和BMP15-FSHR基因型，并进行基因型与产羔数的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yjlm＝μ+SNP1+SNP2+SNP1*SNP2+Bj+Sl+Cm+εjlm
其中，Yjlm是性状观察值，μ为总体均数，SNP1和SNP2为基因型效应，SNP1*SNP2为双基因联合效应，Bj为品种效应，Sl为季节效应，Cm为组合的效应，εjlm为随机误差，假定εijlm相互独立，服从N(0，σ2)分布。
(2)双基因联合效应在绵羊产羔数性状关联分析中的应用
由表4可知，FecB/BMP-15基因SNP位点对产羔数有极显著影响(P<0.01)，其中BB/G+基因型个体的产羔数最高，为2.35±0.129只，既高于BB型个体的产羔数又高于G+个体的产羔数，运用FecB/BMP-15双基因选择模型，选留BB/G+基因型个体将有利于进一步提高绵羊的产羔数性状，且选择效果均高于FecB和BMP-15基因的单基因效应。
由表4可知，FecB/FSHR基因SNP位点对产羔数有极显著影响(P<0.01)，其中BB/CC基因型个体的产羔数最高，为3.000±0.577只，既高于BB型个体的产羔数又高于CC个体的产羔数，运用FecB/FSHR双基因选择模型，选留BB/CC基因型个体将有利于进一步提高绵羊的产羔数性状，且选择效果均高于FecB和FSHR基因的单基因效应。
由表4可知，BMP-15/FSHR基因SNP位点对产羔数有极显著影响(P<0.01)，其中BB/CC基因型个体的产羔数最高，为3.000±0.577只，既高于BB型个体的产羔数又高于CC个体的产羔数，运用FecB/FSHR双基因选择模型，选留BB/CC基因型个体将有利于进一步提高绵羊的产羔数性状，且选择效果均高于FecB和FSHR基因的单基因效应。
表4双基因联合效应对绵羊产羔数的选择效果
注：数值以平均值±标准误示出，同列数值上标不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
实施例5、分子标记的应用-2：三基因联合效应分析模型的建立
首先运用实施例1、2和3中所述方法分别检测出FecB、BMP15和FSHR 3个基因的多态位点，并分析其单基因效应，上述结果显示这3个基因的多态位点均对绵羊产羔数具有显著影响。为研究上述三个基因之间的互作以及进一步提高绵羊产羔数性状，建立绵羊产羔数多基因联合效应分析分析模型。
(1)三基因联合效应分析模型
试验共检测了1630只母羊，包括761只湖羊和869只小尾寒羊多态性，通过PCR-RFLP方法确定FecB-BMP15-FSHR基因型，并进行基因型与产羔数的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yjlm＝μ+SNP1+SNP2+SNP3+SNP1*SNP2+SNP1*SNP3+SNP2*SNP3+
SNP1*SNP2*SNP3+Bj+Sl+Combinationm+εjlm
其中，Yjlm是性状观察值，μ为总体均数，SNP1、SNP2和SNP3为基因型效应，SNP1*SNP2、SNP1*SNP3和SNP2*SNP3为双基因联合效应，SNP1*SNP2*SNP3为三基因联合效应，Bj为品种效应，Sl为季节效应，Cm为组合的效应，εijlm为随机误差，假定εjlm相互独立，服从N(0，σ2)分布。
(2)三基因联合效应在绵羊产羔数性状关联分析中的应用
由表4可知，FecB/BMP15/FSHR基因SNP位点对产羔数有极显著影响(P<0.01)，其中BB/G+/CC基因型个体的产羔数最高，为3.50±0.500只，既高于任何一个基因的单基因效应又高于任何两个双基因的双基因效应，运用FecB/BMP15/FSHR三基因选择模型，选留BB/G+/CC基因型个体将有利于进一步提高绵羊的产羔数性状，且选择效果均高于单基因效应和双基因效应。
表5三基因联合效应对绵羊产羔数的选择效果
注：数值以平均值±标准误示出，同列数值上标不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
Claims (3)
1.一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：
1)GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATGGGAAAGTGGCGTGGCGAAAAGGTAGCTGTGAAAGTGTTCTTCACTACAGAGGAGGCCAGCTGGTTCCGAGAGACAGAAATATATCAGR(A/G)CCGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTG
在该序列的111位的R为A或G，该突变导致PCR-AvaⅡ-RFLP多态性；
2)CACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGACTY(C/T)AGAGTGTTCAGAAGACCAAACCTCTCCCTAAAGGCCTGAAAGAGTTTACAGAAAAAGACCCTTCTCTTCTCTTGAGGAGGGCTCGTCAAGCAGGCAGTATTGCATC；
在该序列的35位的Y为C或T，该突变导致PCR-HinfⅠ-RFLP多态性；
3)CGTATCTTTCCACGCCCTCTACTTTTCCCACCCCACCCCCCCCAAAGCCACTGCGGCCATTCGGAAATTTTGTTATTTTTTTGGAAGY(C/T)GACGGATAAAAAAGGAAAAAAAGGAAAGCGGCCCTGGGCGGGTCACGTGACCCTACCAGCTCCCAATGCAGACCTCTTCTCAAAAGGGCTCAGTGTGGAGCCTCAGAAATCCGGGCAGGATTGTGTCTGCCAAAACCAAAGCAATCGGGTGGATGG
在该序列中的88位的Y为C或T，该突变导致PCR-BsiEⅠ-RFLP多态性。
2.权利要求1所述的一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记在提高绵羊产羔数性状标记辅助选择中的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的3个分子标记检测绵羊个体基因型，其中所述3个分子标记中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的两两组合使用，选择BBCC基因型个体作为种用。
3.权利要求1所述的一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记在提高绵羊产羔数性状标记辅助选择中的应用，其特征在于：利用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的3个分子标记同时组合使用，选择BBG+CC基因型个体作为种用。
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