CN105462967A - 绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记、引物对、试剂盒及鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记、引物对、试剂盒及鉴别方法，所述分子标记为SEQ？ID？No.1的第113位所示的G/C碱基突变。本发明的分子标记应用于标记辅助选择育种，对于非季节性繁殖绵羊品种的遗传选育和野生绵羊的驯化具有非常重要的意义。

Description

绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记、引物对、试剂盒及鉴别方法

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记、引物对、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

绵羊属于季节性繁殖动物，大多表现为秋季发情配种、春季产羔，年产一胎和一胎单羔，其繁殖活动的季节性过渡是机体内分泌变化与自然界每年的光周期变化同步化的结果，以最大限度地提高自然环境条件下其幼畜的存活率。但是目前随着养羊业生产条件的不断改善，良好的圈舍条件已能够满足羔羊的越冬和存活所需；另一方面，随着养羊业的规模化、集约化发展，绝大多数绵羊品种的季节性繁殖和低繁殖效率，已成为制约绵羊生产的关键因素。解决这一制约因素最有效的手段是对现有的季节性绵羊品种进行遗传改良，从遗传本质上突破繁殖季节性束缚，实现常年发情或延长繁殖季节。

研究发现，不同绵羊品种如驯化绵羊品种Suffolk、Merino和野生绵羊品种Soay、Moulflon之间在繁殖季节性方面存在很大变异，经过驯化的绵羊品种具有季节性繁殖周期缩短、繁殖季节延长的遗传趋势。我国绵羊品种资源丰富，其中也有一些常年发情的绵羊品种，如湖羊、小尾寒羊和多浪羊等。另外，在季节性繁殖绵羊品种如哈萨克羊、萨福克羊和中国美利奴羊等群体中，也存在个别绵羊在非繁殖季节表现发情的现象。季节性繁殖是机体对自然界光周期现象适应性的表现，相同纬度条件下野生绵羊与家绵羊之间、不同家绵羊品种间或相同品种不同个体间在繁殖季节性上表现出的这种差异，除了饲养管理、营养条件的影响外，最本质的原因还是在于遗传变异，如某些基因序列的碱基突变、插入/缺失，使得机体繁殖的季节性发生了一定改变。因此，有针对性地选择育种，这对于非季节性繁殖绵羊品种的遗传选育和野生绵羊的驯化具有非常重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供一种绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记，主要目的是作为分子标记标记辅助选择育种。

为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记，其为SEQIDNo.1的第113位所示的G/C碱基突变。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于鉴别绵羊是否为常年发情绵羊的引物对，由正向引物和反向引物组成，其中所述正向引物为与SEQIDNo.1的第113位上游特异结合的单链DNA，所述反向引物为与SEQIDNo.1的第113位下游特异结合的单链DNA。

作为优选，所述正向引物的序列为5’-TCCTCATCGCCTCCGTAGAC-3’，是SEQIDNo.1的第1-20位；所述反向引物为与SEQIDNo.1的第213-230位反向互补的单链DNA，其序列是5’-CCCCAGCATGATGACGTAG-3’。

作为优选，所述SEQIDNo.1的第113位上游不包括SEQIDNo.1的第113位，所述SEQIDNo.1的第113位下游不包括SEQIDNo.1的第113位。

另一方面，本发明实施例提供了一种鉴别绵羊是否为常年发情绵羊的试剂盒，所述试剂盒包括上游引物和下游引物组成的引物对，所述引物对为上述实施例的引物对。

作为优选，所述试剂盒为PCR试剂盒。

另一方面，本发明实施例提供了一种鉴别非季节性繁殖绵羊的方法，包括如下步骤：以待鉴别绵羊的基因组DNA为模板，采用上述实施例的引物对进行扩增，根据得到的扩增产物按照下述方法确定所述待鉴别绵羊是否为常年发情绵羊：

所述待鉴别绵羊的扩增产物在SEQIDNo.1的113位的碱基为G，所述待鉴别绵羊为常年发情绵羊或为候选常年发情绵羊；所述待鉴别绵羊的扩增产物在SEQIDNo.1的113位的碱基为C，所述待鉴别绵羊为季节性发情绵羊或为候选季节性发情绵羊。

作为优选，所述扩增为PCR扩增。

作为优选，PCR扩增后，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物的单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism，SSCP)，按照下述方法确定所述待鉴定绵羊是否为常年发情绵羊：

所述待鉴定绵羊的PCR产物在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为两条带，则所述待鉴定绵羊为杂合子，即GC型；

所述待鉴定绵羊的PCR产物在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为一条带，且该条带对应杂合子所呈现两条带中靠近加样孔的一条带的位置，则所述待鉴定绵羊为常年发情绵羊或候选常年发情绵羊，即GG型；

所述待鉴定绵羊的PCR产物在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为一条带，且该条带对应杂合子所呈现两条带中距离加样孔较远的一条带的位置，则所述待鉴定绵羊为季节性发情绵羊或候选季节性发情绵羊，即CC型。

作为优选，所述PCR扩增采用的引物退火温度均为60℃。

作为优选，所述PCR扩增中采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；20℃保存。

作为优选，所述待鉴别绵羊为阿勒泰羊、中国美利奴或湖羊。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明实施例的绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记用于绵羊的早期选育，甚至在绵羊刚出生时就可以筛选，提高常年发情绵羊育种的选择效率，加快育种进程。

附图说明

图1为绵羊基因组的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱。最左边为DNA标准marker，从下到上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。

图2为不同绵羊PCR产物的测序结果。

图3为PCR引物对FR对绵羊的PCR产物的SSCP电泳图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

本发明实施例中，常年发情绵羊是指全年均可发情排卵的成年绵羊；季节性发情绵羊是指只在发情季节(8-12月份)才能发情排卵，而在非发情季节不会发情排卵的成年绵羊。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

湖羊、小尾寒羊、萨福克羊、阿勒泰羊样品均可从商业途径获得，也可从新疆农垦科学院种羊场获得，以重复本发明实验。

实施例1

用于鉴别绵羊是否为常年发情绵羊的引物对，引物对FR由正向引物F和反向引物R两条单链DNA组成，其序列如下：

F：5’-TCCTCATCGCCTCCGTAGAC-3’(SEQIDNo.1的第1-20位)

R：5’-CCCCAGCATGATGACGTAG-3’(与SEQIDNo.1的第213-230位反向互补)。

实施例2

鉴别绵羊是否为常年发情绵羊的试剂盒，该试剂盒为PCR试剂盒，试剂盒的PCR试剂包括：实施例1的PCR引物对FR、10×Taq缓冲液、dNTPmix、TaqDNA聚合酶和灭菌去离子水(ddH₂O)。上述引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。10×Taq缓冲液、dNTPmix和TaqDNA聚合酶均由天根生化科技(北京)有限公司提供(货号分别为：CD117和ET109)。

试剂盒的SSCP试剂包括：30％丙烯酰胺、10％过硫酸胺、银染液、显色液、SSCP上样缓冲液，上述各溶液的配制方法如下，其中所有试剂均为国产分析纯。

30％丙烯酰胺：称取丙烯酰胺29g，N,N'-亚甲双丙烯酰胺1g于60ml去离子水中，磁力搅拌使其充分溶解后，补加去离子水定容至100ml。置棕色瓶中保存于4℃。

10％过硫酸胺(APS)：称1g过硫酸胺溶于水，定容至10ml。于4℃保存数周。

100ml银染液：NH3·H₂O1ml，3.6％NaOH2.1ml，20％AgNO₃1.8ml，加去离子水至100ml。

200ml显色液：1％柠檬酸钠1ml，甲醛100μl，加去离子水至200ml。

SSCP上样缓冲液：98％去离子甲酰胺、2％甘油、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青溶于0.01M/mlEDTA(pH8.0)中。

实施例3

利用SEQIDNo.1中第113位碱基突变鉴别季节性发情绵羊，具体步骤如下：

1)绵羊基因组提取及PCR扩增

共采集420只绵羊血液样本，其中阿勒泰羊127只、萨福克羊45只、湖羊195只、小尾寒羊53只。每只绵羊采用颈静脉采血，ACD抗凝，-20℃保存。使用基因组提取试剂盒提取绵羊基因组DNA，检测备用。

每只绵羊均采用如下PCR体系和如下PCR条件，分别以每只绵羊基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系见下表1。

表1.25μL的PCR反应体系

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

取每只绵羊的PCR扩增产物5μL进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像结果表明：所检测的420只绵羊基因组的PCR产物在2％琼脂糖凝胶电泳中均显示为230bp的特异条带(图1为部分样品的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果)。

2)PCR扩增产物的SSCP电泳检测

分别取每只绵羊对应的PCR产物2μL，分别加入8μL变性缓冲液，98℃变性10min后迅速置于冰中冰浴10min。然后将样品逐一加入12％非变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在5℃、120伏电压条件下电泳16小时。电泳结束后关上电泳仪，小心取下凝胶，进行硝酸银染色。

3)根据SSCP带型鉴别或辅助鉴别常年发情绵羊

不同绵羊PCR产物经SSCP电泳、凝胶染色后分别出现了3种不同的带型，分别将不同条带对应的基因型定义为GG、CC和GC型，其中GC型显示为两条带；GG型显示为单一条带，其位置对应于GC型两条带中位于上方的那个条带(靠近加样孔)；CC型显示为单一条带，其位置对应于GC型两条带中位于下方的那个条带(远离加样孔)。图3显示了部分绵羊的GG、GC和CC基因型个体的PCR产物的SSCP电泳结果。图3中，从左至右的泳道依次为GG基因型的湖羊(第1-3泳道)、CC基因型的阿勒泰羊(第4泳道)、GG基因型的萨福克羊(第5泳道)、CC基因型的萨福克羊(第6泳道)、GC基因型的萨福克羊(第7泳道)、GC基因型的小尾寒羊(第8泳道)、CC基因型的小尾寒羊(第9泳道)、GG基因型的小尾寒羊(第10、11泳道)。

在所检测的127只阿勒泰羊中，有67只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为两条带，对应的基因型为GC型；有55只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为单一条带，其位置对应于GC型两条带中居下方的那个条带，该条带对应的基因型为CC型；只有5只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为一条带，其位置对应于GC型两条带中居上方的那个条带，该条带对应的基因型为GG型。

在所检测的45只萨福克羊中，有12只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为两条带，对应的基因型为GC型；有31只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为单一条带，其位置对应于GC型两条带中居下方的那个条带，该条带对应的基因型为CC型；只有2只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为一条带，其位置对应于GC型两条带中居上方的那个条带，该条带对应的基因型为GG型。

在所检测的195只湖羊中，有67只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为两条带，对应的基因型为GC型；有10只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为单一条带，其位置对应于GC型两条带中居下方的那个条带，该条带对应的基因型为CC型；有118只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为一条带，其位置对应于GC型两条带中居上方的那个条带，该条带对应的基因型为GG型。

在所检测的53只湖羊中，有21只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为两条带，对应的基因型为GC型；有5只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为单一条带，其位置对应于GC型两条带中居下方的那个条带，该条带对应的基因型为CC型；有27只的PCR产物在SSCP凝胶中显示为一条带，其位置对应于GC型两条带中居上方的那个条带，该条带对应的基因型为GG型。

不同绵羊品种的基因频率和基因型频率如表2所示。所检测4个绵羊群体的PCR产物经SSCP电泳均出现3种带型(GG、CC、GC)，但基因型频率和等位基因频率分布存在差异。其中阿勒泰羊和萨福克羊GG基因型频率最少分别为4％(5/127)和4.4％(2/45)，湖羊和小尾寒羊群体中则是CC基因型频率较少分别为5.1％(10/195)和9.4％(5/53)。卡方检验表明湖羊、萨福克羊与小尾寒羊在该位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)，而阿勒泰羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态。

表2不同绵羊品种的基因频率和基因型频率分布

分别回收每只绵羊的PCR产物进行测序，结果表明：所有GG型绵羊个体的PCR产物均含有SEQIDNo.1第113位所示的碱基为G的分子标记，所有GC型绵羊个体的PCR产物均含有SEQIDNo.1第113位所示的碱基为G的分子标记，所有CC型绵羊个体的PCR产物均不含有SEQIDNo.1第113位所示的碱基为G的分子标记。说明GG型为含有SEQIDNo.1的第113位所示的碱基为G的分子标记的纯合子，GC型为含有SEQIDNo.1的第113位所示的碱基为G的分子标记的杂合子，CC为不含有SEQIDNo.1的第113位所示的碱基为G的分子标记的纯合子。

根据PCR产物的SSCP带型，按照下述方法确定所检测绵羊是否为常年发情绵羊：如果待鉴定绵羊PCR产物的SSCP带型显示为GC型(两条带)或GG型(一条带，其位置对应于GC型两条带中居上方的那个条带)，该待鉴定绵羊为候选非季节性繁殖绵羊，如果待鉴定绵羊PCR产物的SSCP带型显示为CC型(一条带，其位置对应于GC型两条带中居下方的那个条带)，则该待鉴定绵羊为候选季节性繁殖绵羊。

按照上述方法确定，所检测的195只湖羊中，有118只GG型和67只GC型湖羊为候选非季节性发情绵羊，10只CC型湖羊为候选季节性繁殖绵羊；在所检测的53只小尾寒羊中，有27只GG型和21只GC型小尾寒羊为候选非季节性发情绵羊，有5只CC型小尾寒羊为候选季节性繁殖绵羊；在所检测的127只阿勒泰羊中，有5只GG型和67只GC型阿勒泰羊为候选非季节性发情绵羊，有55只CC型阿勒泰羊为候选季节性发情绵羊；在所检测的45只萨福克羊中，有2只GG型和12只GC型萨福克羊为候选非季节性发情绵羊，有31只CC型萨福克羊为候选季节性发情绵羊。

利用SEQIDNo.1第113位碱基突变鉴别或辅助鉴别非季节性发情绵羊的准确性

观察所检测的127只阿勒泰羊、45只萨福克羊、195只湖羊和53只小尾寒羊在非繁殖季节(2-6月份)的发情表现。结果表明：

在所检测的195只湖羊中，118只GG型湖羊和67只GC型湖羊在非繁殖季节均有明显的发情表现，均属于常年发情绵羊；10只CC型湖羊在非繁殖季节没有表现发情，属于季节性繁殖绵羊。

在所检测的53只小尾寒羊中，27只GG型湖羊和21只GC型小尾寒羊在非繁殖季节均有明显的发情表现，均属于常年发情绵羊；5只CC型小尾寒羊在非繁殖季节没有表现发情，属于季节性繁殖绵羊。

在所检测的127阿勒泰羊中，5只GG型阿勒泰羊和67只GC型阿勒泰羊在非繁殖季节均有发情表现，均属于常年发情绵羊；55只CC型阿勒泰羊在非繁殖季节没有表现发情，属于季节性繁殖绵羊。

在所检测的45只萨福克羊中，2只GG型萨福克羊和12只GC型萨福克羊在非繁殖季节均有发情表现，均属于常年发情绵羊；31只CC型萨福克羊在非繁殖季节没有表现发情，属于季节性繁殖绵羊。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (12)

1.绵羊季节性繁殖性状相关的分子标记，其为SEQIDNo.1的第113位所示的G/C碱基突变。

2.用于鉴别绵羊是否为常年发情绵羊的引物对，由正向引物和反向引物组成，其中所述正向引物为与SEQIDNo.1的第113位上游特异结合的单链DNA，所述反向引物为与SEQIDNo.1的第113位下游特异结合的单链DNA。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述正向引物的序列为5’-TCCTCATCGCCTCCGTAGAC-3’，是SEQIDNo.1的第1-20位；所述反向引物为与SEQIDNo.1的第213-230位反向互补的单链DNA，其序列是5’-CCCCAGCATGATGACGTAG-3’。

4.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述SEQIDNo.1的第113位上游不包括SEQIDNo.1的第113位，所述SEQIDNo.1的第113位下游不包括SEQIDNo.1的第113位。

5.鉴别绵羊是否为常年发情绵羊的试剂盒，所述试剂盒包括上游引物和下游引物组成的引物对，其特征在于，所述引物对为权利要求2所述的引物对。

6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述试剂盒为PCR试剂盒。

7.鉴别非季节性繁殖绵羊的方法，包括如下步骤：以待鉴别绵羊的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述的引物对进行扩增，根据得到的扩增产物按照下述方法确定所述待鉴别绵羊是否为常年发情绵羊：

所述待鉴别绵羊的扩增产物在SEQIDNo.1的113位的碱基为G，所述待鉴别绵羊为常年发情绵羊或为候选常年发情绵羊；所述待鉴别绵羊的扩增产物在SEQIDNo.1的113位的碱基为C，所述待鉴别绵羊为季节性发情绵羊或为候选季节性发情绵羊。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增为PCR扩增。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增采用的引物退火温度均为60℃。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；20℃保存。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待鉴别绵羊为阿勒泰羊、中国美利奴或湖羊。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增后，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物的单链构象多态性，按照下述方法确定所述待鉴定绵羊是否为常年发情绵羊：

所述待鉴定绵羊的PCR产物在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为两条带，则所述待鉴定绵羊为杂合子，即GC型；

所述待鉴定绵羊的PCR产物在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为一条带，且该条带对应杂合子所呈现两条带中靠近加样孔的一条带的位置，则所述待鉴定绵羊为常年发情绵羊或候选常年发情绵羊，即GG型；

所述待鉴定绵羊的PCR产物在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为一条带，且该条带对应杂合子所呈现两条带中距离加样孔较远的一条带的位置，则所述待鉴定绵羊为季节性发情绵羊或候选季节性发情绵羊，即CC型。