CN103525921A - 一种利用3基因聚合效应选育山羊产羔性状的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用3基因聚合效应选育山羊产羔性状的方法，以山羊基因组DNA为模板，利用3对引物分别扩增干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因的外显子7以及亲吻素（KISS1）基因的内含子1，以浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳对各扩增产物进行大小判定，采用DNA测序技术筛查3对引物扩增产物的位点突变，然后利用浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳和浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳对SCF、KIT和KISS1基因的3个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析不同基因型组合与产羔数之间的关系，筛选最佳基因型组合。

Description

一种利用3基因聚合效应选育山羊产羔性状的方法
技术领域
本发明属于分子遗传育种学领域，具体涉及一种利用3基因聚合效应选育山羊产羔性状的方法，该方法应用PCR-RFLP和DNA测序技术检测被检个体干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7和亲吻素（KISS1）基因内含子1的单链DNA碱基突变多态性，通过分析不同基因型组合与山羊产羔数之间的关系，筛选出最佳基因型组合，分析拥有最佳基因型组合的高产个体的选配方式，再应用这些选配方式形成山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
背景技术
产羔率低是制约优质高效养羊业发展的主要瓶颈，而从遗传本质上研究提高产羔率的育种方法是国内外养羊科技工作者努力寻求破解的技术难题。以分子标记为核心的多基因聚合育种技术能直接在DNA水平上对产羔性状的基因型进行选择，克服了常规育种耗时长，效果差的缺点，可快速提高育种效率。可见，寻找与产羔性状紧密连锁分子标记，研究目标基因的调控功能及表达水平，筛选调控产羔性状的功能基因，是实现现代分子育种技术与常规育种技术有机结合，集成创新多基因聚合育种技术体系的基础和前提。基因聚合（Gene pyramiding）是通过基因工程手段，将分散在不同品种或品系中的优良基因通过杂交、回交、复合杂交等手段聚合到同一个品种中。畜禽的大部分经济性状具有加性效应，基因表达呈累加作用，即集中到一个品种中的同效基因越多表达越充分。目前，国内外关于羊分子育种的研究主要集中在羊的分子标记检测及其与性状的相关性方面，对于基因聚合育种技术大多数仍然仅停留于概念上，对其理论的研究相对滞后。
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。SNPs可以是两个或多个等位基因的多态，因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失、插入/缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换（以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤）以及颠换（嘌呤与嘧啶互换）所引起。具有颠换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG（核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后）二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs（cSNPs）、基因周边SNPs（pSNPs）和基因间SNPs（iSNPs）等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在编码区内的变异率仅占有周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响，尤其对于编码区突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能的发挥。基因序列上碱基的插入/缺失突变，同样将导致所编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列改变，以致影响到蛋白的生物学功能，从而造成对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。
由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-RFLP与DNA测序结合法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。
干细胞因子（Stem cell factor，SCF），有2种不同的形式，分别为可溶性和膜结合型。KIT蛋白包括975个氨基酸，其分子量为125～160kDa，是酪氨酸激酶（Tyrosine kinase）受体家族成员SCF和酪氨酸激酶受体KIT分别在颗粒细胞和卵母细胞中表达，其在原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）的生存，增殖、迁移以及卵泡的发育中发挥作用。SCF与它的受体KIT相互作用后，促使其受体的激酶区活化，导致胞内蛋白质发生磷酸化，从而使RAF、RAS等调控因子活化，进而对细胞凋亡进行调节。另外，KIT/SCF通路也介导FGF7及Activin等其它调控因子，其中Activin能调节FSH合成和分泌，并在调控卵泡的发育中起旁分泌和自分泌的作用。SCF-KIT信号通路在肿瘤发生机制中的研究较为成熟，SCF与KIT结合后引起胞浆内一系列蛋白的质磷酸化，激活MAPK、Raf、Ras、PKB/Akt等信号转导通路。研究发现3-磷酸肌醇激酶（PI3K）是SCF介导细胞存活和有丝分裂必需的信号物。体内外试验研究结果表明，卵巢颗粒细胞分泌SCF与卵母细胞表面的KIT结合后，能激活PI3K通路。利用免疫组织化学及原位杂交方法研究发现，在卵母细胞中的3-磷酸肌醇激酶（PI3K）通路中，PI3K的底物PKB和PKB的底物转录因子FKHRL1主要在初级卵泡和原始卵泡中的卵母细胞中表达，其表达受SCF调控。因而推测，SCF与KIT受体结合后通过KIT-PI3K-PKB-FKHRL1途径调控卵母细胞和卵泡早期的生长发育。研究发现另一种PKB的底物–糖原合成酶激酶-3（GSK-3），其在生长期的卵母细胞中表达，受到SCF调节；用可溶型SCF刺激体外培养的卵母细胞，PKB活性增加，并导致糖原合成酶激酶-3磷酸化，使用ACK2阻断KIT的功能，糖原合成酶激酶-3的磷酸化过程被减弱，SCF这种调控作用是通过KIT后PI3K途径完成的。由此可知，SCF与KIT结合后有新的信号通路，即KIT-PI3K-PKB-GSK-3途径，参与调控卵母细胞和卵泡早期的生长发育。另外，PI3K既是KIT信号通路的下游分子，也是其它通路上的信号分子，所以SCF与KIT结合后可通过多种信号通路协调作用,活化卵母细胞内的网络信号，确保卵母细胞与周围颗粒细胞之间的信息交流更为精准，从而精确地调控始基卵泡向初级卵泡的发育过程。
KISS1基因是采用消减杂交和差异显示的方法研究人黑瘤素细胞不同转移能力时发现的，其能够抑制肿瘤转移。通过NCBI可知，KISS1基因位于人类染色体1q32上，包含2个内含子和3个外显子，第1外显子不翻译，该基因编码的产物肽为Kisspeptins。人的Kisspeptin前体由145个氨基酸组成，包含1个由19个氨基酸组成的信号序列，在第57和67氨基酸处有2个潜在的二盐基的裂解位点，在第121～124氨基酸之间有1个末端裂解和酰胺化位点。Kisspeptin前体在体内被水解，形成含有54个氨基酸的多肽（在胎盘中大量表达），被命名为kisspeptin-54或metastin（转移抑素，具有抗肿瘤转移的作用），而Kisspeptin-54可进一步裂解成Kisspeptin-10，-13，-14，统称为Kisspeptins。G蛋白偶联受体54（G protein-coupled receptor54,GPR54）是KISS1蛋白的受体，属于GPR视紫红质家族成员。动物青春期的生长发育是一个非常复杂的过程，主要受下丘脑–垂体–性腺轴（Hypothalamic pituitary gonadal，HPG）内分泌系统的调控。研究发小鼠脑中55%～90%的GnRH神经元表达GPR54，在大鼠上为77%，也发现GnRH神经元与Kisspeptin免疫反应性曲张纤维之间的联系非常紧密。研究发现在青春期开始前后，GPR54和KISS1的mRNA在大鼠下丘脑的表达水平非常高。从幼年期到青春期，雌性下丘脑中GPR54和KISS1mRNA的水平显著增加。研究发现雄猴下丘脑中KISS1基因的表达水平在青春期中也上升，GnRH的释放量在青春期的增加是通过激活G蛋白偶联受体54来实现的，这主要是因为下丘脑中KISS1基因的表达及Kisspeptins在脑部的释放。给雌性小鼠腹腔、静脉和脑室注射Kisspeptins发现，小鼠性腺发育提前、雌激素和血浆LH水平升高。另一研究发现给幼年期末的灵长类动物连续注射Kisspeptin-10能使GnRH的分泌提前。向成年雄性大鼠脑室和外周血内注射Kisspeptins后，发现FSH、LH和LHRH分泌量都显著上升，但激发效应所需的时间存在差异。利用GPR54基因敲除小鼠研究KISS1/GPR54系统对青春期的调控作用时发现，雌性突变个体未经历性成熟，当其与成熟雄性小鼠交配时，突变雌性小鼠阴道不开张且不能受孕，突变的雄性小鼠睾丸和阴茎均较小且无法产生精子，其原因可能是GPR54的突变使GnRH的脉冲分泌受到阻碍，该结果进一步揭示出KISS-1/GPR54系统在动物的生殖和启动青春期过程中是不可缺少的。在非繁殖季节向绵羊静脉中注射Kisspeptin可促进90%的母羊发情并排卵，暗示出Kisspeptin可能与动物季节性发情有关。研究发现下丘脑中GPR54和KISS1基因在母羊发情周期的各个阶段均表达，发情前期、间情期和发情后期下丘脑中KISS1基因的表达量极显著低于发情期母羊（P<0.01），发情前期、间情期和发情后期之间的KISS1基因的表达量差异不显著，GPR54基因在发情周期的各阶段表达量差异不显著。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种利用3基因聚合效应选育山羊产羔性状的方法。以对动物繁殖性状有重要调控作用的SCF、KIT和KISS1基因为研究对象，采用PCR-RFLP和DNA测序技术研究这3个基因在山羊中的SNPs及其与产羔数的关联性；用数量遗传学分析方法研究SCF、KIT和KISS1基因聚合效应对产羔数的影响，为集成创新山羊产羔性状的多基因聚合育种技术体系提供试验依据和理论依据。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种利用3基因聚合效应选育山羊产羔性状的方法，其特征在于，以山羊基因组DNA为模板，在PCR条件下，利用3对引物P1、P2和P3，分别扩增干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7和亲吻素（KISS1）基因内含子1，其中：
所述的引物P1如下：
上游引物1F：5'-CCTCAGAAGTGAAGGTGCAGAGTCC-3'；
下游引物1R：5'-CAATGAGGACCAGTCATGTGCCAG-3';
所述的引物P2如下：
上游引物2F：5'-GGTAGGTGATCCACAGGT-3'；
下游引物2R：5'-TGGTCAGCGAATTGTAGG-3'；
所述的引物P3如下：
上游引物3F：5'-CCCGCTGTAACTAGAGAAAG-3'；
下游引物3R：5'-CATCCAGGGTGAGTGATACT-3'；
引物P1扩增干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，用于筛查山羊干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区位点的突变；
引物P2扩增III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7，用于筛查山羊III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7位点的突变；
引物P3扩增亲吻素（KISS1）基因的内含子1，用于筛查山羊亲吻素（KISS1）基因的内含子1位点的突变；
根据琼脂糖凝胶（浓度1.5%）电泳对3对引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛查到干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7和亲吻素（KISS1）基因的内含子1共有3个碱基的突变。
再利用浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶和浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳对这3个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析不同基因型组合与山羊产羔数之间的关系，挑选最佳的基因型组合，分析拥有最佳基因型组合个体的选配方式，应用这些选配方式形成山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
所述的PCR扩增的条件是：
15μL反应体系：包括DNA模板50ng，7.5μl2×Taq MasterMix，上下游引物（10μM）各0.3μl，加灭菌水至15μl；
PCR反应程序如下：
1）利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸35s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸35s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
3）利用引物P3的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸35s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
所述的干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区在17025bp存在C→A的突变，所述的III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7在88430bp存在T→A的突变，所述的亲吻素（KISS1）基因的内含子1在2124bp存在T→A的突变。
所述的基因分型是浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶和浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳分析引物P1、P2和P3的PCR扩增产物，结果如下：
引物P1位点：纯合型CC在17025bp位的碱基是C，杂合型CA在17025bp位的碱基是C\A，纯合型AA在17025bp位的碱基是A；
引物P2位点：纯合型TT在88430bp位的碱基是T，杂合型TA在88430bp位的碱基是T\A，纯合型AA在88430bp位的碱基是A；
引物P3位点：纯合型TT在2124bp位的碱基是T，杂合型TA在2124bp位的碱基是T\A，纯合型AA在2124bp位的碱基是A。
所述的最佳基因型组合为C22（CCTTTT），产羔数最低的基因型组合为C5（CATTAA）
所述的不同基因型对山羊产羔数的影响为：
C22（CCTTTT）组合基因型个体第2和4胎产羔数显著高于C2（CATAAA）和C5（CATTAA）型个体（P<0.05）；C22（CCTTTT）组合基因型个体第3胎和平均胎次的产羔数显著高于C1（AAAAAA）、C2（CATAAA）、C3（CCTAAA）和C5（CATTAA）型个体（P<0.05）；C5（CATTAA）组合基因型个体平均胎次的产羔数显著低于C12-C15和C17-C22型个体（P<0.05）。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
提出了与山羊产羔性状相关的功能基因干细胞因子（SCF）的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）外显子7和亲吻素（KISS1）的内含子1的3个SNPs，这3个SNPs能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。
对这3个基因的SNPs进行了基因分型和基因频率分析，检测母羊个体的基因型组合与产羔数的关系，挑选最佳的基因型组合，分析拥有最佳基因型组合个体的选配方式，应用这些选配方式形成山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
附图说明
图1是山羊干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区利用引物P1进行PCR扩增产物电泳图；
图2是山羊III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7利用引物P2进行PCR扩增电泳图；
图3是山羊亲吻素（KISS1）基因的内含子1利用引物P3进行PCR扩增电泳图；
图4是干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区利用引物P1进行PCR扩增产物的ScrFI酶切产物的电泳检测结果。3种基因型的41bp及CA和CC基因型的23bp在图中未示出；
图5是III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7利用引物P2进行PCR产物的HincII酶切产物的电泳检测结果；
图6是亲吻素（KISS1）基因的内含子1利用引物P3进行PCR产物的XmnI酶切产物的电泳检测结果；
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
以下是通过对山羊基因组DNA的提取、检测和浓度分析，以及在PCR扩增条件下，利用引物P1、P2和P3扩增的干细胞因子（SCF）的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）外显子7和亲吻素（KISS1）的内含子1扩增产物的聚丙烯凝胶和琼脂糖凝胶电泳分析的具体实施例。
A、利用引物P1、P2和P3分别扩增的干细胞因子（SCF）的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）外显子7和亲吻素（KISS1）的内含子1及其多态性的检测：
1、山羊血样的采集及处理
取山羊血样5mL，加入0.2μL的ACD（柠檬酸2.4g；柠檬酸三钠6.6g；葡萄糖7.35g；定容至50mL，高压灭菌）抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。
本实施例血液样本共采集735份，其中关中奶山羊（GZ）血样231份，采自陕西绿色新世纪生物有限公司；西农萨能奶山羊（SN）血样306份，采自陕西省千阳县羊场；布尔山羊（BG）血样198份，采自陕西省麟游县布尔山羊场。
2、基因组DNA的提取
①取290μl加入抗凝剂的冷冻或新鲜血液，放入1.5ml离心管中；
②加入29μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，室温15分钟（期间颠倒混匀几次），加入300μl混合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮（但颜色偏黑色）；
③加入145μl异丙醇（陈旧血加290μl异丙醇），剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时加入样品粘稠不易混匀时可以涡旋震荡15秒混匀，但不可用手剧烈震荡，以免剪切DNA。
④将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱VI中，（吸附柱放入收集管中）10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；
⑤加入725μl抑制物去除IR，12000rpm离心30秒，弃废液；
⑥加入750μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
⑦加入750μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
⑧将吸附柱VI放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
⑨取出吸附柱VI，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加70μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65℃～70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，-20℃保存；
注意：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
3、DNA池的构建
（1）浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测
选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。
（2）OD值测定
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度（μg/mL）=50×OD260值×稀释倍数
（3）品种DNA池的构建
DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至80ng/μl～100ng/μl，然后从每个样品中吸取5μl的DNA样品混合构建DNA池。
4、PCR扩增引物设计
根据GenBank数据库中牛的SCF基因的DNA序列（GenBank No.NC_007303），利用Primer6.0设计引物P1，扩增山羊SCF基因的3'非翻译区，筛查山羊SCF基因P1位点的突变；
根据GenBank数据库中牛的KIT基因的DNA序列（GenBank No.AC_000163），利用Primer6.0设计引物P2，扩增山羊KIT基因的外显子7，筛查山羊KIT基因P2位点的突变；
根据GenBank数据库中山羊的KISS1基因的DNA序列（GenBank No.GU142847），利用Primer6.0设计引物P3，扩增山羊KISS1基因的内含子1，筛查山羊KISS1基因P3位点的突变。
所述的引物P1如下：
上游引物1F：5'-CCTCAGAAGTGAAGGTGCAGAGTCC-3'；
下游引物1R：5'-CAATGAGGACCAGTCATGTGCCAG-3';
所述的引物P2如下：
上游引物2F：5'-GGTAGGTGATCCACAGGT-3'；
下游引物2R：5'-TGGTCAGCGAATTGTAGG-3'；
所述的引物P3如下：
上游引物3F：5'-CCCGCTGTAACTAGAGAAAG-3'；
下游引物3R：5'-CATCCAGGGTGAGTGATACT-3'。
5、PCR扩增
分别以个山羊群体的DNA池为模版，利用引物P1、P2和P3分别扩增的干细胞因子（SCF）的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）外显子7和亲吻素（KISS1）的内含子1，PCR扩增条件及程序如下所示：
PCR扩增的条件是：
15μL反应体系，包括DNA模板50ng，7.5μl的2×Taq MasterMix，上下游引物（10μM）各0.3μl，加灭菌水至15μl；
PCR反应程序如下：
1）利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸35s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸35s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
3）利用引物P3的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸35s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
6、PCR产物纯化和测序
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1、图2和图3所示，可以清楚看到328bp、362bp和377bp的条带，说明目的基因片段扩增成功；
然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：
（1）首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
（3）向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（5）向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（6）向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。
（7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。
（8）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤（7）。
把以上以3个山羊群体DNA池为模板的PCR纯化产物送英俊公司进行双向测序，对测序峰图进行分析，结果表明，干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区在17025bp存在C→A的突变，所述的III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7在88430bp存在T→A的突变，所述的亲吻素（KISS1）基因的内含子1在2124bp存在T→A的突变。
B、利用引物P1、P2和P3扩增得到的山羊干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区、III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7和亲吻素（KISS1）基因内含子1的3个SNPs的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：
利用引物P1、P2和P3分别对3个山羊品种735份基因组DNA进行PCR扩增，然后利用如下方法对每个山羊的干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7和亲吻素（KISS1）基因的内含子1进行基因分型，具体方法如下：
对于片段长度差异较大（50bp以上）的酶切片段，用浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，电压105V电泳45min，凝胶成像系统拍照并分型。对于片段长度差异较小的酶切片段，用浓度为10%～12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压112V电泳1～1.5h，银染后照相并分型。银染的方法如下：电泳完后，回收电泳液，取出凝胶放入托盘中，蒸馏水清洗2次后，加入200ml浓度为0.1%的硝酸银（AgNO3）溶液，避光轻摇染色10～15min。倒掉AgNO3溶液，用去离子水清洗2次，然后将染色液倒入托盘中，轻摇10～15min，直到呈现清晰的DNA条带，倒掉染色液，用去离子水清洗2次。基因分型结果见图4，图5和图6所示。
C、SNP位点的遗传结构分析
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。多态信息含量（PIC）用来估计标记位点的多态，PIC<0.25为低度多态，0.25<PIC<0.5为中度多态，PIC>0.5为高度多态。杂合度（He）是度量某一群体中特定位点上等位基因杂合程度的指标。采用皮尔逊χ2统计量对某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性进行检测（表1）。
表1：P1、P2和P3SNP位点的遗传结构
Figure BDA0000388848450000161
D、山羊SCF基因、KIT基因和KISS1基因聚合效应对产羔数的影响
生产数据：西农萨能奶山羊、关中奶山羊和布尔山羊第1、2、3和4胎的产羔数。
关联分析模型：
利用SPSS（16.0）软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值。再利用多元线性模型分析组合基因型效应。
在数据处理中，根据影响产羔性状的因素不同，考虑到场效应（Farm）、品种效应（Breed）、种公畜效应（S）、种公畜内母畜间效应（SD）、年龄（Age）、基因型效应（Genotype）及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：
yijkmnpq=μ+Farmi+Bj+Sp+SDq+Ak+Cm+Xn＋eijkmnpq
其中：yijkmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farmi：场别效应；Bj：品种效应；Sp：种公畜效应；SDq：种公畜内母畜间效应；Ak：年龄效应；Cm：组合基因型效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，如：F×B，F×A，F×G，B×A，B×C，A×C，B×A×C等；eijkmnpq：随机误差；运用SPSS（16.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各组合基因型间产羔数进行差异显著性检验。分析结果如表2所示：
表2KITLG、KIT和KISS1基因聚合效应对山羊产羔数（均值±标准误）的影响
Figure BDA0000388848450000181
注：同一列中标有不同字母的数据间差异显著（P<0.05）。个体数小于10的组合基因型未在表中列出。
C22（CCTTTT）组合基因型个体第2和4胎产羔数显著高于C2（CATAAA）和C5（CATTAA）型个体（P<0.05）；C22（CCTTTT）组合基因型个体第3胎和平均胎次的产羔数显著高于C1（AAAAAA）、C2（CATAAA）、C3（CCTAAA）和C5（CATTAA）型个体（P<0.05）；C5（CATTAA）组合基因型个体平均胎次的产羔数显著低于C12-C15和C17-C22型个体（P<0.05）。因此，通过分析母羊个体的基因型组合与产羔数的关系，挑选最佳的基因型组合，分析拥有最佳基因型组合个体的选配方式，应用这些选配方式形成山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
Figure IDA0000388848530000011

Claims (6)

1.一种利用3基因聚合效应选育山羊产羔性状的方法，其特征在于，以山羊基因组DNA为模板，在PCR条件下，利用3对引物P1、P2和P3，分别扩增干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7和亲吻素（KISS1）基因的内含子1，其中：
所述的引物P1如下：
上游引物1F：5'-CCTCAGAAGTGAAGGTGCAGAGTCC-3'；
下游引物1R：5'-CAATGAGGACCAGTCATGTGCCAG-3'；
所述的引物P2如下：
上游引物2F：5'-GGTAGGTGATCCACAGGT-3'；
下游引物2R：5'-TGGTCAGCGAATTGTAGG-3'；
所述的引物P3如下：
上游引物3F：5'-CCCGCTGTAACTAGAGAAAG-3'；
下游引物3R：5'-CATCCAGGGTGAGTGATACT-3'；
引物P1扩增干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，用于筛查山羊干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区位点的突变；
引物P2扩增III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7，用于筛查山羊III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7位点的突变；
引物P3扩增亲吻素（KISS1）基因的内含子1，用于筛查山羊亲吻素（KISS1）基因内含子1位点的突变；
用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳对3对引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛查到干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区，III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7和亲吻素（KISS1）基因的内含子1共有3个碱基的突变；
再利用浓度为10%聚丙烯酰胺凝胶和浓度为3.5%琼脂糖凝胶电泳对这3个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析不同基因型组合与山羊产羔数之间的关系，挑选最佳的基因型组合，分析拥有最佳基因型组合个体的选配方式，应用这些选配方式形成山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是：
15μL反应体系：包括DNA模板50ng，7.5μl2×Taq MasterMix，10μM的上下游引物各0.3μl，加灭菌水至15μl；
PCR反应程序如下：
1）利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸35s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸35s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
3）利用引物P3的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸35s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞因子（SCF）基因的3'非翻译区在17025bp存在C→A的突变；所述的III型跨膜酪氨酸激酶受体（KIT）基因外显子7在88430bp存在T→A的突变；所述的亲吻素（KISS1）基因的内含子1在2124bp存在T→A的突变。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因分型是用浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶和浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳分析引物P1、P2和P3的PCR扩增产物，结果如下：
引物P1位点：纯合型CC在17025bp位的碱基是C，杂合型CA在17025bp位的碱基是C\A，纯合型AA在17025bp位的碱基是A；
引物P2位点：纯合型TT在88430bp位的碱基是T，杂合型TA在88430bp位的碱基是T\A，纯合型AA在88430bp位的碱基是A；
引物P3位点：纯合型TT在2124bp位的碱基是T，杂合型TA在2124bp位的碱基是T\A，纯合型AA在2124bp位的碱基是A。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的最佳基因型组合为C22（CCTTTT）；产羔数最低的基因型组合为C5（CATTAA）。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的不同基因型组合对山羊产羔数的影响为：
C22（CCTTTT）组合基因型个体第2和4胎产羔数显著高于C2（CATAAA）和C5（CATTAA）型个体；C22（CCTTTT）组合基因型个体第3胎和平均胎次的产羔数显著高于C1（AAAAAA）、C2（CATAAA）、C3（CCTAAA）和C5（CATTAA）型个体；C5（CATTAA）组合基因型个体平均胎次的产羔数显著低于C12-C15和C17-C22型个体。
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